Summary
हम एक प्रतिदीप्ति परख रिपोर्टर को जल्दी पहचान और जीन है कि माउस भ्रूणीय स्टेम सेल के रखरखाव और आत्म नवीकरण को विनियमित विशेषताएँ वर्णन है.
Abstract
Pluripotency और आत्म नवीकरण भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के दो परिभाषित विशेषताओं (ES कोशिकाओं) कर रहे हैं. अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना बहुत विकास जीव विज्ञान के अध्ययन, रोग मॉडलिंग, दवाओं की खोज, और पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 में समीक्षा के लिए ES कोशिकाओं के उपयोग की सुविधा होगी.
और ES सेल के रखरखाव और आत्म नवीकरण के उपन्यास नियामकों की पहचान और लक्षण वर्णन में तेजी लाने के लिए, हम एक प्रतिदीप्ति संवाददाता आधारित के मात्रात्मक माउस ES Oct4GiP कोशिकाओं 3 का उपयोग कोशिकाओं में आत्म नवीकरण स्थिति को मापने परख विकसित किया है. Oct4GiP कोशिकाओं Oct4 जीन प्रमोटर 4,5 क्षेत्र के नियंत्रण के तहत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करते हैं. Oct4 ES सेल आत्म नवीकरण के लिए आवश्यक है, और अत्यधिक ES कोशिकाओं में व्यक्त और 6,7 भेदभाव के दौरान जल्दी से नीचे विनियमित. एक परिणाम के रूप में, GFP और रिपोर्टर कोशिकाओं में अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति ईमानदारी से संबद्धES सेल 5 पहचान, और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ विश्लेषण करने के लिए निकट एकल कक्ष 3,8 स्तर पर कोशिकाओं आत्म नवीकरण की स्थिति पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
आरएनएआई के साथ युग्मित, Oct4GiP संवाददाता परख करने के लिए जल्दी पहचान और ES सेल के रखरखाव और 3,8 आत्म नवीकरण के नियामकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आत्म नवीकरण परख करने की क्रिया के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, यह अधिक सुविधाजनक, संवेदनशील, मात्रात्मक, और कम लागत की है. यह 96 में बाहर ले सकते हैं - या के रूप में उच्च throughput स्क्रीन या आनुवंशिक epistasis विश्लेषण के बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए प्लेट 384 अच्छी तरह से. अंत में, अन्य वंश विशेष संवाददाता ES सेल लाइनों का उपयोग करके, परख हम यहाँ वर्णन भी ES सेल भेदभाव के दौरान भाग्य विनिर्देश का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Protocol
1. Oct4GiP माउस ES सेल रखरखाव
Oct4GiP कोशिकाओं कृपया डा. ऑस्टिन स्मिथ द्वारा प्रदान की गई है. वे 129/Ola Oct4 - GFPiresPac 4,5 transgene ले चूहों से प्राप्त किए गए. वे जिलेटिन में लिपटे ऊतक संस्कृति प्लेटों में ESGRO पूर्ण प्लस clonal ग्रेड (Millipore) मध्यम, या M15 मध्यम में रखा जाता है: DMEM (Invitrogen) 15% FBS, 1000 यू / मिलीलीटर ESGRO (Millipore), 1x गैर के साथ पूरक आवश्यक अमीनो एसिड (Invitrogen), 1x (Millipore) EmbryoMax के Nucleasides, और 10 β-mercaptoethanol माइक्रोन के.
- कमरे के तापमान में 0.1% (सिग्मा) 30 मिनट के लिए (0.1 मिलीलीटर जेलाटीन समाधान / 2 सेमी) जेलाटीन के साथ कोट प्लेटों.
- प्लेट जिलेटिन में लिपटे प्लेटों में 2 ~ Oct4GiP कोशिकाओं के 10 एक्स 4/2 सेमी.
- कोशिकाओं को हर दो दिन 0.05% trypsin के साथ विभाजित.
2. Oct4GiP कक्ष में siRNA प्रोटोकॉल
Oct4GiP संवाददाता परख सबसे convenien हैया M15 मध्यम में प्लेट 384 अच्छी तरह से (Corning है या बी) - tly जिलेटिन में लिपटे फ्लैट नीचे में 96 किया. समग्र प्रक्रिया चित्रा 1 में उल्लिखित है.
- siRNA-लिपिड परिसरों विधानसभा:
- 96 अच्छी तरह से प्लेट में अभिकर्मक के लिए, यू - तल में siRNA लिपिड परिसरों 96 - अच्छी तरह प्लेटें इकट्ठा.
- प्रत्येक अच्छी तरह से, 10 μl (Invitrogen) OptiMEM के और 0.3 μl 2000 Lipofectamine (Invitrogen) मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- लिपिड OptiMEM मिश्रण करने के लिए 5 pmol siRNA को जोड़ें और एक और 15 मिनट के लिए सेते हैं. siRNA को में: 6ul: लिपिड अनुपात 100 pmol है है है.
- जिलेटिन में लिपटे फ्लैट नीचे थाली के लिए एक मल्टी चैनल विंदुक के साथ स्थानांतरण यू नीचे थाली से siRNA - लिपिड OptiMEM में परिसरों.
- 384 अच्छी तरह से प्लेट में अभिकर्मक के लिए siRNA-लिपिड परिसरों का उपयोग कर 0.1 μl 2000 Lipofectamine और 2 10 μl OptiMEM के pmol siRNA को तैयार करते हैं.
नोट: फाइनल siRNA एकाग्रता मेंtransfections 50 एनएम है. 3-4 जैविक कैर्री प्रत्येक siRNA को अभिकर्मक के लिए replicates. U नीचे और फ्लैट नीचे जिलेटिन में लिपटे थाली में थाली अशेष भाजक में siRNA लिपिड परिसरों के मालिक मिश्रण सेट.
- Oct4GiP सेल चढ़ाना और अभिकर्मक:
- 96 अच्छी तरह से प्लेट में अभिकर्मक के लिए लिए, Oct4GiP कोशिकाओं को इकट्ठा और उन्हें ताजा M15 मध्यम में 9 x 10 4 कोशिकाओं मिलीग्राम / resuspend.
- अच्छी तरह से एक विंदुक मल्टी चैनल का उपयोग कर प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें.
- पूर्व aliquoted अच्छी तरह से में siRNA-लिपिड परिसरों के साथ ऊपर pipeting और 3-5 बार सेल निलंबन मिश्रण. विभिन्न siRNA को transfections के लिए युक्तियाँ बदलें.
- 384 अच्छी तरह प्लेटें, resuspend Oct4GiP कोशिकाओं में प्रोटोकॉल के लिए 6 से 10 x 4 कोशिकाओं / मिलीलीटर और प्रत्येक अच्छी तरह से अशेष भाजक 30 μl सेल निलंबन.
नोट: इष्टतम सेल चढ़ाना घनत्व आमतौर पर 3 एक्स 5 10 कोशिकाओं / 2 सेमी है, लेकिन यह मीटरप्र siRNAs कि नाटकीय ढंग से सेल के विकास या व्यवहार्यता को प्रभावित के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता है. कम चढ़ाना घनत्व के अभिकर्मक दौरान गरीब सेल अस्तित्व के लिए नेतृत्व करेंगे. उच्च चढ़ाना घनत्व उच्च उच्च सेल संगम प्रेरित भेदभाव के कारण पृष्ठभूमि करने के लिए नेतृत्व करेंगे. यदि आवश्यक 2-4 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी के बीच परीक्षण चढ़ाना घनत्व.
- मध्यम परिवर्तन:
- पुराने माध्यम का उपयोग मल्टी चैनल (Corning) चूषित्र या निर्वात छड़ी (VP-वैज्ञानिक) के निकालें. प्लेटों के नीचे कोशिकाओं को खरोंच नहीं सावधान रहो.
- ताजा ES सेल मध्यम (96 अच्छी तरह से और 384 अच्छी तरह से थाली के लिए 30 μl प्लेट के लिए 100 μl) मल्टी चैनल विंदुक हर दिन का उपयोग के साथ कोशिकाओं फ़ीड.
3. FACS विश्लेषण
- सेल हदबंदी:
- चार दिनों के बाद अभिकर्मक, मल्टी चैनल (Corning) चूषित्र या निर्वात छड़ी (VP-वैज्ञानिक) के माध्यम का उपयोग कर हटा दें.
- 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, कोशिकाओं को एक बार कुल्ला 100μ साथएल पीबीएस.
- अच्छी तरह से एक विंदुक मल्टी चैनल का उपयोग कर प्रत्येक के लिए 25 μl 0.25% trypsin जोड़ें.
- कभी कभी आंदोलन के साथ 5minutes के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, और नेत्रहीन के लिए कक्षों की पूरी टुकड़ी को सुनिश्चित करने का निरीक्षण किया.
- 10% FBS के साथ पीबीएस की 90 μl जोड़ें trypsin निष्क्रिय करने के लिए और एक एकल कोशिका निलंबन में दोहराया pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना है.
- 384 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, 10 μl और 10% FBS के साथ 30 μl पीबीएस के साथ trypsin बुझाना के साथ कोशिकाओं को अलग.
- FACS विश्लेषण:
- बी.डी. LSRII FACS विश्लेषक - HTS इकाई या अन्य इसी तरह सुसज्जित FACS विश्लेषक (जैसे Accuri या Intellicyt) के साथ सुसज्जित पर GFP प्रतिदीप्ति विश्लेषण.
- HTS पर उच्च throughput मोड का उपयोग करें और सेल निलंबन के 10 μl विश्लेषण. 1.0 एक्स 10 4 कोशिकाओं गिनती सीमा निर्धारित करें.
- पी एम टी वोल्टेज और सीमा को समायोजित करने के लिए आगे बनाम पक्ष तितर बितर साजिश में कोशिकाओं पर कब्जा. Forw में रहते सेल की आबादी के लिए गेटअर्द बनाम पक्ष तितर बितर भूखंड.
- GFP चैनल के लिए एक हिस्टोग्राम भूखंड बनाएँ. सेट GFP चैनल में गेट ~ कोशिकाओं के 10% ताकि नकली या नियंत्रण siRNA को ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में GFP नकारात्मक होना दिखाई देते हैं.
- % विभेदित =% GFP नकारात्मक कोशिकाओं कोशिकाओं% प्रत्येक उपचार से GFP नकारात्मक कोशिकाओं का निर्धारण करते हैं. प्रयोगात्मक और नियंत्रण siRNA 2 पूंछ टी परीक्षण का उपयोग करने transfections के बीच% विभेदित कोशिकाओं की तुलना करें, और पी <0.01-मान के साथ सकारात्मक हिट स्कोर.
4. प्रतिनिधि परिणाम
Oct4, Nanog, और Sox2 तीन जीन है कि ES सेल आत्म नवीकरण 6,7,9-11 के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं चित्रा 2 से पता चलता है कि Oct4GiP संवाददाता परख आसानी से में इन कारकों का मुंह बंद करने के कारण भेदभाव का पता लगाने कर सकते हैं Oct4GiP ES कोशिकाओं.
चित्रा 2A पता चलता है Oct4GiP ES कोशिकाओं GFP सकारात्मक रहे हैं जब ते के रूप में बनाए रखा चित्रा. 2B कोशिकाओं आगे बनाम ओर तितर बितर भूखंड और Oct4GiP नियंत्रण या Oct4-siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की GFP चैनल के हिस्टोग्राम से पता चलता है. यह आगे बनाम ओर तितर बितर साजिश में जीवित कोशिकाओं के लिए गेट के लिए आवश्यक है, के रूप में मृत कोशिकाओं और मलबे GFP नकारात्मक हैं और पृष्ठभूमि में वृद्धि होगी. दूसरी ओर, भेदभाव नक़ल करने के लिए संभव सेल clumps के बाहर हमेशा की जरूरत नहीं है. नियंत्रण siRNA को ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में, कोशिकाओं की विशाल बहुमत GFP सकारात्मक होना चाहिए. यदि स्पष्ट GFP नकारात्मक आबादी को नियंत्रण siRNA को ट्रांसफ़ेक्ट कुओं में मौजूद हैं, Oct4GiP कोशिकाओं या अभिकर्मक प्रक्रिया शुरू और किया गया है समझौता हो सकता है परिणाम व्याख्या नहीं हो सकता है.
चित्रा 2C% (% विभेदित =% GFP नकारात्मक कोशिकाओं कोशिकाओं) से विभेदित कोशिकाओं की बार ग्राफ दिखाता नियंत्रण, Oct4, Nanog, और Sox2 siRNA को ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं.
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आकृति 1. Oct4GiP संवाददाता परख की रूपरेखा.
चित्रा 2. Oct4GiP संवाददाता परख ES सेल Nanog, Oct4, Sox2 या मुंह बंद करने के कारण भेदभाव का पता लगा सकते हैं. ए) E14Tg2a (जंगली प्रकार, काला लाइन) और Oct4GiP कोशिकाओं (ग्रीन लाइन) FACS द्वारा विश्लेषण किया गया. GFP चैनल के हिस्टोग्राम से पता चलता है कि Oct4GiP कोशिकाओं GFP सकारात्मक रहे हैं बी) में 96 अच्छी तरह प्लेटें Oct4GiP कोशिकाओं नियंत्रण या Oct4 - siRNA को ट्रांसफ़ेक्ट गया और FACS अभिकर्मक के बाद 4 दिन का विश्लेषण किया. है. आगे ओर बिखराव ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं GFP चैनल के भूखंडों और histograms बनाम दिखाया गया है. सी) Oct4GiP कोशिकाओं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया नियंत्रण, Nanog, Oct4, या Sox2 siRNA को. % विभेदित कोशिकाओं% GFP नकारात्मक अभिकर्मक के बाद 4 दिन कोशिकाओं से निर्धारित किया गया था, और साजिश रची किया गया था + / - मतलब की मानक त्रुटि (n = 4) का मतलब.f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank" बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
Oct4GiP संवाददाता परख हम ऊपर वर्णन मात्रात्मक आत्म नवीकरण बनाम भेदभाव की हद उपाय कर सकते हैं. आकृति विज्ञान के आधार पर 12 और प्रसार / व्यवहार्यता - आधारित assays के रूप में अन्य उपलब्ध तरीकों की तुलना में, यह उच्च संवेदनशीलता और throughput, के रूप में अच्छी तरह से ES सेल राज्य के एक और अधिक प्रत्यक्ष माप उपलब्ध कराता है. इसलिए यह अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर स्क्रीन और आनुवंशिक epistasis विश्लेषण के लिए उपयुक्त है. वास्तव में, और हम दूसरों सफलतापूर्वक जीनोम चौड़ा आरएनएआई 3,8 स्क्रीन के लिए Oct4GiP संवाददाता परख इस्तेमाल किया. सभी assays के तरह, तथापि, यह भी सीमाएँ हैं. यह केवल कि प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से Oct4 प्रमोटर गतिविधि को विनियमित करने के लिए जीन का अध्ययन करने के लिए, और यह झूठा जीन की पहचान हो सकती कि अभिव्यक्ति GFP, स्थिरता, या समारोह के बाद transcriptionally को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, अतिरिक्त assays के या alkaline फॉस्फेट 13 धुंधला (Millipore, SCR004) के और immunofluorescence धुंधला हो जाना या मात्रात्मक आरटी के रूप में माध्यमिक स्क्रीन,Pluripotency मार्करों के पीसीआर 3,8,12,14 करने के लिए इस विधि से प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं.
Oct4GiP संवाददाता परख कुशल जीन मुंह बंद करने पर निर्भर करता है. प्रभावी siRNAs के और कुशल siRNA को transfections के के परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. हालांकि हम केवल में siRNA transfections साथ संवाददाता परख का उपयोग का वर्णन, परख भी डीएनए transfections के साथ मौन या ब्याज की overexpress जीन के लिए कर सकते हैं प्रदर्शन किया जाना है. डीएनए अभिकर्मक दक्षता siRNAs की तुलना में आमतौर पर कम है और phenotype की ताकत को कम कर सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था इसके अलावा, Oct4GiP संवाददाता परख पहचान और निस्र्पक जीन है कि नकारात्मक आत्म नवीकरण के रूप में अच्छी तरह से विनियमित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. उस मामले में, कोशिकाओं siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है और भेदभाव की स्थिति में सभ्य. आत्म नवीकरण की नकारात्मक नियामकों का मुंह बंद करने के लिए आत्म नवीकरण बढ़ाने और GFP अभिव्यक्ति, जो घ हो सकता है बनाए रखा जाएगाइसी तरह के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित FACS द्वारा etected.
Oct4GiP संवाददाता कोशिकाओं के अलावा, अन्य संवाददाता सेल लाइनों, ES सेल ऐसे 15-18 Nanog GFP (Millipore, SCR089) के और 19 Rex1 - GFP कोशिकाओं के रूप में विशिष्ट प्रमोटरों, का उपयोग भी उत्पन्न किया गया है. उन्होंने यह भी ES सेल आत्म नवीकरण और रखरखाव एक ही रणनीति का उपयोग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, क्योंकि वहाँ इन ES सेल मार्कर जीन प्रमोटरों की गतिविधि और विशिष्टता में उल्लेखनीय अंतर है, इन संवाददाता सेल लाइनों पृष्ठभूमि स्तर और संवेदनशीलता के मामले में अलग ढंग से व्यवहार करते हैं और इस प्रकार एक दूसरे के पूरक जाएगा. अंत में, अन्य वंश विशेष संवाददाता ES सेल लाइनों का उपयोग करके, हमारी रणनीति ES कोशिकाओं के भाग्य का विनिर्देश अध्ययन के लिए और स्तनधारी जल्दी विकास के लिए इन विट्रो मॉडल में एक के रूप में ES सेल के उपयोग की सुविधा के लिए संशोधित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम पढ़ने और पांडुलिपि संपादन ब्रैड Lackford के लिए धन्यवाद. इस शोध पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान, स्वास्थ्य अंदर का अनुसंधान कार्यक्रम Z01ES102745 के राष्ट्रीय संस्थान (GH) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
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