Summary
نحن وصفا لفحص مراسل مضان على التعرف بسرعة وتوصيف الجينات التي تنظم الماوس الخلايا الجذعية الجنينية وصيانة وتجديد النفس.
Abstract
تعدد القدرات الذاتية والتجديد هما الخصائص المميزة للخلايا الجذعية الجنينية (خلايا ES). وفهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء يسهل إلى حد كبير على استخدام خلايا ES لدراسات البيولوجيا التطورية، والنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات، والتجدد الطب (استعرضت في 1،2).
إلى الإسراع في تحديد وتوصيف المنظمين رواية من خلية وفاق وصيانة النفس التجديد، قمنا بتطوير مضان مراسل القائم على فحص لقياس كمي لوضع الذات في تجديد خلايا ES فأر باستخدام خلايا Oct4GiP 3. الخلايا Oct4GiP تعبر عن ببروتين أخضر (GFP) في إطار السيطرة على المنطقة الجين المروج Oct4 4،5. مطلوب Oct4 لخلية ES الذاتي تجديد، ويعبر عنه بشكل كبير في الخلايا وفاق وسرعان ما انهارت التنظيم خلال التمايز 6،7. ونتيجة لذلك، GFP التعبير ومضان في الخلايا مراسل يرتبط بأمانةمع وفاق هوية الخلية 5، ومضان تنشيط الخلايا ويمكن فرز (FACS) يمكن استخدام التحليل أن تراقب عن كثب الوضع الذاتي تجديد الخلايا على مستوى خلية واحدة 3،8.
مقرونا رني، يمكن استخدام الفحص مراسل Oct4GiP إلى التعرف بسرعة ودراسة المنظمين من صيانة الخلية وفاق والذاتي تجديد 3،8. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لمعايرة الذاتي تجديد، وهو أكثر ملاءمة، الحساسة، والكمية، وأقل تكلفة. ويمكن القيام بها في 96 - أو 384 كذلك لوحات لدراسات واسعة النطاق مثل شاشات عالية الإنتاجية أو وراثية تحليل قشوة. أخيرا، وذلك باستخدام خطوط أخرى ES مراسل خلية نسب محددة، ويمكن أيضا للفحص وصفنا هنا يمكن تعديلها لدراسة مواصفات مصير خلال تمايز الخلايا ES.
Protocol
1. Oct4GiP خلية ES الفأر الصيانة
تفضلت الخلايا Oct4GiP الدكتور أوستن سميث. كانت مشتقة من الفئران 129/Ola يحمل التحوير Oct4-GFPiresPac 4،5. يتم الاحتفاظ بها في الجيلاتين المغلفة لوحات زراعة الأنسجة في المتوسط ESGRO درجة كاملة زائد نسيلي (ميليبور)، أو في المدى المتوسط M15: DMEM (إينفيتروجن) تستكمل مع FBS 15٪، 1000 يو / مل ESGRO (ميليبور)، 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية (إينفيتروجن)، 1X EmbryoMax Nucleasides (ميليبور)، و 10 ميكرومتر β-المركابتويثانول.
- لوحات معطف مع الجيلاتين 0.1٪ (سيغما) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (0.1 مل الجيلاتين حل / سم 2).
- خلايا Oct4GiP صفيحة الجيلاتين في مغلف بالمطاط في لوحات ~ 2 × 10 4 / سم 2.
- انقسام الخلايا كل يومين مع التربسين 0.05٪.
2. ترنسفكأيشن سيرنا في خلايا Oct4GiP
الفحص مراسل Oct4GiP هو الأكثر ملاءمةنفذت tly في الجيلاتين المغلفة مسطحة القاع 96 - 384 أو جيدا لوحات (كورنينج أو دينار بحريني) في المتوسط M15. ويرد الإجراء شامل في الشكل 1.
- سيرنا، دهن المجمعات الجمعية العمومية:
- لترنسفكأيشن في 96-جيدا لوحات، وتجمع الدهون المجمعات سيرنا، في U-96-أسفل جيدا لوحات.
- في كل بئر، خلط 10 OptiMEM ميكروليتر (إينفيتروجن) و 0.3 Lipofectamine ميكرولتر 2000 (إينفيتروجن)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 5 سيرنا بمول إلى خليط للدهون، OptiMEM واحتضان لمدة 15 دقيقة. وسيرنا: نسبة الدهون هو 100 بمول: 6ul.
- نقل المجمعات سيرنا-الدهون في OptiMEM من لوحة U-أسفل لوحة مسطحة القاع الجيلاتين المغلفة مع ماصة متعدد القنوات.
- لترنسفكأيشن في 384 جيدا لوحات، وإعداد المجمعات سيرنا-الدهون باستخدام 0.1 ميكرو لتر Lipofectamine 2000 و 2 بمول سيرنا في 10 OptiMEM ميكرولتر.
ملاحظة: إن تركيز سيرنا في النهائيوtransfections هو 50 نانومتر. تنفيذ البيولوجية 3-4 مكررات لكل ترنسفكأيشن سيرنا. إعداد الخلائط ماجستير في المجمعات سيرنا-الدهون في لوحة تحت القاع وقسامة في لوحة الجيلاتين المغلفة مسطحة القاع.
- Oct4GiP طلي الخلية وترنسفكأيشن:
- لترنسفكأيشن في 96-جيدا لوحات، وجمع الخلايا Oct4GiP وresuspend منهم في المتوسط M15 جديدة ل9 × 10 4 خلية / مل.
- أضف 100 ميكرولتر من التعليق على كل خلية جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات.
- خلط تعليق خلية مع المجمعات سيرنا، الدهون قبل aliquoted في البئر بواسطة pipeting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. نصائح لتغيير transfections سيرنا مختلفة.
- لترنسفكأيشن في لوحات 384 بشكل جيد، وخلايا Oct4GiP resuspend إلى 6 × 4 10 خلية / مل وقسامة 30 تعليق خلية ميكروليتر إلى كل بئر.
ملاحظة: تصفيح الخلية الأمثل كثافة عادة ما يكون 3 × 10 5 خلية / سم 2، ولكن مAY تتطلب مزيدا من التحسين siRNAs أن تؤثر بشكل كبير في نمو الخلايا أو قدرتها على البقاء. ومنخفض الكثافة الطلاء يؤدي إلى بقاء الخلية الفقراء خلال ترنسفكأيشن. وارتفاع كثافة الطلاء يؤدي إلى خلفية عالية نظرا لارتفاع خلية التمايز بفعل التقاء. إذا كان ذلك ضروريا تصفيح اختبار، والكثافة بين 2-4 خلايا س 5 10 / سم 2.
- متوسط التغير:
- إزالة المتوسطة القديمة باستخدام متعدد القنوات الشافطة (كورنينج) أو فراغ عصا (VP-العلمي). يجب الحرص على عدم خدش الخلايا في الجزء السفلي من لوحات.
- تغذية الخلايا مع الطازجة وفاق متوسط خلية (100 ميكروليتر لوحة 96-جيدا وميكرولتر 30 ل384 لوحة جيد) باستخدام متعدد القنوات ماصة كل يوم.
3. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية
- خلية تفكك:
- بعد أربعة أيام من ترنسفكأيشن، وإزالة المتوسطة باستخدام متعدد القنوات الشافطة (كورنينج) أو فراغ عصا (VP-العلمي).
- ل96-جيدا لوحات، وشطف الخلايا مرة واحدة مع 100μل PBS.
- إضافة 25 ميكرولتر التربسين 0.25٪ على كل جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة ل5minutes مع الإثارة في بعض الأحيان، وفحص البصر لضمان حياد تام للخلايا.
- إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع FBS 10٪ لإبطال نشاط التربسين وفصل الخلايا في تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting المتكررة.
- ل384 جيد لوحات، وتنأى الخلايا مع 10 ميكرولتر التربسين وإخماد مع 30 PBS ميكرولتر مع FBS 10٪.
- تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية:
- تحليل مضان GFP على محلل دينار بحريني FACS LSRII مجهزة وحدة HTS أو غيرها من محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية مجهزة على نحو مماثل (مثل Accuri أو Intellicyt).
- استخدام وضع الإنتاجية العالية على HTS وتحليل 10 ميكرولتر من التعليق الخلية. تعيين العتبة عدد الخلايا إلى 1.0 X 4 10.
- ضبط الجهد PMT وعتبة للقبض على خلايا في المؤامرة إلى الأمام في مقابل الجانب مبعثر. بوابة للسكان الخلية الحية في forwارض مقابل الجانبية مبعثر مؤامرة.
- خلق مؤامرة الرسم البياني للقناة GFP. تعيين البوابة في قناة GFP بحيث ~ 10٪ من الخلايا على ما يبدو GFP سلبية في الخلايا transfected وهمية أو سيطرة سيرنا.
- تحديد٪ GFP سلبية الخلايا من كل معاملة: الخلايا المتمايزة٪ =٪ GFP سلبية الخلايا. مقارنة بين الخلايا٪ فرق بين التجريبية وtransfections ضبط سيرنا باستخدام 2 الذيل اختبار t، ويسجل مشاهدات ايجابية مع القيم ف <0.01.
4. ممثل النتائج
Oct4، نانوغ (NANOG) وSox2 ثلاثة الجينات التي تلعب دورا حاسما في الحفاظ على خلايا ES الذاتي تجديد 6،7،9-11. الشكل 2 يبين أن مقايسة مراسل Oct4GiP يمكن الكشف بسهولة التفريق بسبب إسكات هذه العوامل في Oct4GiP خلايا ES.
رقم 2A يبين خلايا ES Oct4GiP GFP هي إيجابية عندما حافظت على وفاق الخلايا. الشكل 2B يبين مؤامرة مبعثر إلى الأمام في مقابل الجانب والرسم البياني للقناة GFP من الخلايا Oct4GiP transfected مع ضبط أو Oct4 siRNAs. فمن الضروري بوابة للخلايا الحية في مؤامرة مبعثر إلى الأمام في مقابل الجانب، حيث أن الخلايا الميتة والبقايا هي GFP سلبية وستزيد من الخلفية. لا من ناحية أخرى، صدرة ضيقة التمييز لاستبعاد كتل الخلية ممكن حاجة دائما. في الخلايا ضبط سيرنا transfected، ينبغي أن الغالبية العظمى من الخلايا تكون GFP إيجابية. إذا واضح GFP سلبية السكان موجودة في آبار ضبط سيرنا transfected، قد يكون تم الخلايا Oct4GiP بدء أو إجراء ترنسفكأيشن للخطر والنتيجة قد لا تكون للتفسير.
الشكل 2C يظهر في الرسم البياني شريط من الخلايا المتمايزة٪ (الخلايا المتمايزة٪ =٪ GFP سلبية خلايا) من التحكم، Oct4، Nanog، وSox2 سيرنا خلايا transfected.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
الشكل 1. الخطوط العريضة للOct4GiP مقايسة مراسل.
الشكل 2. يمكن Oct4GiP فحص كشف مراسل ES تمايز الخلايا التي تسببها نانوغ (NANOG) Oct4، أو إسكات Sox2. أ) تم تحليل E14Tg2a (من النوع البري، خط أسود) والخلايا Oct4GiP (الخط الأخضر) من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. رسم بياني للقناة GFP يدل على أن الخلايا Oct4GiP هي GFP إيجابية. ب) تم transfected الخلايا Oct4GiP في 96-جيدا لوحات مع التحكم أو Oct4 سيرنا، ونظام مراقبة الأصول الميدانية تحليلها بعد 4 ايام ترنسفكأيشن. وtransfected إلى الأمام مقابل المؤامرات مبعثر جانب ورسوم بيانية للقناة GFP من الخلايا transfected ترد. C) الخلايا Oct4GiP مع التحكم، Nanog، Oct4، أو Sox2-سيرنا. تم تحديد الخلايا المتمايزة٪ من٪ GFP سلبية الخلايا بعد 4 ايام ترنسفكأيشن، وتآمر كما يعني + / - الخطأ المعياري للمتوسط (ن = 4).و = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" الهدف = "_blank"> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا يمكن للمقايسة مراسل Oct4GiP وصفنا أعلاه قياس كميا مدى التجديد الذاتي مقابل التمايز. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المتاحة، مثل ال 12 مورفولوجيا القاعدة والانتشار / البقاء القائم على المقايسات، فإنه يوفر أعلى حساسية والإنتاجية، فضلا عن قياس أكثر مباشرة للدولة وفاق الخلية. ولذلك يجعلها مناسبة جدا لنطاق واسع الشاشات وراثية تحليل قشوة. في الواقع، لقد كنا وغيرها بنجاح فحص مراسل Oct4GiP لشاشات رني الجينوم على نطاق 3،8. مثل جميع المقايسات، ومع ذلك، كما أن لديها قيود. انها لا يمكن ان تستخدم لدراسة الجينات التي تنظم مباشرة أو غير مباشرة Oct4 نشاط المروج، وأنها قد تحدد زورا الجينات التي تؤثر في التعبير GFP، والاستقرار، أو وظيفة في مرحلة ما بعد transcriptionally. ولذلك، فحوصات إضافية أو الشاشات الثانوية، مثل تلطيخ الفوسفاتيز القلوية 13 (ميليبور، SCR004) وتلطيخ المناعي أو RT كمي-PCR من علامات تعدد القدرات 3،8،12،14 مطلوبة لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة.
الفحص مراسل Oct4GiP تعتمد على إسكات الجينات كفاءة. siRNAs فعالية وكفاءة transfections سيرنا هي مفتاح النجاح للفحص. على الرغم من أننا صفها فقط استخدام مقايسة مع مراسل transfections سيرنا، يمكن أيضا أن يتم تنفيذ فحص الحمض النووي مع transfections إلى الصمت أو الجينات overexpress من الفائدة. الحمض النووي كفاءة ترنسفكأيشن عادة ما يكون أقل من ذلك من siRNAs ويمكن أن يقلل من قوة النمط الظاهري.
وبالاضافة الى ما تم وصفها في هذا البروتوكول، يمكن تعديل الفحص مراسل Oct4GiP لتحديد وتوصيف الجينات التي تنظم سلبا الذاتي تجديد كذلك. في هذه الحالة، يمكن transfected الخلايا مع siRNAs وتربيتها في ظروف التمايز. وإسكات من المنظمين السلبية للتجديد الذاتي تعزيز الذاتي تجديد والحفاظ على GFP التعبير، والتي يمكن أن تكون دetected بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية وبالمثل كما هو موضح في البروتوكول الحالي.
وإلى جانب خلايا مراسل Oct4GiP، كما تم الأخرى خطوط الخلايا مراسل المروجين باستخدام خلية وفاق محددة، مثل Nanog-GFP 15-18 (ميليبور، SCR089) وRex1-GFP الخلايا ال 19، ولدت. كما يمكن استخدامها لدراسة الخلية وفاق الذاتي التجديد والصيانة باستخدام نفس الاستراتيجية. ومع ذلك، لأن هناك فرق ملحوظ في النشاط وخصوصية هذه ES المروجين الخلية الجينات علامة، وهذه خطوط الخلايا مراسل تتصرف بشكل مختلف من حيث الخلفية ومستوى الحساسية وبالتالي سوف تكمل بعضها البعض. أخيرا، وذلك باستخدام خطوط أخرى ES مراسل خلية نسب محددة، يمكن تعديل استراتيجيتنا لدراسة مصير غير المطابقة للمواصفات من الخلايا وفاق وتسهيل استخدام الخلايا ES باعتبارها نموذجا في المختبر من أجل التنمية في وقت مبكر من الثدييات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر براد Lackford لقراءة وتحرير مخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، المعاهد الوطنية للصحة برنامج بحوث ضمن الجدران Z01ES102745 (إلى GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
