Summary
我们描述记者荧光法快速识别和表征基因调控小鼠胚胎干细胞维持和自我更新。
Abstract
两个定义特征的胚胎干细胞（ES细胞）的全能性和自我更新。了解潜在的分子机制，将大大方便使用胚胎干细胞的发育生物学研究，疾病模型，药物发现和再生医学（1,2审查）。
为了加快胚胎干细胞的维持和自我更新的小说监管的识别和表征，我们开发了一种基于荧光记者分析定量测量使用Oct4GiP细胞3在小鼠胚胎干细胞的自我更新的状态。 Oct4基因启动子区域4,5的控制下，Oct4GiP细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。 Oct4的需要为ES细胞的自我更新，高度在ES细胞中表达，并迅速下调在分化6,7。因此，GFP的表达和记者的细胞荧光相关忠实与胚胎干细胞的身份5，荧光激活细胞分选仪（FACS）分析可以用来密切注视3,8在单细胞水平细胞的自我更新的状态。
用RNAi耦合，Oct4GiP的记者法可用于快速识别和研究的胚胎干细胞维持和自我更新3,8监管。化验自我更新的其他方法相比，它更方便，灵敏，定量，成本更低。它可进行96 - 或384孔板为大规模的研究，如高通量筛选或遗传上位性分析。最后，通过使用其他血统的特定记者ES细胞系，我们在这里描述的检测，还可以进行修改，研究胚胎干细胞分化过程中的命运规范。
Protocol
1。 Oct4GiP小鼠胚胎干细胞维持
请提供由奥斯汀·史密斯博士Oct4GiP细胞。他们来自129/Ola携带Oct4的4,5转基因GFPiresPac小鼠。他们均保持在明胶涂层的组织培养皿中的ESGRO完整加克隆的高档中型（Millipore公司），或在的M15培养基：DMEM培养基（Invitrogen公司）15％胎牛血清，1000 U / ml的ESGRO（Millipore公司），1个非补充人体必需的氨基酸（Invitrogen公司），1X EmbryoMax Nucleasides（Millipore公司），β-巯基乙醇和10μm。
- 用0.1％明胶（Sigma公司）（明胶溶液0.1毫升/厘米2）在室温下30分钟的外套板。
- 明胶涂层钢板的板Oct4GiP细胞〜2×10 4 /厘米2。
- 分裂的细胞，每两天0.05％的胰蛋白酶。
2。 Oct4GiP细胞在siRNA转染
Oct4GiP记者分析是最convenien的TLY进行了明胶涂层平底的M15培养基在96 - 或384孔板（Corning或BD）。整个过程的概述图1。
- siRNA的脂质复合物的组装：
- 在96孔板转染，组装在U型底部的siRNA脂质复合物的96孔板。
- 在每口井，混合10，微升OptiMEM（Invitrogen公司）和0.3μL脂质体2000（Invitrogen公司），并在室温下孵育5分钟。
- 加入5 pmol的siRNA的的脂质OptiMEM混合物孵育15分钟。 siRNA的脂质比例是100 pmol：6ul的。
- 明胶涂层平底板与多通道移液器在OptiMEM从U型底板的siRNA脂质复合物转移。
- 在384孔板转染，准备使用0.1μL脂质体2000年和2 pmol的siRNA 10μLOptiMEM中的siRNA脂质复合物。
注：最后的siRNA浓度转染是50纳米。开展3-4生物复制为每个转染。设立在U型底板和分装成平底明胶涂层板的siRNA脂质复合物的主混合物。
- Oct4GiP细胞接种和转染：
- 在96孔板转染，收集Oct4GiP细胞和悬浮在M15的新鲜中等9×10 4细胞/毫升。
- 加入100μL的细胞悬液，以每口井使用多通道移液器。
- 混合，分装前的siRNA脂质复合物在井pipeting和3-5倍的细胞悬液。更改为不同的siRNA转染的技巧。
- 在384孔板，重悬Oct4GiP细胞转染至6×10 4细胞/毫升，分装30μL细胞悬液，以每口井。
注：最佳细胞接种密度通常为3×10 5细胞/厘米2，但为mAY需要进一步优化，极大地影响细胞的生长或活力的siRNAs。电镀密度低，会导致在转染细胞存活率不佳。电镀密度高，将导致高的背景下，由于高细胞融合诱导分化。如果必要，测试镀层密度2-4×10 5细胞/平方厘米之间。
- 介质的变化：
- 删除旧的介质，采用多渠道吸引器（康宁）或真空棒（VP-科学）。要小心不要划伤板块底部的细胞。
- 喂新鲜的ES细胞培养基，使用多通道移液器每天96孔板和384孔板30μL（100μL）的细胞。
3。流式细胞仪分析
- 细胞分离：
- 染后四天，除去介质，采用多渠道吸引器（康宁）或真空棒（VP-科学）。
- 对于96孔板，一次冲洗细胞与100μL PBS。
- 加入25微升0.25％胰蛋白酶，每口井使用多通道移液器。
- 为偶尔搅拌5分钟，室温孵育和目视检查，以确保细胞完全脱离。
- 90 PBS液加入含10％胎牛血清灭活胰蛋白酶，分解成单个细胞悬液，重复移液的细胞。
- 384孔板，撇清与10μL胰蛋白酶和淬火与30μl的PBS含10％胎牛血清的细胞。
- 流式细胞仪分析：
- 配备的超导装置或其他类似配备流式细胞仪（如Accuri或Intellicyt），屋宇署LSRII流式细胞仪分析GFP荧光。
- 使用高温超导高通量的模式，并分析10μL细胞悬液。设置计数门槛1.0×10 4细胞。
- 调整PMT电压和阈值来捕获细胞，在前进与侧散射的情节。闸门在FORW的活细胞人口ARD与侧散点图。
- 创建一个GFP的通道直方图的阴谋。设置在GFP通道的门，使〜10％的细胞似乎是在模拟或控制的siRNA转染细胞GFP阴性。
- 确定从每个治疗％GFP阴性细胞：％=％的GFP阴性细胞分化的细胞。比较％之间的siRNA实验和控制使用双尾t检验转染分化的细胞，并取得积极的命中p值<0.01。
4。代表结果
OCT4，NANOG和SOX2基因维持ES细胞的自我更新6,7,9-11中发挥关键作用。 图2显示，Oct4GiP记者分析可以很容易地检测沉默在这些因素造成的分化Oct4GiP胚胎干细胞。
图2A显示Oct4GiP ES细胞保持胚胎时，GFP阳性 图2B细胞显示正向与侧面的散点图和GFP的控制或Oct4的-siRNA的转染细胞Oct4GiP通道的直方图。这是必要的门在前进 - 侧散点图活细胞，死细胞和碎片GFP阴性，并会增加背景。另一方面，偶极歧视，以排除可能的细胞团块并不总是需要。在控制siRNA转染细胞，细胞的绝大多数应该是GFP阳性。如果明显GFP负人口目前在控制siRNA转染井，开始Oct4GiP细胞或转染过程可能已被破坏的结果可能是无法解释的。
图2C显示条形图％分化细胞（％=％GFP阴性细胞分化的细胞）控制，OCT4，Nanog的，和Sox2 siRNA转染细胞。
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图1。纲要的Oct4GiP记者分析 。
图2。 Oct4GiP记者分析可以检测胚胎干细胞分化引起Nanog的，OCT4，SOX2沉默。一）E14Tg2a（野生型，黑线）和Oct4GiP细胞（绿线），流式细胞仪分析。 GFP的通道直方图显示，Oct4GiP细胞GFP阳性。）Oct4GiP细胞转染控制或Oct4的-siRNA的96孔板和流式细胞仪分析转染后4天。提出与绿色荧光蛋白转染细胞通道一侧的散点图和柱状图显示C）Oct4GiP细胞转染控制，NANOG，Oct4的，或SOX2的siRNA。 ％分化的细胞被确定从％的GFP阴性细胞转染后4天，并绘制了作为意味着+ / - 平均值的标准误差（N = 4）。F =“http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg”目标=“_blank”>点击这里查看大图。
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Discussion
我们上面描述的Oct4GiP记者分析，可以定量衡量的自我更新与分化程度。其他可用的方法，如12基于形态和增殖/活力检测，比较，它提供了更高的灵敏度和吞吐量，以及胚胎干细胞状态的一个更直接的测量。因此，非常适合大型屏幕和遗传上位性分析。事实上，我们和其他人已成功地用于全基因组RNAi屏幕3,8 Oct4GiP记者分析。然而，所有实验一样，它也有其局限性。它只能被用来研究的基因，直接或间接的调控Oct4的启动子活性，它可能会错误地识别影响GFP的表达，稳定，功能转录后的基因。因此，额外的检测或辅助屏幕，如碱性磷酸酶染色13（Millipore公司，SCR004）和免疫荧光染色或定量RT多能性标志物-聚合酶链反应3,8,12,14需要确认这种方法得到的结果。
Oct4GiP记者分析，依靠高效的基因沉默。有效的siRNA和siRNA的转染效率的检测成功的关键。虽然我们只描述了记者与siRNA转染法的使用，也可以进行检测的DNA转染沉默或基因过度表达的兴趣。 DNA转染效率通常是较低的siRNA，并可能降低强度的表型。
除了在本协议中所述，Oct4GiP记者分析，可以识别和表征基因负调节自我更新以及修改。在这种情况下，可以转染细胞的siRNA，并在分化条件下培养。沉默的自我更新的负调控将加强自我更新和维持GFP的表达，可以是detected同样在当前协议的流式细胞仪。
除了Oct4GiP记者的细胞，其他记者使用胚胎干细胞特异性启动子，如在Nanog的绿色荧光蛋白15-18（Millipore公司，SCR089）和Rex1-GFP 19细胞的细胞株，也已产生。它们也可以用来研究胚胎干细胞自我更新和维护，使用同样的策略。然而，这些胚胎干细胞标记基因启动子的活性和特异性，因为有明显的区别，这些记者的细胞株有不同的行为在背景水平和灵敏度方面，从而将相得益彰。最后，通过使用其他系特定记者ES细胞系，我们的战略可以修改研究的胚胎干细胞的命运，规范和促进ES细胞在体外哺乳动物早期发育模型的使用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢阅读和编辑稿件：布拉德Lackford。这项研究是由美国国家环境健康科学，健康院内研究计划Z01ES102745国家研究院（生长激素）研究所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
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