Summary
Nous décrivons un test de fluorescence journaliste d'identifier rapidement et de caractériser les gènes qui régulent la souris de maintenance de cellules souches embryonnaires et l'auto-renouvellement.
Abstract
Pluripotence et l'auto-renouvellement sont deux caractéristiques qui définissent les cellules souches embryonnaires (cellules ES). Comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent va grandement faciliter l'utilisation de cellules souches embryonnaires pour des études de biologie du développement, la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et la médecine régénératrice (examiné en 1,2).
Pour accélérer l'identification et la caractérisation de nouveaux régulateurs de l'entretien des cellules ES et d'auto-renouvellement, nous avons développé une fluorescence journaliste basé test pour mesurer quantitativement l'état d'auto-renouvellement des cellules ES de souris en utilisant les cellules Oct4GiP 3. Les cellules Oct4GiP exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de la région promoteur du gène Oct4 4,5. Oct4 est nécessaire pour les cellules souches embryonnaires d'auto-renouvellement, et est fortement exprimée dans les cellules ES et rapidement régulé à la baisse lors de la différenciation 6,7. En conséquence, expression de la GFP et de la fluorescence dans les cellules reporter fidèlement corréléeavec l'identité des cellules ES 5, et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour suivre de près l'état d'auto-renouvellement des cellules au niveau unicellulaire 3,8.
Couplé avec l'ARNi, le dosage journaliste Oct4GiP peut être utilisé pour rapidement identifier et d'étudier les régulateurs de l'entretien des cellules ES et l'auto-renouvellement 3,8. Comparé à d'autres méthodes de dosage de l'auto-renouvellement, il est plus commode, sensible, quantitative, et de moindre coût. Il peut être réalisé en 96 - ou 384 puits des plaques pour études à grande échelle tels que les écrans à haut débit ou d'analyse épistasie génétique. Enfin, en utilisant d'autres lignes spécifiques de lignée de cellules ES Reporter, le dosage que nous décrivons ici peuvent également être modifiées pour étudier les spécifications sort lors de la différenciation des cellules ES.
Protocol
1. Oct4GiP souris maintien des cellules ES
Cellules Oct4GiP ont été aimablement fournies par le Dr Austin Smith. Elles ont été calculées à partir des souris portant un transgène 129/Ola Oct4-GFPiresPac 4,5. Ils sont maintenus dans de la gélatine recouvertes de plaques de culture tissulaire dans le ESGRO qualité moyenne, plus complet clonale (Millipore), ou dans le milieu M15: DMEM (Invitrogen) supplémenté avec 15% de FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x non- acides aminés essentiels (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), et 10 uM β-mercaptoéthanol.
- Manteau plaques avec 0,1% (Sigma) de la gélatine à la température ambiante pendant 30 minutes (0,1 ml de solution de gélatine / cm 2).
- Oct4GiP cellules plaque en revêtues de gélatine à plaques ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Fractionner les cellules tous les deux jours avec de la trypsine 0,05%.
2. transfection de siRNA dans les cellules Oct4GiP
Le dosage est le plus journaliste Oct4GiP convenienTLY réalisée dans de la gélatine enduit fond plat 96 - ou 384 puits plaques (Corning ou BD) dans le milieu M15. La procédure générale est décrite dans la figure 1.
- siRNA-lipidique de montage complexes:
- Pour la transfection dans des plaques 96 puits, assembler siARN-lipidiques complexes dans U-bas plaques à 96 puits.
- Dans chaque puits, mélanger 10 pi OptiMEM (Invitrogen) et 0,3 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen) et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 5 siARN pmol au mélange lipidique OptiMEM et incuber pendant 15 minutes. L'ARNsi: lipide est de 100 pmol: 6UL.
- Transférer les complexes lipidiques dans siARN-OptiMEM de la plaque en U en bas de la gélatine à revêtement à fond plat plaque avec une pipette à canaux multiples.
- Pour la transfection dans plaques à 384 puits, préparer les complexes siARN-lipidiques en utilisant 0,1 pl Lipofectamine 2000 et 2 pmol siARN dans 10 OptiMEM ul.
Remarque: La concentration finale en siARNles transfections est de 50 nM. Effectuer biologique 3-4 répétitions pour chaque transfection de siRNA. Mettre en place des mélanges maîtres des complexes siARN-lipidiques dans la plaque de fond en U et dans la partie aliquote à fond plat de gélatine plaque revêtue.
- Placage cellule Oct4GiP et la transfection:
- Pour la transfection dans des plaques 96 puits, collecter les cellules Oct4GiP et les remettre en suspension dans un milieu frais M15 à 9 x 10 4 cellules / ml.
- Ajouter 100 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits en utilisant une pipette multi-canaux.
- Mélanger la suspension de cellules avec les pré-aliquotés ARNsi des lipides complexes dans le puits par pipetage de haut en bas 3-5 fois. Changer conseils pour transfections de siRNA différents.
- Pour la transfection dans des plaques de 384 puits, les cellules Oct4GiP Resuspendre à 6 x 10 4 cellules / ml et aliquote de 30 pl de suspension cellulaire dans chaque puits.
Note: La densité optimale des cellules de placage est généralement de 3 x 10 5 cellules / cm 2, mais il may besoin une optimisation plus poussée des siRNA qui a considérablement influer sur la croissance ou la viabilité cellulaire. Faible densité de placage mènera à la survie des cellules pauvres lors de la transfection. Haute densité de placage mènera à fond élevé en raison de la différenciation cellulaire induite par la confluence de haut. Si nécessaire, densité de placage d'essai entre 2-4 x 10 5 cellules / cm 2.
- Changement moyen:
- Retirer ancien milieu à l'aide multi-canal d'aspiration (Corning) ou sous vide baguette (VP-scientifique). Veillez à ne pas rayer les cellules au fond des assiettes.
- Nourrir les cellules avec le milieu de cellules ES frais (100 pi pour plaque de 96 puits et 30 pi pour plaque 384 puits) en utilisant une pipette multi-canaux tous les jours.
3. Analyse par FACS
- Dissociation cellulaire:
- Quatre jours après la transfection, éliminer le milieu de l'aide multi-canal d'aspiration (Corning) ou sous vide baguette (VP-scientifique).
- Pour plaques à 96 puits, rincer les cellules une fois avec 100μl PBS.
- Ajouter 25 trypsine pi 0,25% à chaque puits en utilisant une pipette à canaux multiples.
- Incuber à température ambiante pendant 5 minutes avec agitation occasionnelle, et une inspection visuelle pour s'assurer un complet détachement des cellules.
- Ajouter 90 ul de PBS avec 10% de FBS pour inactiver la trypsine et à dissocier les cellules en une seule suspension cellulaire par pipetage répété.
- Pour plaques 384 puits, dissocier les cellules avec 10 ul de trypsine et de trempe avec 30 ul de PBS avec 10% de FBS.
- Analyse FACS:
- Analyser la fluorescence de la GFP sur l'analyseur BD FACS LSRII équipée avec l'unité de HTS ou autre analyseur équipé de façon similaire FACS (comme Accuri ou Intellicyt).
- Utilisez le mode haut débit sur le HTS et d'analyser les 10 ul de la suspension cellulaire. Régler le seuil de comptage à 1,0 x 10 4 cellules.
- Régler la tension de PMT et le seuil de capturer les cellules dans l'intrigue vs côté-dispersion. Porte de la population de cellules vivantes dans le forward vs côte diagramme de dispersion.
- Créer un histogramme pour le canal GFP. Réglez la porte dans le canal de la GFP de sorte que ~ 10% des cellules semblent être la GFP-négative dans les cellules fictives ou de contrôle-siARN transfectées.
- Déterminer% GFP-négatives des cellules de chaque traitement: les cellules différenciées%% = GFP-cellules négatives. Comparer les cellules différenciées entre expérimentales% et de commande-siRNA transfections en utilisant 2-tailed test-t, et marquer les réponses positives avec des valeurs p <0,01.
4. Les résultats représentatifs
Oct4, Nanog, et Sox2 ya trois gènes qui jouent un rôle crucial dans le maintien de cellules souches embryonnaires d'auto-renouvellement 6,7,9-11. Figure 2 montre que le dosage journaliste Oct4GiP pouvons facilement détecter la différenciation provoquée par faire taire ces facteurs dans le Oct4GiP cellules ES.
La figure 2A montre les cellules ES sont Oct4GiP GFP-positives lorsqu'il est maintenu en tant que ES cellules. Figure 2B montre le diagramme de dispersion de l'avant par rapport à côté et l'histogramme du canal GFP des cellules transfectées avec Oct4GiP le contrôle ou Oct4 des siRNA. Il est nécessaire à la porte des cellules vivantes dans le nuage de points avant vs côté, comme les cellules mortes et les débris sont GFP-négatif et va augmenter de fond. D'autre part, la discrimination doublet d'exclure amas de cellules possibles n'est pas toujours nécessaire. Dans les cellules transfectées de contrôle-siRNA, la grande majorité des cellules doit être GFP-positives. Si évidentes GFP-négatifs populations sont présentes dans les puits de contrôle-siRNA transfectées, les cellules Oct4GiP de départ ou la procédure de transfection peut avoir été compromise et le résultat peut ne pas être interprétable.
La figure 2C montre l'histogramme de cellules différenciées (cellules%% =% différenciés GFP-négatifs cellules) de contrôle, Oct4-, Nanog-et-Sox2 siRNA cellules transfectées.
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Figure 1. Aperçu du test journaliste Oct4GiP.
Figure 2. Dosage journaliste Oct4GiP peut détecter la différenciation des cellules ES causée par Nanog, Oct4, ou Sox2 silence. A) E14Tg2a (de type sauvage, ligne noire) et Oct4GiP (ligne verte), les cellules ont été analysées par FACS. Histogramme de la GFP-canal montre que les cellules sont GFP-Oct4GiP positif. B) les cellules ont été transfectées dans Oct4GiP plaques à 96 puits avec le contrôle ou Oct4-siARN et FACS analysé 4 jours après la transfection. Forward vs diagrammes de dispersion secondaires et les histogrammes de la GFP-canal des cellules transfectées sont indiquées. C) des cellules ont été transfectées avec Oct4GiP le contrôle-, Nanog-, Oct4-ou-Sox2 siARN. Les cellules différenciées% a été déterminée à partir du% GFP-négative cellules 4 jours après la transfection, et a été tracée sous forme de moyenne + / - erreur-type de la moyenne (n = 4).f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.
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Discussion
Le dosage journaliste Oct4GiP nous décrivons ci-dessus peut mesurer quantitativement l'étendue de l'auto-renouvellement vs différenciation. Comparé à d'autres méthodes disponibles, tels que les 12 morphologie basée et la prolifération / viabilité à base de tests, il offre une sensibilité plus élevée et le débit, ainsi que d'une mesure plus directe de l'état de la cellule ES. Il est donc bien adapté pour les grands écrans et des analyses épistasie génétique. En effet, nous et d'autres ont utilisé avec succès le test journaliste Oct4GiP pour les écrans ARNi du génome entier de 3,8. Comme tous les tests, cependant, il a aussi ses limites. Il ne peut être utilisée pour étudier les gènes qui régulent directement ou indirectement une activité de promoteur Oct4, et il peut faussement identifier les gènes qui affectent expression de la GFP, la stabilité, ou d'une fonction de post-transcriptionnel. Par conséquent, des tests supplémentaires ou des écrans secondaires, tels que la coloration la phosphatase alcaline 13 (Millipore, SCR004) et immunofluorescence ou quantitative RT-PCR de marqueurs de pluripotence 3,8,12,14 sont nécessaires pour confirmer les résultats obtenus par cette méthode.
Le dosage journaliste Oct4GiP s'appuie sur le silençage génique efficace. SiRNA efficaces et transfections de siRNA efficaces sont la clé du succès de l'essai. Bien que nous ne décrit l'utilisation du dosage journaliste transfections de siRNA, le dosage peut également être effectué avec des transfections d'ADN ou des gènes au silence surexpriment d'intérêt. Efficacité de la transfection d'ADN est généralement inférieure à celle des siRNA et peut réduire la résistance du phénotype.
Outre ce qui a été décrite dans ce protocole, le dosage journaliste Oct4GiP peut être modifié pour identifier et caractériser les gènes qui régulent négativement l'auto-renouvellement ainsi. Dans ce cas, les cellules peuvent être transfectées avec des siRNA et cultivées dans des conditions de différenciation. Taire des régulateurs négatifs de l'auto-renouvellement permettra d'améliorer l'auto-renouvellement et de maintenir expression de la GFP, qui peut être detected par FACS même que décrites dans le protocole actuel.
Outre les cellules rapporteur Oct4GiP, d'autres lignées de cellules reporteurs utilisant des promoteurs spécifiques de cellules souches embryonnaires, comme le Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) et REX1-GFP 19 cellules, ont également été générés. Ils peuvent également être utilisées pour étudier les cellules souches embryonnaires d'auto-renouvellement et de maintenance en utilisant la même stratégie. Cependant, parce qu'il n'y a de différence notable dans l'activité et la spécificité de ces promoteurs de cellules ES de gènes marqueurs, ces lignées de cellules reporteurs se comportent différemment en termes de niveau de fond et de la sensibilité et viendra donc compléter les uns des autres. Enfin, en utilisant d'autres lignes spécifiques de lignée de cellules ES Reporter, notre stratégie peut être modifié pour étudier le sort de spécification des cellules souches embryonnaires et de faciliter l'utilisation de cellules ES comme un modèle in vitro pour le développement précoce des mammifères.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Brad Lackford pour la lecture et la relecture du manuscrit. Cette recherche a été financée par l'Institut national de l'environnement Sciences de la santé, les National Institutes of Health Research Programme intra-muros Z01ES102745 (à GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
