Summary
אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.
Abstract
Pluripotency עצמית חידוש שני המאפיינים המגדירים של תאים עובריים (תאים ES). הבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס יהיה מאוד להקל על השימוש בתאי גזע עובריים לחקר הביולוגיה ההתפתחותית, מודלים המחלה, גילוי תרופות, ו רפואה רגנרטיבית (בדיקה ב 1,2).
כדי לזרז את זיהוי ואפיון של הרגולטורים הרומן של תחזוקה ES תא עצמית והתחדשות, פיתחנו assay הקרינה הכתב מבוסס למדוד כמותית את מצב עצמי התחדשות התאים עכבר גזע עובריים תוך שימוש בתאי Oct4GiP 3. התאים Oct4GiP לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של האזור המקדם Oct4 גן 4,5. Oct4 נדרש תא ES עצמית והתחדשות, והוא הביע מאוד בתאי גזע עובריים ובמהירות למטה מוסדר במהלך התמיינות 6,7. כתוצאה מכך, ביטוי של GFP ו הקרינה בתאי הכתב וקושרת בנאמנותעם זהות ES Cell 5, הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) ניתוח יכול לשמש כדי לעקוב מקרוב אחר מצב עצמית חידוש התאים ברמת תא בודד 3,8.
יחד עם RNAi, assay כתב Oct4GiP ניתן להשתמש כדי לזהות במהירות וללמוד הרגולטורים של תחזוקה ES תא עצמית חידוש 3,8. בהשוואה לשיטות אחרות עבור assaying עצמית והתחדשות, זה יותר נוח, רגיש, כמותי, של עלות נמוכה יותר. זה יכול להתבצע 96 - או 384 צלחות היטב בקנה מידה גדול מחקרים כגון תפוקה גבוהה מסכי או ניתוח epistasis גנטית. לבסוף, באמצעות אחרים שושלת ספציפיים גזע עובריים הכתב שורות תאים, assay המתואר כאן יכול גם להיות שונה כדי ללמוד מפרט הגורל במהלך התמיינות תאים ES.
Protocol
1. Oct4GiP עכבר ES Cell תחזוקה
תאים Oct4GiP נמסרו באדיבות ד"ר אוסטין סמית. הם הופקו מתוך עכברים שנשאו 129/Ola Oct4-GFPiresPac transgene 4,5. הם שמרו על ג'לטין מצופים צלחות תרבית רקמה במדיום ESGRO מלאה בתוספת משובט ציון (Millipore), או בינוני M15: DMEM (Invitrogen) השלימו עם 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x ללא חומצות אמינו חיוניות (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), ו -10 מיקרומטר β-mercaptoethanol.
- המעיל צלחות עם 0.1% ג'לטין (Sigma) בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות (0.1 מ"ל ג'לטין פתרון / cm 2).
- Oct4GiP צלחת התאים ג'לטין מצופים צלחות ב ~ 2 x 10 4/2 ס"מ.
- פיצול התאים כל יומיים עם טריפסין 0.05%.
2. siRNA transfection בתאים Oct4GiP
Assay כתב Oct4GiP היא convenien ביותרנשאו את tly בתחתית ג'לטין מצופה שטוח 96 - או 384 צלחות היטב (Corning או BD) במדיום M15. הליך הכולל מתואר באיור 1.
- siRNA-השומנים מתחמי הרכבה:
- עבור transfection ב 96-גם צלחות, להרכיב-siRNA השומנים מתחמי ב U-96-התחתונה גם צלחות.
- בכל אחד טוב, לערבב 10 OptiMEM μl (Invitrogen) ו 0.3 Lipofectamine μl 2000 (Invitrogen) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף 5 siRNA pmol לתערובת שומנים בדם OptiMEM ו דגירה למשך 15 דקות. SiRNA: יחס שומנים בדם הוא 100 pmol: 6ul.
- להעביר את siRNA-השומנים מתחמי ב OptiMEM של צלחת U-התחתונה לצלחת שטוחה ג'לטין התחתון מצופה עם פיפטה רב ערוצי.
- עבור transfection ב 384 גם הצלחות, להכין את siRNA-השומנים באמצעות מתחמי 0.1 Lipofectamine μl 2000 ו 2 siRNA pmol ב OptiMEM 10 μl.
הערה: ריכוז siRNA האחרוןtransfections הוא 50 ננומטר. ביצוע הביולוגי 3-4 משכפל את כל transfection siRNA. הגדרת תערובות אמן של siRNA-השומנים מתחמי בצלחת U-התחתונה ו aliquot לתוך צלחת ג'לטין מצופה שטוח התחתונה.
- Oct4GiP ציפוי התא transfection:
- עבור transfection ב 96-גם צלחות, לאסוף את התאים Oct4GiP ו resuspend אותם במדיום M15 טרי 9 x 10 4 תאים / מ"ל.
- הוסף 100 μl של השעיה תא זה גם באמצעות פיפטה רב ערוצי.
- מערבבים את ההשעיה התא עם מראש aliquoted-siRNA שומנים מתחמי ב גם על ידי pipeting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. שינוי עצות transfections siRNA שונים.
- עבור transfection ב 384 צלחות היטב, תאים resuspend Oct4GiP עד 6 x 10 4 תאים / מ"ל ו - 30 aliquot תא μl ההשעיה זה היטב.
הערה: צפיפות אופטימלית ציפוי התא הוא בדרך כלל 3 x 10 ס"מ / 5 תאים 2, אבל מ 'איי דורש אופטימיזציה נוספת siRNAs כי להשפיע באופן דרמטי צמיחת תאים או יכולת הקיום. צפיפות נמוכה ציפוי תוביל הישרדות התא העניים במהלך transfection. צפיפות גבוהה ציפוי תוביל רקע גבוהה בשל בידול מפגש גבוהה הנגרמת התא. אם ציפוי הצורך, בדיקת צפיפות בין 2-4 x 10 ס"מ / 5 תאים 2.
- בינוני השינוי:
- הסר בינוני הישן באמצעות הרב ערוצית aspirator (Corning) או ואקום שרביט (VP-Scientific). יש להיזהר שלא לשרוט את התאים בחלק התחתון של הצלחות.
- להאכיל את התאים עם המדיום הסלולרי טרי ES (100 μl לצלחת 96-30 μl היטב על צלחת 384 היטב), תוך שימוש רב ערוצי פיפטה כל יום.
3. FACS ניתוח
- תא דיסוציאציה:
- ארבעה ימים לאחר transfection, הסר בינוני באמצעות הרב ערוצית aspirator (Corning) או ואקום שרביט (VP-Scientific).
- עבור 96-גם צלחות, שטפו תאים פעם אחת עם 100μאני PBS.
- הוסף 25 μl טריפסין 0.25% זה גם באמצעות פיפטה רב ערוצי.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5minutes בהתרגשות מדי פעם, וגם מבחינה ויזואלית לבדוק על מנת להבטיח ניתוק מוחלט של התאים.
- הוסף 90 μl של PBS עם FBS 10% להשבית טריפסין ו לנתק את התאים לתוך ההשעיה תא בודד על ידי pipetting חזר.
- במשך 384 גם הצלחות, לנתק את התאים עם טריפסין 10 להרוות μl עם 30 PBS μl עם FBS 10%.
- FACS ניתוח:
- לנתח את הקרינה GFP על נתח LSRII FACS BD מצויד ביחידת HTS או מנתח אחר מצויד באופן דומה FACS (כגון Accuri או Intellicyt).
- להשתמש במצב תפוקה גבוהה על HTS ולנתח 10 μl ההשעיה התא. הגדרת הסף הספירה 1.0 x 10 4 תאים.
- התאם את מתח הסף PMT כדי ללכוד תאים של העלילה קדימה מול תופעות פיזור. שער לאוכלוסייה תא חי ב forwארד נגד תופעת פיזור העלילה.
- יצירת העלילה היסטוגרמה עבור ערוץ ה-GFP. הגדר את השער בערוץ ה-GFP, כך ~ 10% של התאים נראה GFP שלילית בתאים transfected מדומים או שליטה siRNA.
- קבע ה-GFP שלילית% תאים כל טיפול: תאים% הבדיל =% תאים GFP-שלילי. השווה את התאים% הבדיל בין הניסוי-and-siRNA השליטה transfections באמצעות 2 זנב מבחן t, וציון הלהיטים חיובית עם ערכי P-<0.01.
4. נציג תוצאות
Oct4, Nanog, ו Sox2 שלושה גנים ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על התא ES עצמית חידוש 6,7,9-11. איור 2 מראה כי assay כתב Oct4GiP יכול בקלות לזהות את הבידול הנגרמת על ידי להשתיק את הגורמים הללו ב Oct4GiP גזע עובריים לתאים.
איור 2 א מראה לתאי גזע עובריים הם Oct4GiP GFP חיובי כאשר שמרו כמו ES תאים. איור -2 מציגה את העלילה קדימה לעומת פיזור לצד ההיסטוגרמה של ערוץ ה-GFP של תאים Oct4GiP transfected עם שליטה או Oct4 למוצרי siRNAs. יש לשער על תאים חיים בעלילה פיזור קדימה לעומת הצד, כמו תאים מתים ופסולת הם GFP-שלילי יגדיל את הרקע. מצד שני, כפיל אפליה להוציא גושי תאים אפשריים אין צורך תמיד. בפקד-siRNA תאים transfected, הרוב המכריע של התאים צריך להיות ה-GFP חיובי. אם ברור GFP שלילי אוכלוסיות קיימות בפקד-siRNA בארות transfected, התאים Oct4GiP החל או הליך transfection אולי נפרץ והתוצאה לא תהיה לפירוש.
איור 2 ג מראה גרף עמודות של תאים% הבדיל (תאים% הבדיל = GFP שלילי תאים%) של שליטה, Oct4-, Nanog למוצרי ו Sox2-siRNA תאים transfected.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
באיור 1. תמציתי של assay כתב Oct4GiP.
איור 2. Assay Oct4GiP הכתב יכול לזהות תאים ES בידול הנגרמת על ידי Nanog, Oct4 או Sox2 ההשתקה. א) E14Tg2a (wild-type, קו שחור) ו Oct4GiP (קו ירוק) תאים נותחו על ידי FACS. היסטוגרמה של הערוץ-GFP מראה כי תאים Oct4GiP הם GFP חיובי. ב ') היו תאים Oct4GiP transfected ב 96-גם צלחות עם שליטה או Oct4-siRNA ו FACS ניתח 4 ימים לאחר transfection. קדימה לעומת פיזור מגרשים לוואי היסטוגרמות של ערוץ ה-GFP של תאים transfected מוצגים. C) תאים Oct4GiP היו transfected עם Control-, Nanog-, Oct4, או Sox2-siRNA. התאים% הבדיל נקבע מ% GFP שלילי תאים 4 ימים לאחר transfection, והיה זממו כמו ממוצע + / - טעות התקן של הממוצע (n = 4).f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay כתב Oct4GiP אנו מתארים לעיל ניתן למדוד כמותית את מידת ההתחדשות העצמית לעומת בידול. לעומת משיטות אחרות, כגון 12 מורפולוגיה מבוסס ושגשוגם / מבחני כדאיות מבוסס, הוא מציע רגישות גבוהה ותפוקה, כמו גם מדידה ישירה יותר של המדינה תא ES. לכן זה גם מתאים בקנה מידה גדול מסכי וניתוח epistasis גנטית. אכן, ואחרים השתמשו בהצלחה assay כתב Oct4GiP של הגנום כולו מסכי RNAi 3,8. כמו מבחני בכל זאת, יש לה גם מגבלות. זה רק יכול לשמש כדי לחקור את הגנים המווסתים במישרין או בעקיפין Oct4 פעילות היזם, והוא עשוי לזהות שקר גנים המשפיעים על ביטוי ה-GFP, יציבות, או פונקציה שלאחר תעתיק. לכן, מבחני נוספות או מסכים משניים, כגון צביעה phosphatase אלקליין 13 (Millipore, SCR004) ו מכתים immunofluorescence או כמותי RT-PCR של סמנים pluripotency 3,8,12,14 נדרשים לאשר את התוצאות שהתקבלו בשיטה זו.
Assay כתב Oct4GiP מסתמך על השתקת הגן יעיל. SiRNAs יעילים transfections siRNA יעילים הם המפתח להצלחה של assay. למרות שאנו רק תיאר השימוש assay כתב עם transfections siRNA, assay יכולה גם להתבצע עם transfections דנ"א לשתיקה או גנים overexpress של עניין. Transfection יעילות ה-DNA הוא בדרך כלל נמוך מזה של siRNAs ולקצר את כוחו של פנוטיפ.
חוץ מזה מה שתואר בפרוטוקול זה, assay כתב Oct4GiP ניתן לשנות לזיהוי ואפיון גנים המווסתים שלילית עצמית והתחדשות גם כן. במקרה זה, התאים ניתן transfected עם siRNAs ותרבותיים בתנאים בידול. השתקת של הרגולטורים השליליות של התחדשות עצמית תגביר את עצמי חידוש ולקיים ביטוי ה-GFP, אשר יכול להיות דetected ידי FACS דומה כמתואר בפרוטוקול הנוכחי.
מלבד תאים הכתב Oct4GiP, אחרים תא הכתבים קווי באמצעות תא גזע עובריים יזמים ספציפיים, כגון Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) ו-GFP Rex1 19 תאים, יש גם שנוצר. הם יכולים גם לשמש כדי לחקור תא ES עצמית חידוש ותחזוקה באמצעות אותה אסטרטגיה. עם זאת, כי יש הבדל בולט בפעילות וספציפיות של תא גזע עובריים אלו מקדמי סמן גנטי, אלה שורות תאים הכתב מתנהגים באופן שונה מבחינת רמת רקע רגישות ויהיה ובכך משלימים זה את זה. לבסוף, באמצעות אחרים שושלת ספציפיים גזע עובריים הכתב שורות תאים, האסטרטגיה שלנו ניתן לשנות ללמוד הגורל, המפרט של תאים ES ו להקל על השימוש בתא ES כמו במודל חוץ גופית לפיתוח מוקדם היונקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים בראד Lackford לקריאה ועריכה של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, המכונים הלאומיים לבריאות תוכנית המחקר המיפוי Z01ES102745 (ל GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
