Summary
Мы описываем флуоресценции анализа репортер быстро идентифицировать и охарактеризовать гены, которые регулируют содержание мышиных эмбриональных стволовых клеток и самообновлению.
Abstract
Плюрипотентности и самообновления две определяющие характеристики эмбриональных стволовых клеток (ES клетки). Понимание основных молекулярных механизмов значительно облегчит использование ЭС клеток для развития исследований биологии, болезнь моделирования лекарств и регенеративной медицины (обзор в 1,2).
Чтобы ускорить выявление и характеристика новых регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления, мы разработали флуоресценции репортера на основе анализа количественно измерить самообновлению статус в ЭС клетки мыши использованием Oct4GiP клеток 3. Oct4GiP клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем Oct4 области промотора гена 4,5. Oct4 требуется для ES клетки самообновлению, и очень выраженная в ЭС клетки и быстро подавляется в процессе дифференцировки 6,7. В результате, GFP выражения и флуоресценции в клетках коррелирует репортер вернос единичной клетки ES 5 и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) анализ может быть использован внимательно следить за самообновление состояния клетки на одном уровне ячейки 3,8.
В сочетании с РНК-интерференции, анализ Oct4GiP репортер может быть использована для быстрого выявления и изучения регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления 3,8. По сравнению с другими методами опробования самообновлению, удобнее, чувствительный, количественный, а также более низкую стоимость. Это может быть осуществлено в 96 - или 384-луночных планшетах для крупномасштабных исследований, таких как высокая пропускная способность экранов или генетического анализа эпистаза. Наконец, с помощью другой линии конкретных репортер линий ES клетки, анализ описанных здесь также может быть изменен, чтобы исследовать судьбу спецификации в процессе дифференцировки клетки ES.
Protocol
1. Oct4GiP мыши ES сотового обслуживания
Oct4GiP клетки были любезно предоставлены д-р Остин Смит. Они были получены от мышей 129/Ola проведение Oct4-GFPiresPac трансгенов 4,5. Они ведутся в желатин покрытием пластин культуры тканей в ESGRO полный плюс клонального класса средней (Millipore), или M15 среда: DMEM (Invitrogen) с добавлением 15% FBS, 1000 ед / мл ESGRO (Millipore), 1x Non- незаменимых аминокислот (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), и 10 мкМ β-меркаптоэтанола.
- Пальто пластин с 0,1% желатина (Sigma) при комнатной температуре в течение 30 минут (0,1 мл раствора желатина / см 2).
- Пластина Oct4GiP клеток в желатин покрытием пластин в ~ 2 х 10 4 / см 2.
- Разделите клетки каждые два дня с 0,05% трипсина.
2. миРНК трансфекции в клетки Oct4GiP
Анализ Oct4GiP репортер наиболее convenienTLY осуществляется в желатин-покрытых плоским дном, 96 - или 384-луночных планшетах (Corning или BD) в среде M15. В целом процедура описана на рисунке 1.
- миРНК-липидных комплексов сборки:
- Для трансфекции в 96-луночных планшетах, собрать миРНК-липидных комплексов в U-дно 96-луночных планшетах.
- В каждую лунку, смешать 10 мкл OptiMEM (Invitrogen) и 0,3 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen) и выдержите при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить 5 пмоль миРНК в липидов OptiMEM смеси и инкубировать в течение еще 15 минут. МиРНК: липидный соотношение составляет 100 пмоль: 6ul.
- Передача миРНК-липидных комплексов в OptiMEM из U-нижней пластины желатина покрытые плоским дном тарелку с многоканальной пипеткой.
- Для трансфекции в 384-луночных планшетов, подготовки миРНК-липидных комплексов с использованием 0,1 мкл липофектамина 2000 года и 2 пмоль миРНК в 10 мкл OptiMEM.
Примечание: конечная концентрация миРНК втрансфекции составляет 50 нм. Провести 3-4 биологической репликации для каждого миРНК трансфекции. Настройка мастера смесей миРНК-липидных комплексов в U-нижняя плита и аликвоту в плоскодонных желатин покрытием пластины.
- Oct4GiP покрытие клеток и трансфекция:
- Для трансфекции в 96-луночных планшетах, собирать Oct4GiP клеток и их ресуспендируют в свежей среде М15 до 9 х 10 4 клеток / мл.
- Добавить 100 мкл суспензии клеток в каждую лунку помощью многоканальной пипетки.
- Смешать суспензии клеток с предварительно аликвоты миРНК липидов комплексы в хорошо пипетировать вверх и вниз 3-5 раз. Изменение подсказки для различных трансфекции миРНК.
- Для трансфекции в 384-луночный, клетки ресуспендируют Oct4GiP до 6 х 10 4 клеток / мл и аликвоты 30 мкл суспензии клеток в каждую лунку.
Примечание: оптимальной плотности покрытия ячейки, как правило, 3 х 10 5 клеток / см 2, но май требуют дальнейшей оптимизации siRNAs, что значительно влияет на рост клеток и жизнеспособность. Низкая плотность покрытия будет приводить к ухудшению выживаемости клеток при трансфекции. Высокая плотность покрытия приведет к высоким фоном из-за высокой клетки слияния индуцированной дифференциации. Если необходимо, тест покрытие плотностью от 2-4 х 10 5 клеток / см 2.
- Среднее изменение:
- Удалить старые среде с использованием многоканального аспиратор (Corning) или вакуум палочка (VP-научного). Будьте осторожны, чтобы не поцарапать клетки в нижней части плиты.
- Поток клеток свежей средой клетки ES (100 мкл на 96-луночного планшета и 30 мкл для 384-луночного планшета) с помощью многоканальной пипетки каждый день.
3. FACS анализ
- Сотовые диссоциации:
- Через четыре дня после трансфекции, удалить среде с использованием многоканального аспиратор (Corning) или вакуум палочка (VP-научного).
- Для 96-луночных планшетах, промыть клетки сразу с 100μл PBS.
- Добавить 25 мкл 0,25% трипсина в каждую лунку помощью многоканальной пипетки.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин со случайными агитации и визуальный осмотр, чтобы обеспечить полное отделение клеток.
- Добавить 90 мкл PBS с 10% FBS для инактивации трипсина и диссоциации клеток в суспензии отдельных клеток повторным пипетирования.
- Для 384-луночный, отмежеваться клеток с 10 мкл трипсина и закалки с 30 мкл PBS с 10% ЭТС.
- FACS анализа:
- Анализ GFP флуоресценции от BD LSRII FACS анализатор оснащен блок HTS или другой аналогичной комплектации FACS анализатор (например, Accuri или Intellicyt).
- Использование высокой пропускной режим на ГТС и анализа 10 мкл клеточной суспензии. Установить количество порог до 1,0 х 10 4 клеток.
- Регулировка напряжения ФЭУ и порог, чтобы захватить клетки вперед по сравнению с побочными точечный график. Ворота для живой клеточной популяции в forwARD против стороны-точечный график.
- Создание гистограммы участок канала GFP. Установить ворота в канале GFP, так что ~ 10% клеток оказываются GFP-отрицательным в макет или контрольно-миРНК трансфекции клеток.
- Определить% GFP-негативные клетки друг от лечения:% дифференцированных клеток =% GFP-негативные клетки. Сравните% дифференцированных клеток между экспериментальными и контрольно-миРНК трансфекции с использованием 2-Стьюдента-тест, и набрать положительную хиты с р-значения <0,01.
4. Представитель Результаты
Oct4, Nanog и Sox2 три гена, которые играют важную роль в поддержании ES клетки самообновлению 6,7,9-11. Рисунок 2 показывает, что анализ Oct4GiP репортер легко обнаружить дифференциации вызвана глушителей этих факторов в Oct4GiP ЭС клетки.
На рисунке 2а клетки Oct4GiP ES являются GFP-положительных, когда поддерживается в ES клеток. Рисунок 2B показывает вперед по сравнению с боковой сюжет рассеяния и гистограммы канала GFP из Oct4GiP клеток, трансфицированных управления или Oct4-siRNAs. Стоит ворота для живых клеток в передней части против точечной диаграммы, а мертвые клетки и мусора являются GFP-отрицательные и повысит фон. С другой стороны, дублет дискриминации, чтобы исключить возможные скопления клетки не всегда необходимо. В контрольно-миРНК трансфекции клеток, подавляющее большинство клеток должна быть GFP-положительных. Если очевидных GFP-отрицательный населения находятся в контрольно-миРНК трансфекции скважин, начиная Oct4GiP клеток или трансфекции процедура, возможно, были скомпрометированы, и результат не может быть интерпретации.
Рисунок 2C показывает гистограмма% дифференцированных клеток (% дифференцированных клеток =% GFP-отрицательные клетки) от управления, Oct4-, Nanog-и Sox2-миРНК трансфекции клеток.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема анализа репортер Oct4GiP.
Рисунок 2. Oct4GiP репортер анализ может обнаружить ES клеточной дифференцировки вызвано Nanog, Oct4, Sox2 или глушителей. А) E14Tg2a (дикого типа, черная линия) и Oct4GiP (зеленая линия) клеток были проанализированы FACS. Гистограмма GFP-канал показывает, что Oct4GiP клеток GFP-положительных. B) Oct4GiP клетки трансфицированных в 96-луночных планшетах с контрольно-или Oct4-миРНК и FACS проанализированы через 4 дня после трансфекции. Вперед против сторона разброс участков и гистограммы GFP-канал трансфицированных клеток показано на рисунке. C) Oct4GiP клетки трансфицированных Контрольно-, Nanog-, Oct4-или Sox2-миРНК. % Дифференцированных клеток определяли по% GFP-негативные клетки через 4 дня после трансфекции, и была построена как среднее + / - стандартная ошибка среднего (п = 4).F = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ Oct4GiP репортер мы описываем выше, можно количественно измерить степень самообновления против дифференциации. По сравнению с другими доступными методами, такими как морфологии на основе 12 и распространения / жизнеспособность на основе анализов, она предлагает высокую чувствительность и производительность, а также более прямое измерение состояния клетки ES. Поэтому хорошо подходит для крупномасштабных экранах и генетический анализ эпистаза. В самом деле, мы и другие успешно используют анализ Oct4GiP репортер генома РНК-интерференции экранов 3,8. Как и все анализы, однако, он также имеет свои ограничения. Он может быть использован для изучения генов, которые прямо или косвенно регулируют деятельность Oct4 промоутер, и это может ложно идентифицировать гены, которые влияют на GFP выражение, стабильности, или функция пост-транскрипционно. Таким образом, дополнительные анализы или вторичных экранов, таких как щелочной фосфатазы окрашивания 13 (Millipore, SCR004) и иммунофлюоресценции окрашиванием или количественным RT-PCR маркеров плюрипотентности 3,8,12,14 должны подтвердить результаты, полученные этим методом.
Анализ Oct4GiP репортер использует эффективный глушитель ген. Эффективное siRNAs и эффективной трансфекции миРНК являются ключевыми для успеха анализа. Хотя мы только описал использование репортер анализа с миРНК трансфекции, анализ также может быть выполнена с ДНК трансфекции в тишине или гиперэкспрессией гена интерес. Эффективность трансфекции ДНК, как правило, ниже, чем у siRNAs и может привести к снижению силы фенотипа.
Кроме того, что было описано в протоколе, анализ Oct4GiP репортер может быть изменено для выявления и характеризующие гены, которые негативно регулировать самообновление, а также. В этом случае клетки могут быть трансфицированных siRNAs и культивировали в условиях дифференциации. Отключение отрицательных регуляторов самообновлению повысит самообновления и поддержания GFP выражение, которое может быть гetected по FACS так же, как описано в текущем протоколе.
Кроме того, клетки Oct4GiP репортер, репортер других клеточных линий, использование ЭС клетки конкретных промоутеров, такие как Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) и Rex1-GFP 19 клеток, также были созданы. Они также могут быть использованы для изучения ES клетки самообновлению и обслуживания с использованием той же стратегии. Тем не менее, потому что есть заметная разница в активности и специфичности этих ES клетки промоутеров маркерный ген, эти линии репортер клетки ведут себя по-разному с точки зрения уровня фона и чувствительности и, таким образом, дополняют друг друга. Наконец, с помощью другой линии конкретных репортер линий ES клетки, наша стратегия может быть изменена для изучения судьбы спецификации ЭС клеток и содействовать применению клеточных ES, как в пробирке модель раннего развития млекопитающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Брэд Lackford для чтения и редактирования рукописей. Это исследование было поддержано Национальным институтом экологических наук, Национальный институт здоровья Внутренние Программы исследований Z01ES102745 (на GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
