Summary
Vi beskriver en fluorescens reporter analys att snabbt identifiera och karakterisera gener som reglerar musen embryonala underhåll stamceller och själv-förnyelse.
Abstract
Pluripotens och självförnyelse är två utmärkande egenskaper hos embryonala stamceller (ES-celler). Förstå den underliggande molekylära mekanismen kommer i hög grad underlätta användningen av ES-celler för utvecklingsbiologi studier, sjukdom modellering, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin (över 1,2).
För att påskynda identifiering och karakterisering av nya regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse, utvecklade vi en fluorescens reporter-baserad analys för att kvantitativt mäta självförnyelse status i mus ES-celler med hjälp av Oct4GiP cellerna 3. De Oct4GiP celler uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den Oct4 genpromotorregionen 4,5. Oct4 krävs för ES-cell självförnyelse och är mycket uttrycks i ES-celler och snabbt nedregleras under differentiering 6,7. Som ett resultat korrelerar GFP-uttryck och fluorescens i rapportörgenanalysen celler trogetmed ES cellidentitet 5, och fluorescens-cellsortering (FACS) kan analysen användas för att noga övervaka självförnyelse status cellerna vid den enda cellnivå 3,8.
Tillsammans med RNAi kan Oct4GiP reporter analysen användas för att snabbt identifiera och studera regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse 3,8. Jämfört med andra metoder för analys av självförnyelse, är det mer praktiskt, känslig, kvantitativ, och lägre kostnad. Den kan utföras i 96 - eller 384-brunnars plattor för omfattande undersökningar, såsom hög genomströmning skärmar eller genetisk epistasis analys. Slutligen, genom användning av andra härstamning-specifika reportern ES-cellinjer kan analysen som beskrivs här också modifieras för att studera ödet specifikation under ES-celldifferentiering.
Protocol
1. Oct4GiP mus ES-cell Underhåll
Oct4GiP celler tillhandahölls vänligen av Dr Austin Smith. De härrör från 129/Ola mössen bär en Oct4-GFPiresPac transgen 4,5. Att den hålls i gelatinbelagda plattor för vävnadsodling i ESGRO fullständigt plus klonal grad medium (Millipore) eller i M15-medium: DMEM (Invitrogen) kompletterat med 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1 x icke- essentiella aminosyror (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), och 10 ^ M β-merkaptoetanol.
- Belägga plattorna med 0,1% gelatin (Sigma) vid rumstemperatur under 30 minuter (0,1 ml gelatinlösning / cm 2).
- Plattan Oct4GiP celler i gelatinbelagda plattor vid ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Dela cellerna varannan dag med 0,05% trypsin.
2. siRNA Transfektion i Oct4GiP Celler
Den Oct4GiP reportern analysen är mest conveniently utföras i gelatin-belagda flatbottnade 96 - eller 384-brunnars plattor (Corning eller BD) i M15-medium. Den totala proceduren skisseras i Figur 1.
- siRNA-lipid komplex montering:
- För transfektion i 96-brunnsplattor, montera siRNA-lipidkomplex i U-bottnad 96-brunnars plattor.
- I varje brunn, tillsätts 10 | il OptiMEM (Invitrogen) och 0,3 pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) och inkubera vid rumstemperatur under 5 minuter.
- Tillsätt 5 pmol siRNA till lipid-OptiMEM-blandningen och inkuberas under ytterligare 15 minuter. Den siRNA: lipid är 100 pmol: 6ul.
- Överför siRNA-lipid komplex i OptiMEM från U-bottenplatta till gelatin-belagda platta botten platta med en flerkanalig pipett.
- För transfektion i 384-brunnsplattor, framställa de siRNA-lipidkomplex med användning 0,1 xl Lipofectamine 2000 och 2 pmol siRNA i 10 | il OptiMEM.
Obs: Den slutliga siRNA koncentrationen itransfektionerna är 50 nM. Utför 3-4 biologiska replikat för varje siRNA transfektion. Upprätta master blandningar av de siRNA-lipidkomplex i den U-bottenplatta och alikvot in i flatbottnade gelatin-belagda plattan.
- Oct4GiP cellen plätering och transfektion:
- För transfektion i 96-brunnsplattor, samla Oct4GiP celler och återsuspendera dem i färskt M15-medium till 9 x 10 4 celler / ml.
- Tillsätt 100 pl av cellsuspensionen till varje brunn med en multikanalpipett.
- Blanda cellsuspensionen med de pre-alikvoter siRNA-lipider komplex i väl genom pipettering upp och ned 3-5 gånger. Ändra tips för olika siRNA transfektioner.
- För transfektion i 384-brunnsplattor, återsuspendera Oct4GiP celler till 6 x 10 4 celler / ml och alikvot 30 pl cellsuspension till varje brunn.
Obs: Den optimala cellen plätering densitet är oftast 3 x 10 5 celler / cm 2, men det may behöva ytterligare optimering för siRNA som dramatiskt påverkar cellens tillväxt eller lönsamhet. Låg plätering täthet kommer att leda till dålig cellöverlevnad under transfektion. Hög plätering täthet kommer att leda till hög bakgrund på grund av hög cellkonfluens inducerad differentiering. Om så är nödvändigt, prov plätering densitet mellan 2-4 x 10 5 celler / cm 2.
- Medium förändring:
- Ta bort gammalt medium med hjälp av multi-channel aspirator (Corning) eller Handsug (VP-Scientific). Var noga med att inte repa cellerna i botten av plattorna.
- Mata cellerna med färskt ES-cell-medium (100 | il för 96-brunnsplatta och 30 | il för 384-brunnars platta) med användning av multikanalpipett varje dag.
3. FACS-analys
- Celldissociation:
- Fyra dagar efter transfektion, ta bort medel med hjälp av multi-channel aspirator (Corning) eller Handsug (VP-Scientific).
- För 96-brunnsplattor, skölj-celler en gång med 100μl PBS.
- Tillsätt 25 pl 0,25% trypsin till varje brunn med en multikanalpipett.
- Inkubera vid rumstemperatur under 5minutes med tillfällig omrörning, och visuellt inspektera för att säkerställa fullständig lösgöring av cellerna.
- Tillsätt 90 pl av PBS med 10% FBS för att inaktivera trypsinet och dissociera cellerna i en enda cellsuspension genom upprepad pipettering.
- För 384-brunnsplattor, skildes celler med 10 | il trypsin och avbryt reaktionen med 30 | il PBS med 10% FBS.
- FACS-analys:
- Analysera GFP fluorescensen på BD LSRII FACS analysator utrustad med HTS enheter eller andra liknande utrustade FACS analysator (såsom Accuri eller Intellicyt).
- Använda hög genomströmning läge på HTS och analysera 10 pl av cellsuspensionen. Ställa in räkningströskel till 1,0 x 10 4-celler.
- Justera PMT spänning och tröskeln för att fånga cellerna i framåt jämfört med side-punktdiagram. Grind för den levande cellen befolkningen i forwARD mot sida punktdiagram.
- Skapa ett histogram kurva för GFP kanalen. Ställ grinden i GFP kanalen så att ~ 10% av cellerna verkar vara GFP-negativ i de håna eller kontroll-siRNA transfekterade celler.
- Bestämma% GFP-negativa celler från varje behandling:% Differentierade celler =% GFP-negativa celler. Jämför procent Differentierade celler mellan experimentella-och kontroll-siRNA transfektion med 2-tailed t-test, och gör de positiva träffar med p-värden <0,01.
4. Representativa resultat
Oct4, NANOG och Sox2 är tre gener som spelar avgörande roller i upprätthållandet av ES-celler självförnyelse 6,7,9-11. Figur 2 visar att Oct4GiP reportern analysen lätt kan upptäcka differentieringen orsakas av tysta dessa faktorer i Oct4GiP ES-celler.
Figur 2A visar de Oct4GiP ES-celler är GFP-positiva efter att ha hållits såsom ES celler. Figur 2B visar den framåt mot sidan spridningsdiagram och histogram över GFP-kanalen av Oct4GiP celler transfekterade med kontroll-eller Oct4-siRNA. Det är nödvändigt att grind för levande celler i den främre vs sidan punktdiagram, eftersom döda celler och smuts är GFP-negativa och kommer att öka bakgrund. Å andra sidan, dublett diskriminering att utesluta möjliga cellklumpar är inte alltid nödvändigt. I de transfekterade kontroll-siRNA celler, bör de flesta av cellerna vara GFP-positiva. Om uppenbara GFP-negativa populationer finns i de transfekterade kontroll-siRNA brunnar kan start Oct4GiP cellerna eller transfektionen förfarandet har äventyrats och resultatet får inte vara tolkningsbar.
Figur 2C visar stapeldiagram över procent Differentierade celler (% Differentierade celler =% GFP-negativa celler) från kontroll-, Oct4-, NANOG-, och Sox2-siRNA transfekterade celler.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Figur 1. Översikt över Oct4GiP reporter analysen.
Figur 2. Oct4GiP reporter-analys kan detektera differentiering av ES-celler som orsakas av NANOG, Oct4 eller Sox2 ljuddämpning. A) E14TG2a (vildtyp, svart linje) och Oct4GiP (grön linje) celler analyserades med FACS. Histogram av GFP-kanalen visar att Oct4GiP celler är GFP-positiva. B) Oct4GiP celler transfekterades i 96-brunnsplattor med kontroll-eller Oct4-siRNA och FACS analyserades 4 dagar efter transfektion. Framåt mot tomter sidospridning och histogram för GFP-kanal de transfekterade cellerna visas.) C Oct4GiP celler med Control-, NANOG-, Oct4-eller Sox2-siRNA. De procentuella Differentierade celler bestämdes från% GFP-negativa cellerna 4 dagar efter transfektion, och plottades som medelvärde + / - standardfelet för medelvärdet (n = 4).f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovan kan kvantitativt mäta omfattningen av självförnyelse vs differentiering. Jämfört med andra tillgängliga metoder, såsom morfologi-baserade 12 och proliferation / viabilitet-baserade analyser, erbjuder den högre känslighet och genomströmning, såväl som en mer direkt mätning av ES-cellen tillstånd. Det är därför väl lämpad för storskaliga skärmar och genetisk epistasis analys. I själva verket har vi och andra använts framgångsrikt analysen Oct4GiP reporter för arvsmassan hela RNAi skärmar 3,8. Liksom alla analyser har emellertid också begränsningar. Den kan endast användas för att studera gener som direkt eller indirekt reglerar Oct4 promotoraktivitet, och det kan falskt identifiera gener som påverkar uttryck av GFP, stabilitet, eller en funktion post-transkriptionellt. Därför ytterligare analyser eller sekundära skärmar, såsom alkaliskt fosfatas färgning 13 (Millipore, SCR004) och immunofluorescensfärgning eller kvantitativ RT-PCR av pluripotens markörer 3,8,12,14 krävs för att bekräfta resultaten från denna metod.
Den Oct4GiP reporter Analysen bygger på en effektiv geners uttryck. Effektiva siRNA och effektiva transfektioner siRNA är nyckeln till framgång för analysen. Även om vi bara beskrivit användning av reportern analysen med siRNA transfektionerna kan analysen också utföras med DNA-transfektioner till tystnad eller överuttrycker gener av intresse. DNA-transfektionseffektiviteten är vanligtvis lägre än den för siRNA och kan minska styrkan hos den fenotyp.
Förutom vad som beskrivs i detta protokoll, kan Oct4GiP reporter analysen modifieras för att identifiera och karakterisera gener som negativt reglerar självförnyelse också. I det fallet kan cellerna transfekteras med siRNA och odlades i differentiering betingelser. Tysta negativa regulatorer av självförnyelse kommer att förbättra självförnyelse och upprätthålla GFP uttryck som kan vara detected med FACS på samma sätt som beskrivs i det nuvarande protokollet.
Förutom de Oct4GiP reportergrupper celler, har andra reportergrupper cellinjer med användning ES-cellspecifika promotorer såsom NANOG-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) och Rex1-GFP 19 celler, även genererats. De kan också användas för att studera ES-cell självförnyelse och underhåll med samma strategi. Men, eftersom det finns märkbar skillnad i aktiviteten och specificiteten hos dessa markörer ES cell genpromotorer dessa reporter cellinjer beter sig annorlunda i termer av bakgrundsnivån och känslighet och därmed kompletterar varandra. Slutligen, genom att använda andra härkomst-specifika reporter ES-cellinjer, kan vår strategi modifieras för att studera öde-specifikation av ES-celler och underlätta användningen av ES-celler som en in vitro-modell för däggdjur tidig utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Brad Lackford för att läsa och redigera manus. Denna forskning stöds av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Interna Research Program Z01ES102745 (till GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
