Summary
We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.
Abstract
Pluripotentie en zelfvernieuwing zijn twee definities van de kenmerken van embryonale stamcellen (ES cellen). Het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanisme zal aanzienlijk vergemakkelijken het gebruik van ES-cellen voor de ontwikkelingsbiologie studies, ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve geneeskunde (overzicht in 1,2).
Om de identificatie en karakterisering van nieuwe regulatoren van ES-cel onderhoud en zelfvernieuwing te bespoedigen, hebben we een fluorescentie-reporter-gebaseerde test om kwantitatief te meten van de zelfvernieuwing status in de muis ES-cellen met behulp van de Oct4GiP cellen 3. De Oct4GiP cellen brengen green fluorescent protein (GFP) onder controle van de Oct4 gen promotergebied 4,5. Oct4 is vereist voor ES-cel zelf-vernieuwing, en is hoog tot expressie in ES-cellen en snel down-gereguleerd tijdens de differentiatie van 6,7. Hierdoor GFP expressie en fluorescentie in de cellen reporter correleert trouwmet de ES-cel identiteit 5 en fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) analyse kan worden gebruikt om nauwlettend toezien op de zelfvernieuwing status van de cellen op de enkele cel niveau van 3,8.
In combinatie met RNAi, kan de Oct4GiP reporter test gebruikt worden om snel te identificeren en te bestuderen regulatoren van ES-cel onderhoud en zelfvernieuwing 3,8. In vergelijking met andere methoden voor het bepalen zelfvernieuwing is het handig, gevoelig kwantitatieve en lagere kosten. Het kan worden uitgevoerd in 96 - of 384-platen voor grootschalige studies zoals hoge-doorvoer schermen of genetische epistase analyse. Tenslotte door andere lijn-specifieke reporterconstructieproducten ES cellijnen kan de test hier beschreven ook worden gemodificeerd lot specificatie tijdens ES celdifferentiatie bestuderen.
Protocol
1. Oct4GiP muis ES Cell Onderhoud
Oct4GiP cellen werden vriendelijk verschaft door Dr Austin Smith. Ze werden afgeleid van de 129/Ola muizen die een Oct4-GFPiresPac transgen 4,5. Zij worden gehandhaafd gelatine beklede weefselkweek-platen op de ESGRO volledige plus klonale gehalte medium (Millipore) of in de M15 medium: DMEM (Invitrogen) aangevuld met 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore) 1x Niet essentiële aminozuren (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore) en 10 uM β-mercapto-ethanol.
- Coat platen met 0,1% gelatine (Sigma) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (0,1 ml gelatine-oplossing / cm 2).
- Plaat Oct4GiP cellen in gelatine beklede platen op ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Splits de cellen elke twee dagen 0,05% trypsine.
2. siRNA Transfectie in Oct4GiP cellen
De Oct4GiP reporter test is het meest convenientgevoerd uitgevoerd gelatine beklede vlakke bodem 96 - of 384-wells platen (Corning of BD) in de M15 medium. De algemene procedure geschetst in figuur 1.
- siRNA-lipide-complexen montage:
- Voor transfectie in 96-well platen, monteren siRNA-lipidecomplexen in U-bodem 96-wells platen.
- In elk putje mix 10 pi Optimem (Invitrogen) en 0,3 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 5 pmol siRNA aan de lipide-Optimem mengsel en incubeer gedurende nog eens 15 minuten. De siRNA: lipide verhouding 100 pmol: 6ul.
- Breng de siRNA-lipidecomplexen in Optimem van de U-bodemplaat aan de gelatine beklede vlakke bodemplaat met een multi-kanaal pipet.
- Voor transfectie in 384-wells platen, de voorbereiding van de siRNA-lipide complexen met behulp van 0,1 pl Lipofectamine 2000 en 2 pmol siRNA in 10 ul Optimem.
Opmerking: De uiteindelijke siRNA-concentratie inde transfecties is 50 nM. Voer 3-4 biologische replica voor elke siRNA transfectie. Stel meester mengsels van de siRNA-lipidecomplexen in de U-bodemplaat en aliquot in de platte bodem gelatine beklede plaat.
- Oct4GiP cel plating en transfectie:
- Voor transfectie in 96-well platen, verzamelen Oct4GiP cellen opnieuw in suspensie in vers medium M15 9 x 10 4 cellen / ml.
- Voeg 100 pi van de celsuspensie in elk putje met een multi-kanaal pipet.
- Meng de celsuspensie met de vooraf gealiquoteerd siRNA-lipiden complexen in de put door het pipetteren en neer 3-5 keer. Wijzig tips voor verschillende siRNA transfecties.
- Voor transfectie in 384-platen, hersuspenderen Oct4GiP cellen 6 x 10 4 cellen / ml en aliquot 30 pi celsuspensie in elk putje.
Opmerking: De optimale cel platen dichtheid gewoonlijk 3 x 10 5 cellen / cm 2, maar may verdere optimalisatie voor siRNA's die dramatische gevolgen hebben voor de celgroei of levensvatbaarheid. Lage plating densiteit zal leiden tot slechte overleving van de cel tijdens de transfectie. Hoge plating densiteit zal leiden tot een hoge achtergrond door hoge cel samenvloeiing geïnduceerde differentiatie. Eventueel proef plating dichtheid 2-4 x 10 5 cellen / cm 2.
- Medium wijziging:
- Verwijder oude medium met behulp van multi-channel aspirator (Corning) of vacuüm wand (VP-Scientific). Let erop dat u de cellen krassen aan de onderkant van de platen.
- Voer de cellen met vers ES celmedium (100 pi van 96-well plaat en 30 ul van 384-wel plaat) met multi-kanaal pipet elke dag.
3. FACS analyse
- Cel dissociatie:
- Vier dagen na transfectie, verwijder medium met behulp van multi-channel aspirator (Corning) of vacuüm wand (VP-Scientific).
- Voor 96-wells platen eenmaal spoel cellen 100μl PBS.
- Voeg 25 ul 0,25% trypsine aan elk putje met een multi-kanaal pipet.
- Incuberen bij kamertemperatuur 5 minuten en toe roeren en visueel volledige loslaten van de cellen te waarborgen.
- Voeg 90 pi PBS met 10% FBS de trypsine inactiveren en cellen dissociëren tot een enkele-celsuspensies door herhaalde pipetteren.
- Voor 384 platen, scheiden cellen met 10 pi trypsine en demping van 30 pi PBS met 10% FBS.
- FACS-analyse:
- Analyseer de GFP-fluorescentie van de BD LSRII FACS analyse voorzien van de HTS-eenheid of andere vergelijkbare uitgerust FACS analyse (zoals Accuri of Intellicyt).
- Met de high-throughput-modus op de HTS en analyseren van 10 ul van celsuspensie. Stel de telling drempel tot 1,0 x 10 4 cellen.
- Pas PMT voltage en de drempel naar de cellen vast te leggen in de forward versus side-scatter plot. Poort voor de levende cellen bevolking in de DoorzendoptiesARD versus side-scatter plot.
- Maak een histogram plot voor het GFP-kanaal. Stel de poort in de GFP kanaal zodat ~ 10% van de cellen blijken GFP-negatief zijn in de mock of controle-siRNA getransfecteerde cellen.
- Bepaal% GFP-negatieve cellen van elke behandeling:% gedifferentieerde cellen =% GFP-negatieve cellen. Vergelijk de% gedifferentieerde cellen tussen de experimentele-en controle-siRNA transfecties met gebruik van 2-tailed t-test, en scoor de positieve hits met p-waarden <0,01.
4. Representatieve resultaten
Oct4, NANOG en Sox2 zijn drie genen die kritische rol spelen in het behoud van de ES-cel zelfvernieuwing 6,7,9-11. Figuur 2 laat zien dat de Oct4GiP reporter test gemakkelijk kan het onderscheid veroorzaakt door zwijgen op te leggen deze factoren in de te detecteren Oct4GiP ES cellen.
Figuur 2A toont de Oct4GiP ES cellen GFP-positieve als gehandhaafd ES cellen. Figuur 2B toont het voorste zijde tegen puntenwolk Het histogram van het GFP kanaal van de Oct4GiP cellen getransfecteerd met de controle of Oct4-siRNA's. Het is noodzakelijk gate levende cellen in voorwaartse tegen elkaar scatterplot de dode cellen en resten zijn GFP-negatieve en toenemen achtergrond. Anderzijds, doublet discriminatie mogelijk cel klonten sluiten niet altijd noodzakelijk. In de controle-siRNA getransfecteerde cellen, moet de overgrote meerderheid van de cellen in GFP-positieve. Als duidelijk GFP-negatieve populaties aanwezig zijn in de controle-siRNA getransfecteerd putten kunnen de start Oct4GiP cellen of transfectie procedure zijn aangetast en het resultaat kan niet interpreteerbaar.
Figuur 2C toont de staafdiagram van% gedifferentieerde cellen (% gedifferentieerde cellen =% GFP-negatieve cellen) van de controle-, Oct4-, NANOG-, en Sox2-siRNA getransfecteerde cellen.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Figuur 1. Overzicht van de Oct4GiP reporter test.
Figuur 2. Oct4GiP reporter test kan detecteren ES celdifferentiatie veroorzaakt door NANOG, Oct4 of Sox2 silencing. A) E14Tg2a (wild-type, zwarte lijn) en Oct4GiP (groene lijn) cellen werden geanalyseerd met behulp van FACS. Histogram van het GFP-kanaal blijkt dat Oct4GiP cellen GFP-positieve. B) Oct4GiP cellen werden in 96-wells platen met de Control of Oct4-siRNA en FACS analyse 4 dagen na transfectie. Forward tegen elkaar puntgrafieken en histogrammen van het GFP-kanaal van de getransfecteerde cellen worden getoond. C) Oct4GiP cellen werden getransfecteerd met de controle-, NANOG-, Oct4-of Sox2-siRNA. De gedifferentieerde cellen% werd bepaald uit de% GFP-negatieve cellen 4 dagen na transfectie en werd uitgezet als gemiddelde + / - standaardafwijking van het gemiddelde (n = 4).f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Oct4GiP reporter test beschrijven we hierboven kan kwantitatief meten van de mate van zelf-vernieuwing versus differentiatie. Vergeleken met andere beschikbare methoden, zoals morfologie gebaseerde 12 en proliferatie / levensvatbaarheid gebaseerde assays, biedt een hogere gevoeligheid en doorvoersnelheid, alsmede een directe meting van de embryonale stamcellen staat. Het is daarom zeer geschikt voor grootschalige schermen en genetische epistase analyse. Inderdaad, hebben wij en anderen met succes gebruikt de Oct4GiP reporter test voor genoomwijde RNAi schermen 3,8. Zoals alle assays, echter ook beperkingen. Het kan alleen worden gebruikt om genen die direct of indirect Oct4 promotor activiteit te reguleren te bestuderen, en het kan ten onrechte te identificeren genen die GFP-expressie, stabiliteit, of post-transcriptie beïnvloeden. Daarom zijn extra testen of secundaire schermen, zoals alkalische fosfatase vlekken 13 (Millipore, SCR004) en immunofluorescentiekleuring of kwantitatieve RT-PCR van pluripotentie markers 3,8,12,14 moeten resultaten van deze methode bevestigen.
De Oct4GiP reporter test is gebaseerd op een efficiënte gene silencing. Effectieve en efficiënte siRNA's siRNA transfecties zijn de sleutel tot het succes van de test. Hoewel we alleen beschreven gebruik van de reporter test met siRNA transfecties, kan de test ook worden uitgevoerd met DNA transfecties om te zwijgen of overexpressie van genen van belang. DNA transfectie-efficiëntie is gewoonlijk lager dan die van siRNA's en kan de sterkte van het fenotype.
Naast wat er beschreven in dit protocol, kan de Oct4GiP reporter assay worden aangepast voor het identificeren en karakteriseren van genen die een negatieve reguleren zelfvernieuwing ook. In dat geval kunnen de cellen worden getransfecteerd met siRNA's en gekweekt in differentiatie omstandigheden. Monddood maken van negatieve regulatoren van zelfvernieuwing zal verbeteren zelfvernieuwing en in stand GFP-expressie, die kan worden detected door FACS soortgelijke wijze als beschreven in de huidige protocol.
Naast de Oct4GiP reporter cellen zijn andere reporter cellijnen met ES-specifieke promotors, zoals NANOG-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) en Rex1-GFP 19 cellen, ook gegenereerd. Ze kunnen ook worden gebruikt om ES cellen zelfvernieuwing en onderhoud met dezelfde strategie bestuderen. Echter, want er is merkbaar verschil in de activiteit en specificiteit van deze ES-cel marker-gen promoters, deze reporter cellijnen zich anders gedragen op het gebied van achtergrondniveau en de gevoeligheid en zal dus vullen elkaar aan. Tenslotte door andere lijn-specifieke reporterconstructieproducten ES cellijnen onze strategie worden aangepast lot specificatie van ES cellen te bestuderen en het gebruik van ES cel als in vitro model voor zoogdieren vroege ontwikkeling vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Brad Lackford voor het lezen en bewerken van het manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Intramurale Research Program Z01ES102745 (naar GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
