أسرع وارتفاع القرار، وطن متري سنويا، GFP القائم على الفحص فيوجن الميتوكوندريا الحصول على بيانات حركية من خلايا متعددة في طريق موازية متحد البؤر المجهري

Summary

وقد تم قياس انصهار الميتوكوندريا من خلال تتبع من موازنة GFP المصفوفة التي تستهدف photoconverted عبر الشبكة الميتوكوندريا مع مرور الوقت. حتى الآن، يمكن أن تتعرض خلية واحدة فقط لتحليل الحركية ساعة طويلة في وقت واحد. نقدم أسلوب الذي يقيس خلايا متعددة في وقت واحد، بذلك تسرع من عملية جمع البيانات.

Protocol

1. صورة طبق التحضير

1. ثقافة INS1 الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على مستوى RPMI الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 5 مم NaHCO _3، 2 HEPES مم، حمض البيروفيك 2 ملم، و 11 مللى جلوكوز إلى التقاء 80٪.
2. يعرض للتريبسين الثقافات الخلية INS1 مع التربسين 0.05٪، وطبق لهم على بولي-D-يسين المغلفة لوحات التصوير ساترة القاع (30-40 التقاء٪).
3. السماح لوحات للوصول إلى نقطة التقاء 60-80٪ (~ 2 أيام) وإضافة مصفوفة الميتوكوندريا المستهدفة (COXVIII) الفيروسة الغدانية PA-GFP لمدة 24 ساعة (وزارة الداخلية = 5). وسائل الاعلام والسماح لتبادل الخلايا في النمو لمدة يوم 2 قبل التصوير.
4. في يوم من التصوير، إضافة 7-15 TMRE نانومتر إلى لوحات التصوير، ويوازن ما لا يقل عن 45 دقيقة.
5. خلال هذا الوقت على دور الحاضنة (وقد استخدمت مرحلة أعلى حاضنة هنا) والسماح للمجهر لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية لمدة حوالي 1 ساعة. بدوره على ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ _2.

   2. معلمات التصوير للمجهر زايس 710 LSM متحد البؤر

   1. بعد مجهر لديه معايرتها، تحت علامة التبويب اكتساب، انقر على "أدوات عرض دليل"، وفتح التصوير إعداد الفريق، واختيار "قناة واسطة" والتبديل تتبع كل "الإطار".
   2. في لوحة مسار الضوء، واختيار LSM ووضع قناة. العمل من رمز عينة التصاعدي، حدد "الخلفية"، MBS 690 +، وMBS 488. في الجزء السفلي من لوحة، واختيار "T-PMT" لتمكين التصور من مجال مشرق أو قناة مدينة دبي للإنترنت.
   3. الانتهاء من تعديل مسار ضوء المعلمات عن طريق تحديد النطاق للصبغ GFP إلى 490-540 نانومتر، وإلى 580-700 نانومتر لصبغ TMRE.
   4. في وضع حيازة واستخدام 512 × 512 بكسل مجال المسح الضوئي، 4x ومتوسط، واختيار عامل التكبير (والتي قد ترغب في الاحتفاظ بما يتفق لأغراض المعايرة).

   3. تحقيق الاستفادة المثلى من معلمات التصوير

   1. باستخدام خطة لامزيغ 100X (1.4 NA) هدف عدسة، FOCلنا في الخلايا الخاصة بك مع ضوء الهالوجين، وليس ضوء الفلورسنت، لحماية الميتوكوندريا من الضيائية.
   2. شاشة للسلطة الفلسطينية، معربا عن GFP الخلايا باستخدام ذات الثقب مفتوحة الى اقصى حد ممكن والمسح الضوئي للعثور على الخلايا التي هي أكثر إشراقا الخضراء.
   3. العثور على أدنى قوة ليزر 2-الفوتون اللازمة لتفعيل السلطة الفلسطينية وGFP وتحسين المعلمات التصوير ضمان أن يكون إشارة لا تشبع كاشف. تأكد من أن إشارة PA-GFP colocalizes مع الإشارة TMRE لسلسلة-Z قليلة. خسارة للإشارة إلى الاستقطاب TMRE الميتوكوندريا أو الضيائية، والخلايا العارضة لا ينبغي أن تستخدم هذه الخصائص للتحليل.
   4. العثور على خلية للسلطة الفلسطينية، معربا عن GFP وتحديد عامل التكبير.
   5. تعيين نطاق Z-سلسلة لجمع 6 شرائح (هذا النطاق سوف تحتاج إلى تلبية جميع الخلايا 10 ما لم يتم تعيين محدد Z-التركيز في كل موقف).
   6. حفظ طريقة التصوير لكل خلية (خلية 1، الخلية 2 وما إلى ذلك).

   4. ضبط آليد الجزء من البرنامج ويعين خلايا 10 سوف تتبع لفحص ساعة 1 فيوجن الميتوكوندريا

   1. في اللوحة اليسرى من النافذة multitime، حدد "حفظ" لوحة، وتحديد الموقع الذي سيتم فيه حفظ الملفات.
   2. في لوحة "شراء"، تحميل طريقة اكتساب حفظها للخلية 1 في تكوين المسح الضوئي والتحقق من المربع مكدس ض. أيضا اختيار "علامة Z-وسط كومة Z".
   3. في لوحة "لبنات"، حدد "كتلة واحدة في كل مكان". انقر على "كتل إضافة" لكل فترة إلى أن يقاس.
   4. في لوحة "توقيت"، حدد "الانتظار الفاصلة" ونوع "0" في "فترة الانتظار قبل كتلة في الموقع الأول فقط". وسوف كتل 2-4 لديهم "15 دقيقة" في هذا القسم.
   5. في لوحة الموقع، واختيار "نقل التركيز إلى تحميل الموقف بين المواقع" و "تحميل مسح التكوين عندما 'نقل إلى الموضع" أو النقر على "التالي الموضع". وبموجب "لائحة المواقع تحرير" اختر "مسح جميع"، ومن ثم تحديد "متعددة المواقع بمحركات المرحلة ".
   6. اوندإيه "بليتش" لوحة، انقر على "تبييض" مربع، وتعيين ملف التكوين في "التكوين" سحب أسفل القائمة، على النحو المحدد في إطار البرنامج الرئيسي. ثم، في إطار "التبييض"، حفظ طريقة تنشيط ضوئي مناسب. في لوحة المناطق، واختيار العائد على الاستثمار لهذه الخانة بصفة خاصة، وإضافة هذا العائد على الاستثمار إلى multitime عن طريق اختيار "المنطقة الحالية إضافة إلى عائد الاستثمار قائمة" نافذة. تأكد من تحديد الموقع نفسه في "ROI" سحب أسفل القائمة.

   بالنسبة لتوقيت للعمل بشكل صحيح، ولكل خلية أن يكون الفاصل الزمني 15 دقيقة، واثنين من الطرق بحاجة ليتم حفظها. في قائمة الكتل، وسوف يكون أول واحد "الحقيقي" تكوين تنشيط ضوئي، والباقي سيكون لها "وهمية" التكوين الذي لا يستخدم ليزر ثنائي الفوتون. سيكون اللبنة الأولى أيضا أن تكون الكتلة الوحيدة التي ليس لديها تأخير (BKIntv = 0). ولذلك، فإن الطريقة يبدأ مسح خط الأساس واحد، يتبعه فحص تنشيط ضوئي. ما تبقى من كتل لديها 900 ثانية BkIntv، وفي كل نقطة زمنية هناك نوعان من المسح تماما كما في الوقت 0 ثانية، للحفاظ على اتساق توقيت.

   7. لكل واحد من الخلايا 10 التي يتعين اتباعها مع مرور الوقت، تنفيذ هذا التسلسل:
      العثور على PAGFP معربا عن خلية حفظ منهجه التصوير
      موقع لوحة، بمناسبة موقف مرحلة، وتحديد طريقة التصوير
      الرئيسية ROI لوحة، اختيار المنطقة من اهتمام لتكون لوحة بليتش photoactivated-ROI حفظ محددة، وأيضا تحميله في المربع العائد على الاستثمار:
      محو العائد على الاستثمار وإعادة تعيين التكبير المسح إلى 1
      العثور على الخلية التالية وتعيين التكبير
      تكرار هذه العملية للحصول على الخلايا 9 التالي

   تأكد من أن كل موقع ويمنع كل مرحلة لها أسلوب التصوير المناسبة (مسح التكوين) المرتبطة بها. أيضا التأكد من أن كتلة الأول في كل موقع يتوافق مع طريقة تنشيط ضوئي مناسبة في حين أن بقية تحتوي على "وهمية" الأسلوب. أخيرا، حدد "تشغيل".

   5. تحليل قوة إشارة PA-GFP

   1. ثم تصدير البيانات إلى Excel وحساب متوسط ​​كثافة لZ-المداخن في كل نقطة زمنية. تجاهل المقاطع البصرية التي ليس لها إشارة.
   2. قياس التخفيف إشارة في كل Z-كومة من حساب النسبة المئوية للإشارة إلى photoactivated الأصلي.

   يتم فحص كل نقطة بيانات وسجلت مرتين، مما أدى إلى معلومات Z-كومة مكررة عن كل نقطة زمنية. تحقق من أن القيم Z-كومة توافق. إن لم يكن، وهذا يدل على وجود مشكلة (على سبيل المثال حركة التركيز الخلية،).

   6. ممثل النتائج

   عندما حدث اندماج يحدث بين الحبيبات الخيطية PA-GFP تفعيلها وعدم تفعيلها، وPAGFP داخل المصفوفة الميتوكوندريا تختلط مع مصفوفة غير المسمى، وتصبح مخففة على مساحة أكبر، والحد من إشارةكثافة (الشكل 1A). في الخلية INS1، حدوث انخفاض كبير في كثافة إشارة يحدث كل 15 دقيقة، حتى تم التوصل إلى موازنة من الانصهار الميتوكوندريا (حوالي 1 ساعة). لاحظ أن الخلية في الشكل 1B يسلك colocalization شبه كاملة من السلطة الفلسطينية وGFP وإشارات TMRE. في هذه القياسات لتركيز منخفض جدا من TMRE (15 نانومتر) ويستخدم للمساعدة في استهداف تنشيط ضوئي من PAGFP، وأيضا لرصد صحة الخلية. والخلايا مع وفرة من الميتوكوندريا استقطابها لديها colocalization غير مكتملة من PAGFP وTMRE، وينبغي ألا يكون ذلك بسبب تحلل وهذا يدل إما الضيائية، أو الخلايا في حالة الموت.

   الوقت موازنة للانصهار الميتوكوندريا هي عادة 1 ساعة في INS1 الخلايا، وعندما يتم تنشيط ~ 15٪ من حجم الميتوكوندريا. في بعض الأحيان، حتى لو كان يضيء مساحة صغيرة، ومعظم من الميتوكوندريا أصبح photoactivated بسبب وجود اتصالات للغاية، وفي هذه الحالة مزيد من الاندماج يصعب اكتشاف. قد أنواع الخلايا الأخرى تظهر مرة موازنة مختلفة، وينبغي اختبار على فترات أقصر وعلى مدى فترة أطول لوصف ديناميات الميتوكوندريا. لمنع انصهار الميتوكوندريا، يمكن وضع الخلايا ضمن بيئة lipotoxic. فقد سبق أن بينت أن 0.4 ملم بالميتات شظايا الميتوكوندريا، ويمنع الانصهار الميتوكوندريا ^9. ويمكن ملاحظة هذا التأثير في الشكل 2، حيث يتم تجزئة الميتوكوندريا، ولكن كثافة إشارة mtPAGFP لا تتغير بقدر ما في ظل الظروف العادية (الشكل 1). ولذلك، فإن التخفيف من الإشارة PA-GFP من المرجح أن يكون راجعا إلى الاندماج الميتوكوندريا بدلا من الانشطار. في أنواع الخلايا الأخرى، نقترح استخدام طرق أخرى معروفة للحث على تجزئة الميتوكوندريا، مثل إسكات OPA1 وهو أمر ضروري لاندماج الميتوكوندريا ^14.

   
   الشكل 1. ألف PA-GFP يصبح تدريجيا باهتة بسبب الأحداث الانصهار الميتوكوندريا مما يؤدي إلى التخفيف من البروتين على مساحة متزايدة، حيث يمكن أن تشاهد في هذه الصور المتوقعة من 6 أقسام بصري كميا كل 15 دقيقة. باء TMRE مع السلطة الفلسطينية وGFP يدل على أن الميتوكوندريا وينشط وليس استقطابها. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

   
   الشكل 2. الميتوكوندريا تحول دون الاندماج مع بالميتات 0.4 ملي يقلل من التخفيف من السلطة الفلسطينية وGFP. التوقعات ألف من 6 أقسام البصرية تظهر الميتوكوندريا قصيرة مع كثافة إشارة لا تتغير مع مرور الوقت. باء Colocalization من السلطة الفلسطينية وGFP مع TMRE يدل على ان الميتوكوندريا لا ديالاستقطاب. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

هذه الطريقة تسمح للتصوير حوالي 10 خلايا في كل مرة، إذا كان اكتساب يحدث كل 15 دقيقة بعد تنشيط ضوئي. والعدد الدقيق للخلايا تعتمد على مدى سرعة واحد قادر على تحديد مكان واحياء خلايا mtPAGFP التعبير داخل صحن والثقافة، ومدى السرعة التي يمكن للمرء أن إعداد جميع المعلمات البرمجيات. وينبغي لجعل الآلي بسلاسة أن تستخدم طبقة من الخلايا حتى لأن المعين Z-كومة هوامش سوف تطبق على جميع الخلايا.

وحجم هذا المجال تنشيط ضوئي الأولية تحكم وقت موازنة. لتكون قادرة على قياس انصهار الميتوكوندريا، من المهم أن photoactivate فقط 10-20٪ من الشبكة، بحيث يمكن رصد انتشار إشارة إلى بقية الشبكة مع مرور الوقت. إذا photoactivated الكثير من الشبكة، فمن الممكن أن الاندماج الكامل سوف تحدث بسرعة كبيرة جدا، وسوف لن يتم القبض على هذا الحدث.

يجب توخي الحذر الشديد لضبط قوة الليزر ليزر ثنائي الفوتون، فضلا عن تركيز TMRE لتجنب الضيائية الأمر الذي يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الميتوكوندريا. ويمكن التأكد من أن إشارة mtPAGFP colocalizes مع الإشارة TMRE مساعدة في تقييم الضيائية والصحة العامة الخلية ^8،15. وينبغي تجنب الإضاءة مع ضوء epifluoerescent. في حين تبحث عن الخلايا معربا عن mtPAGFP، ينبغي أن تكون مفتوحة ذات الثقب الحد الأقصى في حين مسح مع إثارة قوة 488nm منخفض. تعديل قوة الليزر ثنائي الفوتون إلى photoactivate ما يكفي من السلطة الفلسطينية وGFP لقياس إشارة أكثر من 1 ساعة ولكن ليس لoversaturate أي من الخلايا يمكن أن تكون خادعة ^8. ومع ذلك، ينبغي أن أمضى بعض الوقت في هذه الخطوة الأمثل لبدء برنامج الآلي مرة واحدة، فمن شاقة لوقف ذلك، لاختيار أكثر من الخلايا، واستئناف.

لمراقبة الجودة، والحصول على فارق المقابل تدخل (DIC) يمكن أن صورة (أو الضوء المرسل) لمراقبة التركيز على أن تكون خلايا جدامن المفيد أيضا وسيلة جيدة للكشف عن الفقاعات تشكلت في غمر النفط خلال المسح الضوئي، وهذا يحدث في بعض الأحيان من حركات المرحلة.

على الرغم من أن استخدام هذا الأسلوب mtPAGFP تجمع البيانات على حركة أحادي الاتجاه للبروتينات الميتوكوندريا المصفوفة من الميتوكوندريا photoactivated إلى تلك التي لا المسمى، فإنه من الممكن تصور للاستفادة من هذه التقنية لدراسة العمليات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن إرفاق fluorochromes محددة للبروتينات غشاء لمراقبة حركتهم محددة خلال أحداث الانصهار، كما ثبت عن ABC-لي، وانصهار والذي يحدث على نطاق وزمنية مختلفة من خلط للبروتينات قابلة للذوبان مصفوفة ^15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Carl Zeiss, Inc.