En hurtigere, høj opløsning, MTPA-GFP-baserede Mitokondriel Fusion Assay Erhvervelse Kinetiske data i flere celler i parallel anvendelse af konfokal mikroskopi

Summary

Mitokondrie fusion blev målt ved at spore ækvilibrering af photoconverted matrix-målrettet GFP over mitokondriske netværket over tid. Hidtil kunne kun en celle udsættes for en time lange kinetisk analyse ad gangen. Vi præsenterer en metode, der samtidigt måler flere celler, og dermed fremskynde indsamlingen af ​​data.

Protocol

1. Billede Plate Forberedelse

1. Kultur INS1 celler i RPMI-medier indeholdende 10% standard føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-mercaptoethanol, 5 mM _NaHCO3, 2 mM HEPES, 2 mM pyrodruesyre og 11 mM glucose til 80% konfluens.
2. Trypsinisér de INS1 cellekulturer med 0,05% trypsin og pladen dem på poly-D-lysin-overtrukne dækglas bund billeddannende plader (30-40% konfluens).
3. Mulighed for pladerne at nå 60-80% konfluens (ca. 2 dage), og der tilsættes mitokondriematriksen målrettet (COXVIII) adenoviral PA-GFP i 24 timer (MOI = 5). Udvekslingsmediet og tillader celler at vokse i yderligere 2 dage før billeddannelse.
4. På dagen for billeddannelse tilsættes 7-15 nM TMRE til billeddannende pladerne, og ækvilibrere i mindst 45 min.
5. I løbet af denne tid sving på inkubatoren (trin top inkubator er blevet anvendt her) og tillade mikroskop for at ækvilibrere til 37 ° C i omkring 1 time. Tænde _5% CO2.

   2. Imaging Parametre for Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop

   1. Efter mikroskop har ligevægt under Acquisition fanen, klik på "Vis manuelle værktøjer", kan åbne Imaging oprette panel, og vælg "kanal mode" og skiftespor hver "frame".
   2. I lyset stien panelet, vælge LSM og kanal-mode. Arbejde fra prøven ikonet opad, skal du vælge "bagside", MBS 690 + og MBS 488. Ved bunden af ​​panelet, vælg "T-PMT" at muliggøre visualisering af lyse område eller DIC kanal.
   3. Slut tilpasning lysbanen parametre ved at intervallet for GFP farvestoffet til 490-540 nm og 580-700 nm for TMRE farvestof.
   4. I købet tilstand, skal du bruge en 512 × 512 pixel scannings felt, gennemsnitlige 4x, og vælg en zoom faktor (som du måske ønsker at holde konsekvent til kalibreringsformål).

   3. Optimering af Imaging Parametre

   1. Brug af planen apochromat 100x (1,4 NA) objektiv, FOCos om dine celler med halogen lys, ikke fluorescerende lys, for at beskytte mitokondrier fra fototoksicitet.
   2. Screening for PA-GFP-udtrykkende celler under anvendelse af en maksimalt åbent hul og scanning for at finde de celler, der er lysere grøn.
   3. Finde den laveste kraft 2-foton laser for at aktivere PA-GFP og optimere de billeddannende parametre, der sikrer, at signalet ikke mætte detektoren. Kontroller, at PA-GFP signal colocalizes med TMRE signal for et par z-serie. Tab af TMRE signalet angiver mitokondrisk depolarisering eller fototoksicitet, og cellerne udviser disse karakteristika bør ikke anvendes til analyse.
   4. Find en PA-GFP-udtrykkende celler og angive en zoomfaktor.
   5. Indstilles z-serien området at indsamle 6 skiver (dette interval skal tilfredsstille alle 10 celler med mindre der specifikt z-fokus er indstillet ved hver position).
   6. Gem billeddannende metode for hver celle (celle 1, celle 2 osv.).

   4. Juster Automatiserd del af programmet og udpege de 10 celler, du vil følge for 1 time Mitokondriel Fusion Assay

   1. På venstre panel af multitime vinduet, skal du vælge "besparelse" panel, og angiv den placering, hvor filerne skal gemmes.
   2. I "Erhvervelsen" panel, indlæse overtagelsesmetoden gemt til celle 1 i scanningskonfigurationen og kontrollere z stak kassen. Vælg også "mærket Z-midten af ​​z stakken".
   3. I "blokke" panel, vælg "enkelt blok på hvert sted". Klik på "Tilføj blokke" for hvert interval, der skal måles.
   4. I "timing" panel, vælg "vent interval" og skriv "0" i "vente interval før blok først beliggenhed kun". Blokke 2-4 vil have "15 minutter" i dette afsnit.
   5. I stedet panelet, vælg "flytte fokus for at indlæse position mellem steder" og "load scanne config når 'flytter til loc' eller 'Næste LOC" klikkede. Under "Rediger placeringer liste" vælge "Slet alt" og derefter vælge "multiple steder motoriseret fase ".
   6. Undis den "Bleach" panel, skal du klikke på "blege" boks, og udpege konfigurationsfilen i "config" pull down menu, som angivet i vinduet af de vigtigste software. Så i "blegning" vinduet, skal du gemme den relevante fotoaktivering metode. I regioner panelet, vælge ROI for netop denne celle, og tilføje dette ROI til multitime ved at vælge "add aktuelle område til ROI liste" vinduet. Sørg for at vælge den samme placering i "ROI" pull down menuen.

   For timingen kunne fungere, og for hver celle har en 15 minutters interval, to metoder skal gemmes. På listen over blokke, vil den første har den "rigtige" fotoaktivering konfiguration, og resten vil have en "mock" konfiguration, der ikke bruger to-foton laser. Den første blok er også den eneste blok, der ikke har en forsinkelse (BKIntv = 0). Derfor fremgangsmåden begynder med en baselinescanning, efterfulgt af en fotoaktivering scanning. Resten af ​​blokkene har en 900 sek BkIntv, ogved hvert tidspunkt er der to skanninger lige så på tidspunktet 0 sek at opretholde timing konsistens.

   7. For hver af de 10 celler, der skal følges med tiden udfører denne sekvens:
      Find en PAGFP udtrykker celle-redde sit imaging metode
      Placering panel-markere scenen position, skal du angive billeddannende metode
      Main ROI panel-vælg et område af interesse at være fotoaktiveret Bleach panel-gemme specifikke ROI og også lægge det i fokusområdet:
      Slet ROI og nulstille scanningen zoom til 1
      Find den næste celle, og indstille zoom
      Gentag processen for de næste 9 celler

   Kontroller, at hvert trin placering og alle blokke have passende billeddannende metode (scanningskonfigurationen) tilknyttet. Sørg også for, at den første blok på hvert sted svarer til den relevante fotoaktivering metode, mens resten indeholder en "mock"-metoden. Endelig skal du vælge "kør".

   5. Analyser PA-GFP signalintensitet

   1. Så eksportere data til Excel og beregne den gennemsnitlige intensitet for z-stakke på hvert tidspunkt. Skille optiske sektioner, der intet signal.
   2. Måling af signalet fortynding i hvert z-stak ved at beregne procentdelen af ​​den oprindelige fotoaktiveret signal.

   Hvert datapunkt er scannet og registreret to gange, hvilket resulterer i duplikat z-stakken information for hvert tidspunkt. Kontroller, at z-stak værdier enige. Hvis ikke, hvilket er indikativt for et problem (f.eks fokus, cellebevægelse).

   6. Repræsentative resultater

   Når en fusion begivenhed indtræffer mellem en aktiveret og ikke-aktiverede PA-GFP mitochondriet er PAGFP i mitokondriematriksen blandes med den ikke-mærkede matrix og bliver fortyndet over et større område, faldende signalIntensiteten (figur 1A). I INS1 cellen forekommer et signifikant fald i signalintensitet hvert 15. minut, indtil ækvilibrering af mitokondriel fusion er nået (ca. 1 time). Bemærk, at cellen i figur 1B viser næsten fuldstændig colokalisering af PA-GFP og TMRE signaler. I disse assays en meget lav koncentration af TMRE (15 nM) bruges til at hjælpe målrette fotoaktivering af PAGFP, og også at overvåge celle sundhed. Celler med en overflod af depolariseret mitokondrier vil have ufuldstændig colokalisering af PAGFP og TMRE og skal ikke analyseres, da dette indikerer enten fototoksicitet, eller celler i en døende tilstand.

   Ligevægtstidspunktet for mitokondrie fusion er sædvanligvis en time i INS1 celler, når ~ 15% af den mitokondrielle volumen aktiveret. Tider, selv om en lille område belyst fleste af mitokondrier blive fotoaktiveret grund til at være meget netværk, i hvilket tilfælde yderligere fusion er vanskeligt at detektere. Andre celletyper kan udvise forskellige ækvilibreringstider og skal testes med kortere intervaller, og over en længere periode til at karakterisere mitokondrie dynamik. At inhibere mitokondrie fusion, kan cellerne anbringes i et lipotoxic miljø. Det er tidligere blevet påvist, at 0,4 mM palmitat fragmenter mitokondrier, og inhiberer mitokondriel fusion ^9. Denne virkning kan ses i figur 2, hvor mitokondrier er fragmenteret, men signalet intensitet mtPAGFP ikke ændrer så meget som under normale betingelser (figur 1). Derfor er fortynding af PA-GFP signal sandsynligvis skyldes mitochondrial fusionsprotein end fission. I andre celletyper, foreslår vi at anvende andre kendte måder til at inducere mitochondrial fragmentering, såsom silencing OPA1 som er nødvendig for mitokondrie fusion ^14.

   
   Figur 1. A. PA-GFP bliver gradvist svagere grund mitochondriale fusionsproteiner begivenheder, der fører til fortynding af protein over en større areal som det kan ses i disse projicerede billeder 6 optiske sektioner kvantificeres hver 15 minutter. B. TMRE med PA-GFP viser, at mitokondrier er aktive og ikke depolariseret. Klik her for at se større figur .

   
   Figur 2. Mitochondrial fusion inhiberes med 0,4 mM palmitat nedsætter fortynding af PA-GFP. A. projektioner af 6 optiske sektioner viser kort mitokondrier med et uforanderligt signalintensitet over tid. B. colokalisering af PA-GFP med TMRE viser, at mitokondrier er ikke depolariseret. Klik her for at se større figur .

Discussion

Denne fremgangsmåde giver mulighed for billeddannelse på omkring 10 celler ad gangen, hvis erhvervelsen sker hvert 15. minut efter fotoaktivering. Det nøjagtige antal celler vil afhænge af, hvor hurtigt man er i stand til at finde og markere mtPAGFP udtrykker cellerne i kultur fad, og hvor hurtigt man kan oprette alle de software parametre. For at gøre automatisering køre gnidningsløst et jævnt lag af celler, bør anvendes, fordi de udpegede z-stak margener vil gælde for alle celler.

Størrelsen af ​​dette første fotoaktivering område vil styre ekvilibreringstid. At kunne måle mitochondrial fusion, er det vigtigt at photoactivate kun 10-20% af netværket, således at spredningen af ​​signalet til resten af ​​netværket kan overvåges over tid. Hvis for meget af netværket fotoaktiveret, er det muligt at fuldstændig sammensmeltning vil ske for hurtigt, og arrangementet vil ikke blive fanget.

Den yderste forsigtighed skal træffesjustere lasereffekt af to-foton laser samt TMRE koncentrationen at undgå fototoksicitet, hvilket fører til mitokondriel depolarisering. Sikring af, at mtPAGFP signal colocalizes med TMRE signalet kan hjælpe med at vurdere fototoksicitet og generelle celle sundhed ^8,15. Belysning med epifluoerescent lys bør undgås. Når du søger efter celler, der udtrykker mtPAGFP, bør pinhole være maksimalt åben mens den scanner med et lavt effektforbrug 488 nm excitation. Justering af to-foton lasereffekt på photoactivate nok PA-GFP til at måle signalet i løbet af 1 time, men ikke til oversaturate nogen af cellerne kan være vanskeligt ^8. Dog skal tiden bruges på denne optimering trin, fordi når automatiseret program er startet, er det trættende at stoppe det, for at vælge flere celler, og genoptage.

For kvalitetskontrol, billede (eller transmitteret lys) at overvåge fokus på cellerne erhvervelse af en differentieret interferens kontrast (DIC), kan være megethjælpsomme og også en god måde at opdage bobler i fordybelse olien under scanning, og dette undertiden sker fra bevægelser på scenen.

Selv med denne mtPAGFP fremgangsmåde indsamler data på den ensrettede bevægelse af mitochondriale matrixproteiner fra fotoaktiveret mitokondrier til dem, der ikke er mærket, er det tænkeligt at anvende denne teknik til at undersøge andre processer. For eksempel kan specifikke fluorochromer fastgøres til membranproteiner at observere deres specifikke bevægelse under fusionsbegivenheder, som det er blevet vist for ABC-me, fusion som forekommer på en anden skala fra en blanding af opløselige matrixproteiner ^15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Carl Zeiss, Inc.