Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

Published: July 20, 2012 doi: 10.3791/3991

Summary

Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.

Protocol

1. Image Plate Voorbereiding

  1. Culture INS1 cellen in RPMI medium met 10% foetaal runderserum standaard, 1% penicilline streptomycine, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM pyrodruivenzuur, en 11 mM glucose 80% confluentie.
  2. Trypsinize de INS1 celculturen met 0,05% trypsine en plaat ze op poly-D-lysine gecoat dekglaasje bodem beeldvorming platen (30-40% confluentie).
  3. Laat voor platen 60-80% confluentie (~ 2 dagen) bereikt en voeg mitochondriale matrix gericht (COXVIII) adenovirale PA-GFP gedurende 24 uur (moi = 5). Exchange media en laat cellen om te groeien gedurende de volgende 2 dagen voor de beeldvorming.
  4. Op de dag van beeldvorming, voeg 7-15 nM TMRE aan de beeldvorming platen, en evenwicht voor ten minste 45 minuten.
  5. Gedurende deze tijd weer op incubator (fase boven incubator is hier gebruikt) en laat de microscoop tot 37 equilibreren ° C gedurende ongeveer 1 uur. Zet de 5% CO 2.

    2. Imaging Parameters voor de Zeiss LSM 710 confocale microscoop

    1. Na de microscoop heeft in evenwicht gebracht, onder de Overname tab, klik op "toon handgereedschap", opent u de beeldvorming ingesteld panel, en kies "channel mode" en schakel te volgen om de "frame".
    2. In het licht pad panel, kies LSM en channel mode. Werken vanuit het monster icoon naar boven, selecteer "achter", MBS 690 +, en MBS 488. Aan de onderkant van het paneel, kies "T-PMT" om visualisatie van de heldere veld of DIC kanaal mogelijk te maken.
    3. Eindig het instellen van de parameters lichtpad door het instellen van het bereik voor de GFP kleurstof 490-540 nm en 580-700 nm voor de TMRE kleurstof.
    4. In de overname-modus, gebruik dan een 512 × 512 pixels scan veld, gemiddeld 4x, en kies een zoomfactor (die kunt u een consistente te houden voor calibratie doeleinden).

    3. Het optimaliseren van de Imaging Parameters

    1. Met behulp van het plan apochromat 100x (1,4 NA) objectief, focons aan de cellen met de halogeen licht, niet fluorescerend licht, de mitochondriën te beschermen tegen fototoxiciteit.
    2. Scherm voor PA-GFP tot expressie brengen met behulp van een maximaal geopende gaatje en scannen naar de cellen die zijn lichter groen te vinden.
    3. De laagste energie van de laser 2 foton nodig PA-GFP geactiveerd en de afbeeldingsparameters zodat het signaal niet de detector verzadigen optimaliseren. Controleer of de PA-GFP signaal colocalizes met de TMRE signaal voor een paar z-serie. Het verlies van de TMRE signaal geeft mitochondriale depolarisatie of fototoxiciteit, en cellen vertonen deze kenmerken mag niet worden gebruikt voor analyse.
    4. Zoek een PA-GFP expressie brengende cel en geef een zoomfactor.
    5. Stel de Z-serie bereik tot 6 sneetjes (dit bereik zal moeten alle 10 cellen te voldoen, tenzij er een specifieke z-focus is vastgesteld op elke positie) te verzamelen.
    6. Sla de beeldvormende methode voor elke cel (cel 1, cel 2, enz.).

    4. Pas het automatiserend deel van het programma en wijzen zij de 10 cellen volg je voor de 1 uur Mitochondriale Fusion Assay

    1. Op het linker paneel van de multitime venster, selecteer dan de "besparing" paneel, en geef de locatie waar de bestanden worden opgeslagen.
    2. In de "Overname" paneel, laadt de overname methode opgeslagen voor cel 1 in de scan configuratie en controleer de z-stack doos. Kies ook "gemarkeerd Z-midden van z stack".
    3. In de "blokken" paneel, selecteert u 'enkel blok op elke locatie ". Op "add blokken" voor elk interval te bepalen.
    4. In de "timing" paneel, selecteer "wacht interval" en type "0" in de "wacht-interval voor de blok op eerste locatie alleen". Blokken 2-4 zal hebben "15 min" in deze sectie.
    5. In de locatie paneel, kies "De focus verplaatsen naar positie te laden tussen locaties" en "load config te scannen wanneer 'naar loc' of 'volgende loc' geklikt. Onder de" edit locaties list "kies" Alles wissen "en selecteer" multiple locaties gemotoriseerde stadium ".
    6. UndER de "Bleach" paneel, klik op de "bleekwater" box, en wijzen de configuratie bestand in het "config" pull down menu, zoals aangewezen in het venster van de belangrijkste software. Daarna, in de "bleken" venster, slaat u het juiste fotoactivatie methode. In de regio's panel, kies de ROI voor deze specifieke cel, en voeg deze ROI aan de multitime door te kiezen voor "add huidige regio om de ROI lijst" venster. Zorg ervoor dat u op dezelfde locatie te selecteren in de "ROI" naar beneden te trekken menu.

    Voor de timing goed te laten werken en voor elke cel een interval van 15 minuten te hebben, twee methoden moeten worden opgeslagen. In de lijst met blokken, zal de eerste zijn de "echte" fotoactivatie configuratie, en de rest zal een "mock" configuratie die geen gebruik maakt van de twee-foton laser hebben. Het eerste blok zal ook enige blok die geen vertraging (BKIntv = 0). Derhalve is de werkwijze begint met een basislijn scan, gevolgd door een fotoactivatie scan. De rest van de blokken 900 sec BkIntv enop elk tijdstip er twee scans zoals op tijdstip 0 sec, de timing consistentie.

    1. Voor elk van de 10 cellen gevolgd na verloop van tijd uitvoeren deze volgorde:
      Zoek een PAGFP uiten cel op te slaan zijn imaging methode
      Plaats het podium positie paneel te markeren, geeft u imaging methode
      Belangrijkste ROI panel-kies een regio van belang is voor gefotoactiveerd Bleach zijn panel-save specifieke ROI en ook in de ROI doos te laden:
      Wis de ROI en zet de scan zoom tot en met 1
      Zoek de volgende cel en zet de zoom
      Herhaal dit proces voor de volgende 9 cellen

    Controleer of elke fase locatie en alle blokken de juiste beeldvormende methode (scan configuratie) verbonden zijn. Zorg er ook voor dat het eerste blok op elke locatie komt overeen met de juiste fotoactivatie methode, terwijl de rest bevat een "mock" methode. Tot slot, selecteer "run".

    5. Analyseer de PA-GFP intensiteit van het signaal

    1. Toen de gegevens exporteren naar Excel en bereken het gemiddelde intensiteit voor z-stacks op elk tijdstip. Gooi optische secties die geen signaal te hebben.
    2. Meet het signaal verdunning in elke z-stack door het percentage van het oorspronkelijke gefotoactiveerd signaal.

    Elk gegeven wordt afgetast en geregistreerd tweemaal resulteert in tweevoud z-stack informatie voor elk tijdstip. Controleer of de z-stack waarden mee eens. Zo niet, dat indicatief is voor een probleem (bijv. gericht, celverplaatsing).

    6. Representatieve resultaten

    Bij een fusie voordoet tussen een geactiveerde en niet geactiveerd PA-GFP mitochondrion de PAGFP in de mitochondriale matrix mengt met de niet-gemerkte matrix en wordt verdund over een groter gebied, waardoor het signaalintensiteit (figuur 1a). In de INS1 cel, een significante daling van de intensiteit van het signaal gebeurt elke 15 minuten, totdat een evenwichtstoestand van de mitochondriale fusie is bereikt (ongeveer 1 uur). Merk op dat de cel in figuur 1B bijna volledige colokalisatie van PA-GFP en TMRE signalen vertoont. In deze testen een zeer lage concentratie van TMRE (15 nM) wordt gebruikt om de richten fotoactivering van PAGFP, en de cel gezondheidstoestand. Cellen met een overvloed aan gedepolariseerd mitochondriën zal hebben onvolledige colokalisatie van PAGFP en TMRE en mag niet worden geanalyseerd omdat dit duidt op fototoxiciteit, of cellen in een stervende staat.

    De equilibratietijd voor mitochondriële fusie is meestal 1 uur in INS1 cellen, wanneer ~ 15% van de mitochondriale volume geactiveerd. Soms, zelfs wanneer een klein gedeelte wordt belicht meeste mitochondria worden gefotoactiveerd door te sterk netwerk, in welk geval verdere fusie is moeilijk op te sporen. Andere soorten cellen kunnen vertonen verschillende tijden en evenwicht moeten worden getest met kortere tussenpozen en over een langere periode aan mitochondriaal dynamiek te karakteriseren. Om mitochondriale fusie tegen te gaan, kunnen cellen worden geplaatst binnen een lipotoxic omgeving. Eerder is aangetoond dat 0,4 mM palmitaat fragmenten mitochondriën, en remt de mitochondriale fusie 9. Dit effect is te zien in figuur 2, waarin mitochondria gefragmenteerd, maar de signaalsterkte van het mtPAGFP niet zoveel veranderen onder normale omstandigheden (figuur 1). Daarom is de verdunning van het PA-GFP signaal waarschijnlijk vanwege mitochondriale fusie dan splijting. In andere cellen typen raden met andere bekende methoden om mitochondriaal fragmentatie induceren, zoals silencing OPA1 die nodig is voor mitochondriale fusie 14.

    Figuur 1
    Figuur 1. A. PA-GFP wordt minder helder door mitochondriale fusie gebeurtenissen die tot de verdunning van het eiwit in toenemende gebied te zien is in deze geprojecteerde beelden van 6 optische secties gekwantificeerd om de 15 minuten. B. TMRE met PA-GFP blijkt dat de mitochondriën actief zijn en niet gedepolariseerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

    Figuur 2
    Figuur 2. Mitochondriale fusie geremd met 0,4 mM palmitaat vermindert de verwatering van de PA-GFP. A. Projecties van 6 optische secties met korte mitochondriën met een onveranderlijke signaal intensiteit in de tijd. B. colokalisatie van PA-GFP met TMRE laat zien dat de mitochondriën niet degepolariseerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Deze methode maakt het afbeelden van ongeveer 10 cellen per keer zo verkrijging wordt elke 15 minuten na fotoactivatie. Het exacte aantal cellen is afhankelijk van hoe snel men in staat is te vinden en markeer de mtPAGFP tot expressie brengen binnen de cultuur schotel, en hoe snel kan men stellen alle software parameters. Om de automatisering soepel verloopt een gelijkmatige laag van cellen moet worden gebruikt, omdat de aangewezen z-stack marges zal gelden voor alle cellen.

De omvang van deze eerste fotoactivatie gebied zal van toepassing op de equilibratietijd. Om mitochondriale fusie meten, is het belangrijk om photoactivate slechts 10-20% van het netwerk, zodanig dat de verspreiding van het signaal aan de rest van het netwerk kan worden gecontroleerd tijd. Indien teveel van het netwerk gefotoactiveerd, is het mogelijk dat volledige versmelting optreedt te snel, en de gebeurtenis niet wordt opgenomen.

Men moet uiterst voorzichtig worden genomen omaanpassen laservermogen van twee foton laser en de TMRE concentratie fototoxiciteit waardoor mitochondriale depolarisatie voorkomen. Ervoor zorgen dat de mtPAGFP signaal colocalizes met de TMRE signaal kan helpen bij de beoordeling van fototoxiciteit en algemene gezondheid van de cellen 8,15. Verlichting met epifluoerescent licht dient te worden vermeden. Tijdens het zoeken naar cellen die mtPAGFP, moet de pinhole zijn maximaal geopend tijdens het scannen met een laag vermogen 488nm excitatie. Aanpassen van twee foton laservermogen om photoactivate voldoende PA-GFP het signaal meten gedurende 1 uur maar niet oversaturate een van de cellen kan lastig zijn 8. Maar de tijd moet worden besteed in deze optimalisatie stap, want zodra automatische programma wordt gestart, is het vervelend om het te stoppen, om meer cellen te kiezen en te hervatten.

Voor de kwaliteitscontrole, de verwerving van een differentieel interferentie contrast (DIC) beeld (of doorgelaten licht) om de scherpstelling te controleren op de cellen kunnen zeerbehulpzaam en een goede manier om luchtbellen in de immersie olie tijdens het scannen te detecteren; dat komt uit de bewegingen van het podium.

Hoewel met deze methode mtPAGFP verzamelt gegevens over de unidirectionele beweging van mitochondriale matrixeiwitten van gefotoactiveerd mitochondria die niet gelabeld is het denkbaar om gebruik te maken van deze techniek om andere te bestuderen. Zo kunnen bepaalde fluorochromen worden bevestigd aan membraaneiwitten hun specifieke beweging houden tijdens fusie gebeurtenissen zoals aangetoond voor ABC-me, de combinatie van die optreedt op een ander tijdstip schaal van het mengen van oplosbare matrixeiwitten 15.

Disclosures

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Zeiss, Inc

Acknowledgments

Wij danken de Tufts Center for Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), de mitochondriën Affiniteit Research Collaborative (mtARC), ondersteund door de Evans Centrum voor Interdisciplinair Biomedisch Onderzoek aan de Boston University Medical Campus, Link Medicine Corporation, en Zeiss voor de ondersteuning van dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COXIII-adenoviral PA-GFP Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE Invitrogen T669
Zeiss LSM 710 confocal Carl Zeiss, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
  2. Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
  3. Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  4. Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
  5. Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
  6. Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
  7. Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
  8. Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
  9. Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
  10. Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
  11. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  12. Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100 (2011).
  13. Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
  14. Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
  15. Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
  16. Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
  17. Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
  18. Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).

Tags

Moleculaire Biologie genetica celbiologie natuurkunde confocale microscopie mitochondriën fusion TMRE mtPAGFP INS1 mitochondriale dynamiek mitochondriale morfologie mitochondriale netwerk
Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lovy, A., Molina, A. J. A.,More

Lovy, A., Molina, A. J. A., Cerqueira, F. M., Trudeau, K., Shirihai, O. S. A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (65), e3991, doi:10.3791/3991 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter