En raskere, High Resolution, mtpa-GFP-baserte Mitokondrie Fusion Assay Innhente Kinetic Data om flere celler i parallell Bruke konfokalmikroskopi

Summary

Mitokondrie fusjon ble målt ved å spore ekvilibrering av photoconverted matrix-målrettet GFP over mitokondrie nettverket over tid. Så langt, kunne bare en celle må utsettes for en times lang kinetisk analyse av gangen. Vi presenterer en metode som samtidig måler flere celler, og dermed påskynde datainnsamlingen.

Protocol

1. Bilde Plate Forberedelse

1. Kultur INS1 celler i RPMI medier som inneholder 10% standard fosterets bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 2 mm L-glutamin, 50 mM 2-mercaptoethanol, 5 mm NaHCO _3, 2 mm HEPES, 2 mm pyruvic syre, og 11 mm glukose til 80% samløpet.
2. Trypsinize de INS1 cellekulturer med 0,05% trypsin og plate dem på poly-D-lysin belagte dekkglass bunn bildebehandling plater (30-40% samløpet).
3. Tillat for plater til nå 60-80% samløpet (~ 2 dager) og legge mitokondriematrix målrettet (COXVIII) adenoviral PA-GFP for 24 timer (MOI = 5). Utveksle media og tillate celler til å vokse ytterligere 2 dager før bildebehandling.
4. På dagen for bildebehandling, legger 7-15 nM TMRE til bildebehandling platene, og stabilisering i minst 45 min.
5. I løpet av denne tiden sving på inkubatoren (stadium topp inkubatoren har vært brukt her) og la mikroskop for å stabilisere til 37 ° C i ca 1 time. Slå på 5% CO _2.

   2. Imaging Parametere for Zeiss LSM 710 confocal mikroskop

   1. Etter mikroskopet har likevekt, under Acquisition kategorien Klikk på "Vis manuelle verktøy", åpner bildebehandling satt opp panel, og velg "kanal mode" og bytte spore hver "frame".
   2. I lys sti panelet, velger LSM og kanal modus. Arbeide fra prøven ikonet oppover, velg "bak", MBS 690 + og MBS 488. På bunnen av panelet, velg "T-PMT" for å aktivere visualisering av den lyse felt eller DIC kanal.
   3. Fullfør justere lysbanen parametere ved å angi området for GFP fargestoff til 490-540 nm og 580-700 nm for TMRE fargestoff.
   4. I oppkjøpet modus bruker en 512 × 512 piksler skanning feltet, gjennomsnittlig 4x, og velger en zoom faktor (som du kanskje ønsker å beholde konsekvent for kalibrering).

   3. Optimalisere Imaging Parametere

   1. Bruke planen apochromat 100x (1,4 NA) objektiv, focoss på dine celler med halogen lys, ikke fluorescerende lys, for å beskytte mitokondriene fra fototoksisitet.
   2. Screen for PA-GFP uttrykke celler ved hjelp av en maksimalt åpen pinhole og skanning for å finne de cellene som er lysere grønt.
   3. Finn laveste kraft to-foton laser for å aktivere PA-GFP og optimalisere tenkelig parametre som sikrer at signalet ikke mette detektoren. Sjekk at PA-GFP signal colocalizes med TMRE signal for noen z-serien. Tap av TMRE signal indikerer mitokondrie depolarization eller fototoksisitet, og cellene utviser disse egenskapene bør ikke brukes for analyse.
   4. Finn en PA-GFP uttrykke celle og angi en zoomfaktor.
   5. Angi z-serien rekkevidde å samle 6 skiver (dette området må tilfredsstille alle 10 celler med mindre en bestemt z-fokus er satt på hver posisjon).
   6. Lagre bildebehandling metoden for hver celle (celle 1, celle 2 osv.).

   4. Juster Automatiserd delen av programmet og utpeke de 10 cellene du vil følge for en time Mitokondriemyopati Fusion Assay

   1. På venstre panel i multitime vinduet, velg "lagre"-panelet, og angi hvor filene skal lagres.
   2. I "Acquisition" panel, laste oppkjøpsmetoden spart for celle 1 i skanningen konfigurasjon og sjekk z stabelen boksen. Også velge "merket Z-midten av z stack".
   3. I "blokker" panel, velg "enkelt blokk på hvert sted". Klikk på "Legg blokker" for hvert intervall skal måles.
   4. I "timing" panel, velg "vente intervall" og skriv "0" i "ventetiden før til blokk på første sted bare". Blokkerer 2-4 vil ha "15 min" i denne delen.
   5. I stedet panelet, velg "flytte fokus for å laste posisjon mellom steder" og "last skanne config når 'flytter til loc" eller "neste loc" klikket. Under "Rediger steder liste" velger du "tømme alle" og deretter velge "multiple steder motorisert scenen ".
   6. UndAkutten på "Bleach" panel, klikk på "Bleach" boksen, og utpeke konfigurasjonsfilen i "config" nedtrekksmenyen, som angitt i vinduet av de viktigste programvaren. Deretter, i "bleking"-vinduet, lagre den aktuelle photoactivation metoden. I regionene panelet, velger ROI for denne cellen, og legge denne avkastningen til multitime ved å velge "Legg til gjeldende region til ROI liste"-vinduet. Pass på å velge samme sted i "avkastningen" nedtrekksmenyen.

   For timingen skal fungere og for hver celle å ha en 15 minutters intervall, to metoder må bli frelst. I listen over blokker, vil den første ha "ekte" photoactivation konfigurasjon, og resten vil ha en "mock"-konfigurasjon som ikke bruker to-foton laser. Den første blokken vil også være den eneste blokk som ikke har en forsinkelse (BKIntv = 0). Derfor begynner metoden med en baseline skanning, etterfulgt av en photoactivation scan. Resten av blokkene har en 900 sek BkIntv, ogpå hvert tidspunkt er det to skanninger like ved tidspunkt 0 sek, for å opprettholde timing konsistens.

   7. For hver av de 10 cellene som skal følges over tid, utføre denne sekvensen:
      Finn en PAGFP uttrykke celle-redde sin bildebehandling metode
      Sted panel-merke scenen posisjon, angir avbildning metode
      Hoved ROI panel-velge en region av interesse å være photoactivated Bleach panel-lagre spesifikk ROI og også legge det i ROI-boksen:
      Slette ROI og tilbakestille skanning zoom til 1
      Finn den neste cellen, og angi zoom
      Gjenta prosessen for de neste 9 celler

   Kontroller at hver fase plassering og alle blokkene har riktig bildebehandling metoden (skanning konfigurasjon) tilknyttet. Pass også på at den første blokken på hvert sted tilsvarer den aktuelle photoactivation metoden mens resten inneholde en "mock"-metoden. Til slutt, velg "kjør".

   5. Analyser PA-GFP Signal Intensity

   1. Deretter eksportere data til Excel og beregne gjennomsnittlig intensitet for z-klippene på hvert tidspunkt. Kast optiske seksjoner som ikke har signal.
   2. Mål signalet fortynning i hvert z-stack ved å beregne hvor stor prosentandel av den opprinnelige photoactivated signalet.

   Hvert datapunkt er skannet og registrert to ganger, noe som resulterer i duplikat z-stack for hvert tidspunkt. Kontroller at z-stack verdier enig. Hvis ikke, dette er en indikasjon på et problem (f.eks fokus, celle bevegelse).

   6. Representative Resultater

   Når en fusjon hendelse oppstår mellom en aktivert og ikke-aktivt PA-GFP mitokondrie, blander PAGFP innenfor mitokondriematrix med ikke-merket matrise og blir fortynnet over et større område, redusere signalintensitet (Figur 1A). I INS1 cellen, oppstår en betydelig nedgang i signal intensitet hvert 15. minutt, inntil likevekt av mitokondriell fusion er nådd (ca. 1 time). Merk at cellen i figur 1B viser nesten komplett colocalization av PA-GFP og TMRE signaler. I disse analysene en svært lav konsentrasjon av TMRE (15 nM) brukes til å målrette den photoactivation av PAGFP, og også for å overvåke celle helse. Celler med en overflod av depolarized mitokondriene vil ha ufullstendig colocalization av PAGFP og TMRE og bør ikke bli analysert fordi dette indikerer enten fototoksisitet, eller celler i en døende tilstand.

   Den ekvilibrering tid for mitokondrie fusjon er som regel en time i INS1 celler, da ~ 15% av mitokondrie volumet er aktivert. Noen ganger, selv om et lite område lyser, de fleste av mitokondrier blir photoactivated grunn til å være svært nettverk, i så fall ytterligere fusjon er vanskelig å oppdage. Andre celletyper kan utvise forskjellige ekvilibrering tider og bør testes med kortere intervaller og over en lengre periode for å karakterisere mitokondrielle dynamikk. Å hemme mitokondrie fusjon, kan cellene plasseres innenfor en lipotoxic miljø. Det har tidligere blitt vist at 0,4 mm palmitate fragmenter mitokondrier, og hemmer mitokondrienes fusjon ^9. Denne effekten kan sees i figur 2, hvor mitokondriene er fragmentert, men signalet intensiteten av mtPAGFP ikke endres så mye som under normale forhold (Figur 1). Derfor er det fortynning av PA-GFP signal sannsynligvis skyldes mitochondrial fusion snarere enn fisjon. I andre celler typer, foreslår vi at du bruker andre kjente måter å indusere mitochondrial fragmentering, som for eksempel stanse OPA1 som er nødvendig for mitochondrial fusion ^14.

   
   Figur 1. A. PA-GFP blir gradvis dimmer pga mitokondrielle fusion hendelser som fører til utvanning av protein over et økende område som kan bli sett i disse projiserte bilder 6 optiske seksjoner kvantifisert hvert 15. minutt. B. TMRE med PA-GFP viser at mitokondriene er aktive og ikke depolarized. Klikk her for å se større figur .

   
   Figur 2. Mitokondrie fusjon hemmet med 0,4 mm palmitate reduserer fortynning av PA-GFP. A. Framskrivinger av 6 optiske seksjoner som viser kort mitokondrier med en uforanderlig signal intensitet over tid. B. Colocalization av PA-GFP med TMRE viser at mitokondriene ikke depolarisert. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Denne metoden gir mulighet for avbildning av rundt 10 celler på en gang, hvis oppkjøpet skjer hvert 15. minutt etter photoactivation. Det nøyaktige antall celler vil avhenge av hvor raskt man er i stand til å lokalisere og markere de mtPAGFP uttrykker cellene i kultur parabolen, og hvor raskt man kan sette opp alle de programvare parametere. For å gjøre automatisering fungere smertefritt et jevnt lag av celler bør brukes fordi de utpekte z-stack marginer vil gjelde for alle celler.

Størrelsen på denne første photoactivation området vil styre ekvilibrering tid. For å kunne måle mitokondrielle fusion, er det viktig å photoactivate bare 10-20% av nettet, slik at spredning av signalet til resten av nettverket kan overvåkes over tid. Hvis for mye av nettverket er photoactivated, er det mulig at fullstendig fusjon vil skje for raskt, og arrangementet vil ikke bli fanget opp.

Ekstrem forsiktighet må tas for åjustere laser makt av de to-foton laser samt TMRE konsentrasjon for å unngå fototoksisitet som fører til mitochondrial depolarization. Sikre at mtPAGFP signalet colocalizes med TMRE signal kan hjelpe i vurderingen fototoksisitet og generell celle helse ^8,15. Illumination med epifluoerescent lys bør unngås. Mens du søker etter celler uttrykker mtPAGFP bør pinhole være maksimalt åpen mens du skanner med en lav effekt 488nm eksitasjon. Justere to-foton laser makt til photoactivate nok PA-GFP å måle signal over en time, men ikke til oversaturate noen av cellene kan være vanskelig ^åtte. Imidlertid bør tiden bli brukt i denne optimaliseringen trinnet fordi når automatisert program er startet, er det kjedelig å stoppe det, å velge flere celler, og gjenoppta.

For kvalitetskontroll, oppkjøp av en differensial interferens kontrast (DIC) bilde (eller overføres lys) for å overvåke fokus på cellene kan være sværtnyttig og også en god måte å oppdage bobler dannes i immersjonsolje under skanning, dette skjer noen ganger fra bevegelser på scenen.

Selv om du bruker denne mtPAGFP metoden samler data om enveis bevegelse mitokondriematrix proteiner fra photoactivated mitokondriene til de som ikke er merket, er det tenkelig å benytte denne teknikken til å studere andre prosesser. For eksempel kan konkrete fluorokromer festes til membran proteiner for å observere deres spesifikke bevegelser under fusion arrangementer, som har blitt vist for ABC-meg, sammensmeltingen som skjer på et annet tidspunkt skala fra en blanding av løselige matrix proteiner ^15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Carl Zeiss, Inc.