Summary
Fusão mitocondrial foi medida seguindo o equilíbrio da GFP matriz segmentada photoconverted através da rede mitocondrial ao longo do tempo. Até agora, apenas uma célula possa ser sujeita a uma análise de longo horas cinética de cada vez. Nós apresentamos um método que mede simultaneamente várias células, acelerando assim o processo de coleta de dados.
Protocol
1. Preparação Placa Imagem
- Cultura INS1 células em meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino padrão, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM de NaHCO3, 2 mM de HEPES, 2 mM de ácido pirúvico, e 11 mM de glucose a 80% de confluência.
- Trypsinize as culturas de células INS1 com tripsina a 0,05% ea placa-los em poli-D-lisina placas revestidas com lamela de fundo de imagem (% de confluência 30-40).
- Permitir para placas de atingir confluência de 60-80% (~ 2 dias) e adicionar matriz mitocondrial alvo (COXVIII) adenoviral PA-GFP durante 24 horas (MOI = 5). Meios câmbio e permitem que as células a crescer por mais 2 dias antes de imagem.
- No dia da imagem, adicionar 7-15 TMRE nM para as placas de imagem, e equilibrar durante pelo menos 45 min.
- Durante este por sua vez, tempo na incubadora (fase superior incubadora tem sido usado aqui) e permitir que o microscópio para equilibrar a 37 ° C durante cerca de 1 hora. Ligue o 5% de CO 2.
- Após o microscópio tem equilibrado, sob a guia de Aquisição, clique em "Ferramentas manual mostram", abra a imagem criada painel e escolha "modo de canal" e mude acompanhar cada "frame".
- No painel caminho da luz, escolha LSM e modo de canal. Trabalhando a partir do ícone do espécime para cima, selecione "traseiro", MBS 690 +, e MBS 488. Na parte inferior do painel, escolher "T-PMT", para permitir a visualização do campo brilhante ou canal DIC.
- Termine o ajuste dos parâmetros de caminho de luz, definindo o intervalo para o corante GFP para 490-540 nm e 580-700 nm para o corante TMRE.
- No modo de aquisição, use um de 512 × 512 pixels campo de leitura, 4x médios, e escolher um fator de zoom (que você pode querer manter consistente para fins de calibração).
- Usando o Apochromat plano 100x (1,4 NA) lente objetiva, focnos em suas células com a luz halógena não, luz fluorescente, para proteger as mitocôndrias de fototoxicidade.
- Tela para PA-GFP células que expressam através de um orifício aberto e máxima de varredura para encontrar as células que são mais brilhantes verde.
- Encontrar a mais baixa potência do laser 2-fotão necessária para activar a PA-GFP e optimizar os parâmetros de imagem que assegurem que o sinal não saturar o detector. Verificar que o sinal PA-GFP colocalizes com o sinal de TMRE para poucos z-série. Perda do sinal de TMRE indica despolarização mitocondrial ou fototoxicidade, e as células apresentando estas características não deve ser utilizado para a análise.
- Encontre uma célula PA-GFP expressar e especificar um fator de zoom.
- Defina o intervalo de z-série para coletar 6 fatias (este intervalo será necessário para satisfazer todas as 10 células a menos que um específico z foco é definida em cada posição).
- Salve o método de imagem para cada célula (célula 1, célula 2 etc.)
- No painel esquerdo da janela multitime, selecione a opção "salvar" do painel, e especifique o local onde os arquivos serão salvos.
- Em a "Aquisição" do painel, carregue o método de aquisição salvo para a célula 1 na configuração de digitalização e marque a caixa de pilha z. Além disso, escolha "marcado Z-meio da pilha z".
- No "blocos" do painel, selecione "bloco único em cada local". Clique em "Adicionar" blocos para cada intervalo a ser medido.
- No "timing" do painel, selecione "esperar intervalo" e digite "0" no "intervalo de espera antes de bloco no primeiro local só". Blocos 2-4 terá "15 minutos" nesta seção.
- No painel Local, escolha "mover o foco para carregar posição entre os locais" e "carga varredura config quando 'mover-se para loc" ou "próximo loc' clicado. Sob a" lista de locais de edição "escolher" limpar tudo "e selecione" múltipla locais motorizada palco ".
- Under o "Bleach" do painel, clique em "branquear" caixa, e designar o arquivo de configuração no "config" no menu suspenso, como designado na janela do software principal. Em seguida, no "branqueamento" janela, salve o método de fotoativação apropriado. No painel regiões, escolha o ROI dessa célula em particular, e adicionar este ROI para o multitime escolhendo "região atual adicionar à lista de ROI" janela. Certifique-se de selecionar o mesmo local na "ROI" no menu suspenso.
- Para cada uma das 10 células a serem seguidos ao longo do tempo, realizar esta sequência:
Encontre um PAGFP expressar células salvar seu método de imagem
Localização do painel de marcar a posição etapa, especificar o método de imagem
Principal ROI painel de escolher uma região de interesse para ser Bleach fotoativado painel de salvar ROI específico e também carregá-lo na caixa de ROI:
Apague o ROI e redefinir o zoom varredura a 1
Encontrar a próxima célula e definir o zoom
Repetir o processo para os próximos 9 células - Em seguida, exportar os dados para o Excel e calcular a intensidade média de z-pilhas em cada momento. Descartar secções ópticas que não têm nenhum sinal.
- Medir a diluição do sinal em cada pilha z-através do cálculo da percentagem do sinal original fotoativado.
2. Parâmetros de imagem para a LSM 710 microscópio confocal Zeiss
3. Otimizar os parâmetros de imagem
4. Ajuste o AutomateParcela d do Programa e designar as 10 células a serem seguidas para o 1 ensaio de fusão Hora mitocondrial
Para a temporização para funcionar correctamente e para cada célula de ter um intervalo de 15 minutos, dois métodos necessitam de ser guardada. Na lista de blocos, o primeiro terá a configuração de fotoativação "real", eo resto vai ter uma configuração "mock" que não usa o laser de dois fótons. O primeiro bloco também será o único bloco que não tem um atraso (BKIntv = 0). Portanto, o método começa com um exame inicial, seguido de uma verificação de fotoactivação. O resto dos blocos têm um 900 seg BkIntv, eem cada ponto de tempo, existem dois exames assim como em tempo de 0 segundos, para manter a consistência de temporização.
Verifique se cada local palco e todos os blocos têm o método de imagem adequado (scan configuração) associado. Também certifique-se que o primeiro bloco em cada local corresponde ao método de fotoativação apropriado, enquanto o resto conter um método "mock". Finalmente, selecione "executar".
5. Analisar a intensidade do sinal PA-GFP
Cada ponto de dados é digitalizado e registada duas vezes, resultando em informações z pilha duplicado para cada ponto de tempo. Verifique se os valores z-stack concordar. Se não, o que é indicativo de um problema (por exemplo, o foco do movimento das células,).
6. Os resultados representativos
Quando um evento de fusão ocorre entre uma activado e não-activado PA-GFP mitocôndria, o PAGFP dentro da matriz mitocondrial mistura-se com a matriz não-etiquetados e torna-se diluída sobre uma área maior, diminuindo o sinalintensidade (Figura 1A). Na célula INS1, uma diminuição significativa da intensidade do sinal ocorre a cada 15 minutos, até que o equilíbrio de fusão mitocondrial foi atingido (aproximadamente 1 hora). Note-se que a célula na Figura 1B apresenta colocalização quase completo de PA-GFP e os sinais de TMRE. Nestes ensaios uma concentração muito baixa de TMRE (15 nM) é usado para ajudar a atingir o fotoactivação de PAGFP, e também para controlar a saúde célula. As células com uma abundância de mitocôndrias despolarizada terá colocalização incompleta de PAGFP e TMRE e não devem ser analisados, porque isso indica quer fototoxicidade, ou células num estado de morrer.
O tempo de equilíbrio para a fusão mitocondrial é geralmente de 1 hora em INS1 células, quando ~ 15% do volume mitocondrial é activado. Às vezes, mesmo se uma pequena área é iluminada, a maioria das mitocôndrias tornar-se fotoativados devido a ser altamente rede, caso em que a fusão adicional é difícil de detectar. Outros tipos de células podem apresentar tempos de equilíbrio diferentes, e devem ser testados em intervalos mais curtos e mais de um período mais longo para caracterizar a dinâmica mitocondriais. Para inibir a fusão mitocondrial, as células podem ser colocadas dentro de um ambiente lipotoxic. Foi previamente demonstrado que 0,4 mM palmitato fragmentos mitocôndrias, e inibe a fusão mitocondrial 9. Este efeito pode ser visto na Figura 2, onde as mitocôndrias são fragmentados, mas a intensidade do sinal da mtPAGFP não muda, tanto quanto sob condições normais (Figura 1). Portanto, a diluição do sinal PA-GFP é provável que seja devido à fusão mitocondrial em vez de fissão. Em outros tipos de células, sugerimos utilizando outros métodos conhecidos para induzir a fragmentação mitocondrial, tais como o silenciamento OPA1 que é necessária para a fusão mitocondrial 14.
Figura 1. A. PA-GFP se torna progressivamente mais escura devido a eventos de fusão mitocondriais que conduzem à diluição da proteína sobre uma área crescente como pode ser visto nestas imagens projectadas de 6 secções ópticas quantificado em intervalos de 15 minutos. B. TMRE com PA-GFP mostra que as mitocôndrias são ativos e não despolarizada. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Fusão mitocondrial inibida com 0,4 mM de palmitato diminui a diluição de PA-GFP. A. Projecções de 6 secções ópticas mostrando mitocôndrias curto com uma intensidade de sinal imutável ao longo do tempo. B. colocalização de PA-GFP com TMRE mostra que as mitocôndrias não são depolarizada. Clique aqui para ver maior figura .
Discussion
Este método permite a criação de imagens de cerca de 10 células de cada vez, se a aquisição ocorre a cada 15 minutos após a fotoactivação. O número exato de células dependerá da rapidez com que um é capaz de localizar e marcar as células que expressam mtPAGFP dentro da placa de cultura, e quão rapidamente pode-se configurar todos os parâmetros de software. Para fazer a automação de correr suavemente uma camada uniforme de células deve ser usado porque os designados z-stack margens será aplicada para todas as células.
O tamanho desta área fotoactivação inicial regerá o tempo de equilíbrio. Para ser capaz de medir a fusão mitocondrial, é importante para a fotoativação apenas 10-20% da rede, de tal modo que a propagação do sinal para o resto da rede pode ser monitorizado ao longo do tempo. Se for muito grande parte da rede é fotoativados, é possível que a fusão completa irá ocorrer muito rapidamente, eo evento não será capturada.
Cuidado extremo deve ser levado paraajustar a potência do laser do laser de dois fotões, bem como a concentração TMRE para evitar fototoxicidade o que leva a despolarização mitocondrial. Garantir que o sinal mtPAGFP colocalizes com o sinal TMRE pode ajudar a avaliar a fototoxicidade e de saúde geral das células 8,15. Iluminação com luz epifluoerescent deve ser evitada. Embora a pesquisa de células que expressam mtPAGFP, o pinhole deve ser maximamente aberto durante a digitalização com uma excitação de baixa potência 488 nm. Ajustando a potência do laser de dois fotões para a fotoativação suficiente PA-GFP para medir o sinal ao longo de 1 hora, mas não para oversaturate qualquer uma das células pode ser complicado 8. Entretanto, o tempo deve ser gasto nesta etapa de otimização porque o programa uma vez automatizado é iniciado, ele é entediante para pará-lo, para escolher mais células, e currículo.
Para controle de qualidade, a aquisição de um contraste de interferência diferencial (DIC) imagem (ou luz transmitida) para monitorar o foco sobre as células podem ser muitoútil e também uma boa maneira de detectar bolhas formadas no óleo de imersão durante a digitalização, o que por vezes acontece a partir dos movimentos do palco.
Apesar de usar esse método mtPAGFP reúne dados sobre o movimento unidirecional de proteínas da matriz mitocondrial da mitocôndria fotoativado para aqueles que não estão rotulados, é concebível para utilizar esta técnica para estudar outros processos. Por exemplo, fluorocromos específicos pode ser ligado a proteínas de membrana para observar o seu movimento específico durante eventos de fusão, como foi mostrado para ABC-me, a fusão de que ocorre numa escala de tempo diferente a partir da mistura de proteínas da matriz solúveis 15.
Disclosures
Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Zeiss, Inc.
Acknowledgments
Agradecemos ao Centro Tufts para Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), a mitocôndria Affinity Pesquisa Colaborativa (mtARC), apoiado pelo Centro de Investigação Biomédica Evans Interdisciplinar da Universidade de Boston Medical Campus, Medicine Corporation Link, e Zeiss para apoiar este trabalho.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
COXIII-adenoviral PA-GFP | Dr. Lippincott-Schwartz | ||
TMRE | Invitrogen | T669 | |
Zeiss LSM 710 confocal | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
- Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
- Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
- Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
- Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
- Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
- Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
- Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
- Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
- Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100 (2011).
- Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
- Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
- Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
- Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
- Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
- Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).