Summary
Митохондриальная слияние измерялась путем отслеживания уравновешивания photoconverted матрицы ориентированных GFP через митохондриальную сеть с течением времени. До сих пор только одна клетка может быть подвергнут в течение часа кинетического анализа одновременно. Мы представляем метод, который одновременно измеряет несколько ячеек, тем самым ускоряя процесс сбора данных.
Protocol
1. Подготовка Image Plate
- INS1 культуры клеток в RPMI среде, содержащей 10% стандартного фетальной телячьей сыворотки, 1% пенициллина стрептомицин, 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 5 мМ NaHCO 3, 2 мМ HEPES, 2 мМ пировиноградной кислоты и 11 мМ глюкозы до 80% слияния.
- Trypsinize INS1 клеточных культур с 0,05% трипсина и пластины их на поли-D-лизин покрытые покровным дном изображения пластин (30-40 слияния%).
- Разрешить для пластин достичь 60-80% слияния (~ 2 дня) и добавить митохондриях целевых (COXVIII) аденовирусной PA-GFP в течение 24 часов (МВД = 5). Биржа средств массовой информации и позволяет клеткам расти в течение еще 2 дней до съемки.
- В день изображение, добавить 7-15 нм TMRE на изображение тарелки, и равновесие, по крайней мере 45 мин.
- За это время очередь на инкубаторе (стадия топ инкубатор был использован здесь), и позволяет под микроскопом, чтобы уравновесить до 37 ° С в течение около 1 часа. Включите 5% CO 2.
2. Параметры изображения Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии
- После того, как микроскоп имеет уравновешенный, по приобретению, щелкните на "шоу ручного инструмента», открыть изображение настроить панели и выберите "Режим канала" и перейти отслеживать каждый "кадр".
- В свете панель пути, выберите МНК и канальном режиме. Исходя из образца значок вверх, выберите "тыла", MBS 690 +, и MBS 488. В нижней части панели, выберите "T-PMT", чтобы включить визуализацию светлом поле или ДВС канала.
- Завершите настройки параметров источника света путь, установив диапазон красителей GFP в 490-540 нм и 580-700 нм для красителей TMRE.
- В приобретении режиме, используется 512 × 512 пикселей сканирование поля, средняя 4x, а также выбрать коэффициент увеличения (который вы можете сохранить последовательную для калибровки).
3. Оптимизация изображений Параметры
- Используя план апохромат 100x (1.4 NA) объектива, ФОКнам на клетки с галогенной лампы, а не дневной свет, чтобы защитить митохондрий фототоксичности.
- Экран для PA-GFP выражения клетки, используя максимально открытым отверстием и сканирование, чтобы найти клетки, которые являются ярким зеленым цветом.
- Найти самые низкие мощности 2-фотонов лазер для активации PA-GFP и оптимизации параметров изображения обеспечение того, чтобы сигнал не насыщают детектора. Убедитесь, что PA-GFP сигнал локализуется с TMRE сигнала в течение нескольких Z-серии. Потеря TMRE сигнал указывает митохондриальной деполяризации или фототоксичности, и клетки, обладающие этими характеристиками не должны использоваться для анализа.
- Найти PA-GFP выражение клеток и определить коэффициент масштабирования.
- Установите Z-серии диапазон собрать 6 ломтиков (этот диапазон необходимо, чтобы удовлетворить все 10 ячеек, если конкретный г-фокус устанавливается на каждую позицию).
- Сохранение изображений методом для каждой ячейки (ячейка 1 ячейка 2 и т.д.).
4. Отрегулируйте Автоматизацияг часть программы и назначает 10 клеток вы будете следовать за 1 час митохондриальной Анализ Fusion
- На левой панели multitime окне выберите "экономия" панели и указать место, где будут сохранены файлы.
- В "Приобретение" панель загрузки приобретение метод сохранен для сотовых 1 в конфигурации сканирования и установите флажок Z стека. Также выберите "отмечены Z-средний стек я".
- В "блоков" панель, выберите пункт "одного блока в каждой точке". Нажмите на кнопку "Добавить блоки" для каждого интервала должна быть измерена.
- В "времени" панель, выберите пункт "подожди интервал" и типа "0" на "ожидание интервала до блока на первом месте только". Блоки 2-4 будет иметь "15 минут" в этом разделе.
- В расположение панели, выберите "переместить фокус, чтобы загрузить положение между местах" и "нагрузки сканирование конфигурации, когда" перейти к LOC »или« следующий LOC "нажата. Под" редактировать список мест "выберите" удалить все ", а затем выберите" несколько местах моторизованных этапе ".
- Undэ "Bleach", нажмите кнопку "Bleach" поле и назначить файл конфигурации в "конфигурации" выпадающее меню, как это обозначено в окне основного программного обеспечения. Тогда, в "отбеливание" окно, сохранить соответствующий метод фотоактивации. В панели регионов, выбирать ROI для этой клетки, и добавить к ROI multitime, выбрав "Добавить текущую область ROI список" окна. Не забудьте выбрать и том же месте в "ROI" выпадающего меню.
Для времени, чтобы работать должным образом, и для каждой ячейки, чтобы иметь 15-минутный интервал, два метода должны быть сохранены. В списке блоков, первый из которых будет иметь "реальный" фотоактивации конфигурации, а остальное будет "макет" конфигурации, которые не используют двухфотонного лазера. Первый блок также будет только блок, который не имеет задержку (BKIntv = 0). Таким образом, метод начинается с одного базового сканирования, а затем фотоактивации сканирования. Остальные блоки имеют 900 сек BkIntv ив каждый момент времени существует два сканирования так же, как во время 0 секунд, чтобы сохранить временные последовательности.
- Для каждой из 10 клеток, которым необходимо следовать в течение долгого времени, выполните следующую последовательность действий:
Найти PAGFP выражения клеточной сохранить его изображение методом
Расположение панели, отметьте положение этапе, указать метод визуализации
Главная ROI-панели выбрать регион представляет интерес для фотоактивируемые быть Bleach-панели сохранить определенный ROI, а также загрузить его в поле ROI:
Стереть ROI и сбросить сканирование зум 1
Найти следующую ячейку и установить масштаб
Повторите эту процедуру для следующих 9 клеток
Убедитесь, что каждой точке сцены и все блоки имеют соответствующий метод съемки (сканирование конфигурации) связаны. Также убедитесь, что первый блок на каждом месте, соответствующем методе фотоактивации а остальные содержат "макет" методом. Наконец, выберите "Выполнить".
5. Анализ PA-GFP интенсивности сигнала
- Затем экспортировать данные в Excel и расчета средней интенсивности для Z-стеки в каждый момент времени. Отменить оптических срезов, которые не имеют сигнала.
- Измерьте сигнал разведение в каждом Z-Stack путем расчета доли оригинальных фотоактивируемые сигнала.
Каждая точка данных сканируется и зарегистрировано в два раза, в результате чего в двух экземплярах Z-Stack информации для каждого момента времени. Убедитесь, что Z-Stack значения согласуются. Если нет, это указывает на проблемы (например, фокус, сотовые движения).
6. Представитель Результаты
Когда событие происходит слияние между активированной и неактивированной PA-GFP митохондрии, PAGFP в митохондриях смешивается с немеченого матрица и становится разбавляется по большей площади, уменьшая сигналинтенсивности (рис. 1а). В камере INS1, значительное снижение интенсивности сигнала происходит каждые 15 минут, пока равновесие митохондриальной слияние было достигнуто (около 1 часа). Обратите внимание, что клетки на рисунке 1b показывает почти полное колокализации PA-GFP и TMRE сигналов. В этих тестах очень низкой концентрации TMRE (15 нМ) используется, чтобы помочь целевой фотоактивации PAGFP, а также для контроля здоровья клетки. Клетки с обилием деполяризованного митохондрий будет неполным колокализации PAGFP и TMRE и не должны быть проанализированы, потому что это указывает на фототоксичности, или клетки, в умирающем состоянии.
Уравновешивание время митохондриальной слияния, как правило, 1 час в INS1 клеток, при ~ 15% от объема митохондриального активирована. Иногда, даже если небольшой площади горит, большинство из митохондрий стать фотоактивируемые из-за того, что взаимосвязано, и в этом случае дальнейшее слияние трудно обнаружить. Другие типы клеток могут проявлять разные времена равновесие и должны быть проверены на короткие промежутки времени и на более длительный период, чтобы охарактеризовать митохондриальной динамику. Для подавления митохондриального синтеза, клетки могут быть размещены в lipotoxic окружающей среды. Ранее было показано, что 0,4 мМ пальмитата фрагменты митохондрий, а также ингибирует митохондриальный слияние 9. Этот эффект можно увидеть на рисунке 2, где митохондрии фрагментированы, но интенсивности сигнала mtPAGFP не меняется, насколько при нормальных условиях (рис. 1). Таким образом, разведение PA-GFP сигнал может быть связана с митохондриальной слияние, а не деления. В других типах клеток, мы предлагаем использовать другие известные способы, чтобы вызвать фрагментацию митохондриальных, такие как глушители OPA1 которая необходима для митохондриальных слияния 14.
Рисунок 1. А. PA-GFP становится все регулятор в связи с митохондриальной событий слияние приводит к размыванию белка на увеличение области, можно увидеть в эти проецируемого изображения 6 оптических срезов количественно каждые 15 минут. Б. TMRE с PA-GFP показывает, что митохондрии являются активными и не деполяризованной. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Митохондриальная слияние тормозится 0,4 ммоль пальмитата уменьшает размывание PA-GFP. A. Прогнозы 6 оптических срезов показывает короткий митохондрий с неизменной интенсивностью сигнала с течением времени. Б. колокализации PA-GFP с TMRE показывает, что митохондрии не деполяризованным. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Discussion
Этот метод позволяет визуализации около 10 клеток на время, если приобретение происходит каждые 15 минут после фотоактивации. Точное количество ячеек будет зависеть от того, насколько быстро человек способен находить и отмечать mtPAGFP экспрессирующие клетки в культуре блюдо, и как быстро можно настроить все параметры программы. Для автоматизации гладко даже слой клеток должны быть использованы, поскольку назначенный Z-Stack поля будет применяться для всех ячеек.
Размер этой первоначальной площади фотоактивации будет регулировать равновесие времени. Для того, чтобы измерять митохондриального синтеза, важно photoactivate только 10-20% от сети, например, что распространение сигнала к остальной части сети можно контролировать с течением времени. Если слишком много сети фотоактивируемые, вполне возможно, что полное слияние будет происходить слишком быстро, и это событие не будет захвачен в плен.
Экстремальный необходимо позаботиться, чтобырегулировать мощность лазера в двухфотонного лазера, а также TMRE концентрации, чтобы избежать фототоксичности что приводит к митохондриальной деполяризации. Обеспечение того, чтобы сигнал mtPAGFP локализуется с сигналом TMRE может помочь в оценке фототоксичности и общее состояние здоровья ячейки 8,15. Освещение с epifluoerescent света следует избегать. В поисках клеток, экспрессирующих mtPAGFP, отверстие должно быть максимально открытыми при сканировании с низким возбуждения 488nm власти. Регулировка двухфотонного лазерного власти photoactivate достаточно PA-GFP для измерения сигнала в течение 1 часа, но не oversaturate любой из ячеек может быть сложно 8. Тем не менее, время должно быть потрачено в этом оптимизация шаг, потому что как только автоматизированная программа запущена, это утомительно, чтобы остановить его, чтобы выбрать несколько ячеек, и резюме.
Для контроля качества, получение дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображение (или проходящего света), чтобы контролировать фокус на клетки может быть оченьполезно, а также хороший способ обнаружить пузырьки образуются в масле погружение во время сканирования, это иногда случается с движениями на сцене.
Хотя с помощью этого метода mtPAGFP собирает данные о однонаправленного движения митохондриальные белки матрицы из фотоактивируемые митохондрий те, которые не обозначены, вполне возможно, использовать этот метод для изучения других процессов. Например, конкретные флуорохромами могут быть присоединены к мембранным белкам наблюдать за их конкретные движения во время слияния событий, как это было показано на ABC-мне, слияние, которое происходит на различных временных масштабах от смешивания растворимых белков матрицы 15.
Disclosures
Производство и свободного доступа к этой статье спонсируется Zeiss, Inc
Acknowledgments
Мы благодарим Центр Тафтса в области нейронаук, P30 NS047243 (Jackson), митохондрии Affinity Исследования совместной (mtARC) при поддержке Центра Эванс междисциплинарных биомедицинских исследований Бостонского университета Медицинской Campus, Корпорация ссылка медицины и Zeiss за поддержку этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COXIII-adenoviral PA-GFP | Dr. Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocal | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
- Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
- Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
- Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
- Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
- Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
- Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
- Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
- Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
- Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100 (2011).
- Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
- Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
- Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
- Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
- Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
- Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).
