Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Published: July 20, 2012 doi: 10.3791/3991

Summary

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Protocol

1. Görüntü Plaka Hazırlık

  1. % 10 fetal bovin serumu, standart,% 1 penisilin streptomisin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM piruvik asit, ve 11 mM glukoz ihtiva eden RPMI ortamında kültüre INS1 hücreleri % 80 izdiham için.
  2. % 0.05 tripsin ve plakası ile poli-D-lizin kaplı coverslip dipli görüntüleme plakaları (% 30-40 izdiham) üzerine olan INS1 hücre kültürleri Trypsinize.
  3. Plakalar% 60-80 izdiham (~ 2 gün) ulaşmak ve mitokondrial matriks hedef eklemek için izin ver (COXVIII) için adenoviral PA-GFP 24 saat (İçişleri Bakanlığı = 5). Değişim medya ve hücreleri görüntüleme önce başka bir 2 gün büyümeye olanak sağlar.
  4. Görüntüleme gününde görüntüleme plakaları 7-15 nM TMRE ekleyin ve en az 45 dakika dengeye.
  5. Inkübatör bu sefer dönüş (evre üst inkübatör burada kullanılmıştır) sırasında ve mikroskop ° C'de yaklaşık 1 saat 37 denge sağlaması için bekletin. % 5 CO 2 açın.

    2. Zeiss LSM 710 Konfokal Mikroskop Görüntüleme Parametreler

    1. Mikroskop dengelenmiş sahip sonra, Toplama sekmesi altında, "show el aletleri" linkine tıklayın görüntüleme paneli kurmak açın ve "kanal modu" seçeneğini seçin ve her bir "çerçeve" takip geçiş.
    2. Işık yolu panelinde, EKK ve kanal modunu seçin. Örnek simgesinden Çalışma yukarı, 690 +, ve MBS 488 "arka", MBS seçin. Panelin alt kısmında, parlak saha veya DIC kanalının görselleştirme sağlamak için "T-PMT" tercih.
    3. 490-540 nm ve TMRE boya için 580-700 nm GFP boya için aralığı ayarlayarak ışık yolu parametrelerini ayarlayarak bitirin.
    4. Satın alma modunda, × 512 piksel tarama alanı, ortalama 4x 512 kullanın ve yakınlaştırma faktörü (Eğer kalibrasyon amaçlı tutarlı tutmak istiyor olabilir) seçin.

    3. Görüntüleme Parametreleri Optimize

    1. Diz, (1.4 NA) 100x objektif lens planı apochromat kullanmafototoksisite gelen mitokondri korumak için halojen ışık değil, floresan ışık, ile hücreler bizi.
    2. PA-GFP bir maksimum açık iğne deliği kullanarak hücrelerin ifade ve parlak yeşil hücreleri bulmak için tarama için ekran.
    3. PA-GFP aktif hale getirmek ve doyurmak sinyal detektör etmediğini sağlanması görüntüleme parametreleri optimize etmek için gerekli 2-foton lazer en düşük güç ara. PA-GFP sinyali birkaç z serisi için TMRE sinyali ile colocalizes olmadığını kontrol edin. TMRE sinyal kaybı mitokondriyal depolarizasyon veya fototoksisite gösterir ve hücrelerin bu özellikleri analiz için kullanılmamalıdır sergiliyor.
    4. Bir PA-GFP eksprese eden hücre bulun ve yakınlaştırma faktörü belirtin.
    5. 6 dilim (belirli bir z-odak her pozisyonda ayarlanmadığı sürece bu aralığın tüm 10 hücre karşılamak gerekir) toplamak için Z-serisi aralığı ayarlayın.
    6. Her hücre (hücre 1, hücre 2 vb) görüntüleme yöntemi kaydedin.

    4. Otomatikleştir ayarlayınd Programı Taksit ve Sen 1 Saat Mitokondrial Füzyon Deneyi için Will Follow 10 Hücreleri belirtin

    1. Multitime pencerenin sol panelinde, "tasarruf" paneli seçin ve dosyaların kaydedileceği konumu belirtin.
    2. "Toplama" panelinde, tarama yapılandırma hücre 1 için kaydedilen alma yöntemi yüklemek ve z yığını onay kutusunu işaretleyin. Ayrıca "z yığını Z-orta işaretlenmiş" seçeneğini seçin.
    3. "Bloklar" panelinde, "Her yerde tek bir blok" seçeneğini seçin. Ölçülecek her aralığı için "add blok" a tıklayın.
    4. "Zamanlama" panelinde, "ilk konumu yalnızca az blok öncesi bekleme aralığı" olarak "aralık bekleyin" ve "0" seçeneğini seçin. Bloklar 2-4 Bu bölümdeki "15 dakika" olacaktır.
    5. Konumu panelinde, seçim "lokasyonlar arasında pozisyon yüklemek için odak taşımak" ve çok "seçin ve" tümünü temizlemek düzenleme yerler listesi "tercih" "yük veya 'sonraki loc' tıklayan 'loc geçmek' zaman altında. Config tarama" yerlerde "sahne motorlu.
    6. Under "Bleach" paneli, "çamaşır suyu" kutusunu tıklatın ve "config" yapılandırma dosyası tayin menü aşağı çekme gibi temel yazılım penceresinde belirlenir. Sonra, "bleaching" penceresinde, uygun fotoaktivasyon yöntemi kaydedin. Bölgelerde panelinde, bu özel hücre için ROI seçin ve pencere "ROI listesine eklemek geçerli bölge" seçerek multitime bu ROI ekleyin. Menüyü aşağı doğru "ROI" aynı konumu seçin emin olun.

    Zamanlama düzgün çalışması için ve her hücrenin bir 15 dakikalık aralıklarla olması için, iki yöntem kaydedilmesi gerekir. Blok listesinde, ilk "gerçek" fotoaktivasyon yapılandırma olacak ve geri kalan iki-foton lazer kullanan bir "taklit" yapılandırma olacaktır. Ayrıca, birinci blok (= 0 BKIntv) bir gecikme sahip değildir, sadece blok olacaktır. Dolayısıyla, yöntem, bir tarama fotoaktivasyon takiben bir baz tarama ile başlar. Blokların kalanı 900 sn BkIntv var veher noktada zamanlama tutarlılığı korumak için tıpkı süresi 0 sn iki tarama vardır.

    1. Zaman içinde takip edilmesi gereken 10 hücrelerin her biri için, bu sıra gerçekleştirin:
      Ifade eden bir PAGFP bul kendi görüntüleme yöntemi hücre kaydetmek
      Yer sahne pozisyon paneli-işaretlemek, görüntüleme yöntemi belirtin
      Ana ROI panel seçim özel ROI paneli-kaydedebilir ve aynı zamanda yatırım getirisini kutusuna yüklemek photoactivated Bleach olmak için ilgilenilen bölge:
      ROI Erase ve 1 tarama zum sıfırlamak
      Sonraki hücre bulun ve zoom ayarı
      Sonraki 9 hücreler için işlemi tekrarlayın

    Her aşamada yer ve tüm blokları ilişkili uygun görüntüleme yöntemi (tarama yapılandırma) olduğundan emin olun. Ayrıca geri kalan bir "taklit" yöntemi içeren süre her yerde ilk blok uygun fotoaktivasyon yöntemine karşılık emin olun. Son olarak, "Çalıştır" seçeneğini seçin.

    5.. PA-GFP Sinyal yoğunluğu analiz

    1. Sonra excel verileri ve her zaman noktasında z-yığınlar için ortalama yoğunluğunu hesaplamak. Herhangi bir sinyal var optik bölümleri atın.
    2. Orijinal photoactivated sinyalinin yüzdesi hesaplanarak, her z-yığın sinyali seyreltme ölçün.

    Her bir veri noktası, her bir zaman noktası için çift z-yığın bilgileri ile sonuçlanan, iki kez taranan ve kaydedilmektedir. Z-yığın değerleri kabul olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, bu bir sorun (örneğin odağı, hücre hareketi) göstergesidir.

    6. Temsilcisi Sonuçlar

    Bir füzyon olayı aktive ve aktive olmayan PA-GFP mitokondri arasında oluştuğunda, mitokondrial matriks içinde PAGFP olmayan etiketli matriks ile karıştırır ve daha geniş bir alana seyreltilmiş olur, sinyal azalanyoğunluğu (Şekil 1A). Mitokondriyal füzyon dengelenme (yaklaşık 1 saat) ulaşıncaya kadar INS1 hücresinde, sinyal yoğunluğunda önemli bir azalma, her 15 dakikada gerçekleşir. Şekil 1B hücre PA-GFP ve TMRE sinyallerin hemen hemen tam ko sergileyen dikkat ediniz. Bu yöntemlerde TMRE çok düşük bir yoğunluğu (15 nM) ile PAGFP fotoaktivasyon hedef yardımcı olmak için, ve aynı zamanda hücre sağlığı izlemek için kullanılır. Bu da fototoksisite veya ölmekte olan bir devlet hücreleri gösterir, çünkü depolarize mitokondri bir zenginliği ile Hücreleri PAGFP ve TMRE eksik kolokalizasyon sahip olacak ve analiz edilmesi gerekir.

    ~ Mitokondriyal hacminin% 15 aktif olduğunda mitokondriyal füzyon için Denge süresi genellikle INS1 hücrelerde 1 saat. Bazen, küçük bir alanda aydınlatılır bile, mitokondrinin en dolayı daha da füzyon tespit etmek zordur, bu durumda son derece, ağ olmak üzere photoactivated haline. Diğer hücre tipleri farklı alışım kez gösterebilir ve mitokondriyal dinamiğini karakterize etmek için kısa aralıklarla ve uzun bir süre boyunca test edilmelidir. Mitokondriyal füzyon inhibe etmek için, hücreler, bir lipotoxic ortam içinde yerleştirilebilir. Bu, daha önce 0.4 mM fragmanları mitokondri palmitat olduğunu gösterdi, ve mitokondriyal füzyon 9 inhibe edilmiştir. Bu etki, mitokondri parçalanmış Şekil 2, görülebilir, fakat mtPAGFP bir sinyal normal koşullar (Şekil 1) altına kadar değişmez. Bu nedenle, PA-GFP sinyali seyreltme yerine bölünme daha mitokondriyal füzyon bağlı olması olasıdır. Diğer hücreler türleri, biz böyle mitokondriyal füzyon 14 için gerekli olan OPA1 susturmak gibi mitokondriyal parçalanma uyardığı bilinen diğer yollarla kullanmanızı öneririz.

    Şekil 1
    Şekil 1.. A. PA-GFP tedricen selektör bu projeksiyon görüntü görülebilir olarak artan bir alanı üzerine proteinin seyreltme yol açan mitokondriyal füzyon olaylar yüzünden hale 6 optik bölümlerde her 15 dakikada bir miktarı ile. PA-GFP B. TMRE mitokondri depolarize aktif olmadığını göstermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

    Şekil 2
    . Mitokondrial füzyon 0.4 mM palmitat ile inhibe Şekil 2 PA-GFP seyreltilmesi azaltır. Zamanla değişmeyen bir sinyal yoğunluğu ile kısa mitokondri gösteren 6 optik bölümleri A. Projeksiyonları. TMRE PA-GFP B. kolokalizasyon mitokondrinin değildir gösterir dePolarize. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Edinim fotoaktivasyon sonra her 15 dakikada oluşursa Bu yöntem, bir anda yaklaşık 10 hücre görüntüleme sağlar. Hücrelerin tam sayısı bir mtPAGFP ifade kültürü çanak içinde hücreleri, ve nasıl hızlı bir şekilde tüm yazılım parametrelerini bulmak ve işaretlemek mümkün olduğu kadar hızlı bağlıdır. Belirlenen z-yığın marjları tüm hücreler için geçerli olacak, çünkü otomasyon sorunsuz yapmak için hücrelerin bir tabaka kullanılmalıdır.

Bu ilk fotoaktivasyon alanın büyüklüğü Denge süresi yönetecektir. Mitokondriyal füzyon ölçmek için edebilmek için, bu ağ geri kalanına sinyalinin zaman içinde yayılması izlenebilir olduğu gibi, ağ sadece% 10-20, photoactivate için önemlidir. Şebekenin çok photoactivated ise, tam bir füzyon çok hızlı gerçekleşirse olasıdır, ve olay ele alınmayacaktır.

Extreme bakıma alınmalıiki-fotonlu lazer lazer güç aynı zamanda mitokondriyal depolarizasyonu yol açar fototoksisite önlemek için TMRE konsantrasyonu ayarlanır. MtPAGFP sinyal TMRE sinyali ile colocalizes sağlanması fototoksisite ve genel hücre sağlığı 8,15 değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Epifluoerescent ışık ile aydınlatma kaçınılmalıdır. MtPAGFP salgılayan hücrelerin ararken düşük güç 488nm uyarma ile tararken, iğne deliği maksimum açık olmalıdır. PA-1 saat boyunca GFP sinyali ölçmek için, ancak herhangi bir hücre 8 zor olabilir oversaturate için yeterli photoactivate için iki-fotonlu lazer güç ayarlanması. Bir kez otomatik program başlatılır Ancak, zaman bu optimizasyon adımda harcanması gerektiğini, bunun daha fazla hücre seçmek için, onu durdurmak ve devam ettirmek için sıkıcı bir iştir.

Kalite kontrol için, diferansiyel müdahale kontrast (DIC) satın alma hücreleri üzerinde odak izlemek için görüntü (ya da iletilen ışık) çok olabiliryardımsever ve aynı zamanda tarama sırasında immersiyon yağı oluşan kabarcıklar algılamak için iyi bir yol, bu bazen sahne hareketlerinden olur.

Bu yöntemi kullanarak mtPAGFP etiketlenmemiş olanlar için photoactivated mitokondriden mitokondriyal matriks protein hareketin tek yönlü verileri toplayan rağmen, diğer işlemler incelemek için bu teknik kullanmak için makuldür. Örneğin, özel florokromlar ABC-me, 15 çözünür matriks protein karıştırma farklı bir zaman ölçeği üzerinde oluştuğu bir füzyon için gösterildiği gibi, olayların füzyon sırasında belirli bir hareketini izlemek zar proteinleri eklenebilir.

Disclosures

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Zeiss, Inc tarafından desteklenmektedir

Acknowledgments

Biz Neuroscience Araştırma Merkezi Tufts, P30 NS047243 (Jackson), Boston Üniversitesi Tıp Kampüsü, Link Tıp Corporation Disiplinlerarası Biyomedikal Araştırma Evans Center tarafından desteklenen Mitokondri Affinity Araştırma Ortak (mtARC) ve bu çalışmaları desteklemek için Zeiss teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COXIII-adenoviral PA-GFP Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE Invitrogen T669
Zeiss LSM 710 confocal Carl Zeiss, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
  2. Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
  3. Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  4. Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
  5. Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
  6. Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
  7. Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
  8. Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
  9. Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
  10. Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
  11. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  12. Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100 (2011).
  13. Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
  14. Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
  15. Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
  16. Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
  17. Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
  18. Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 65 Genetik Biyoloji Fizik konfokal mikroskopi mitokondri füzyon TMRE mtPAGFP INS1 mitokondriyal dinamikleri mitokondriyal morfoloji mitokondriyal ağ
Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lovy, A., Molina, A. J. A.,More

Lovy, A., Molina, A. J. A., Cerqueira, F. M., Trudeau, K., Shirihai, O. S. A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (65), e3991, doi:10.3791/3991 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter