Summary
Eucariontes microbianos são tanto uma fonte de carbono fotossinteticamente derivado e espécies maiores predadores em lagos permanentemente cobertas de gelo da Antártida. Este relatório descreve uma abordagem cultura enriquecimento para o isolamento metabolicamente eucariontes microbianos versáteis do lago da Antártida, Lago Bonney, e avalia potencial de fixação de carbono inorgânico através de um ensaio de radioisótopos para a ribulose-1 carboxilase oxigenase atividade ,5-bisphophate (Rubisco).
Abstract
Lago Bonney é um dos numerosos permanentemente cobertas de gelo lagos situados nos Vales Secos McMurdo, na Antártida. A cobertura de gelo perene mantém uma coluna de água quimicamente estratificada e ao contrário de outros corpos subterrâneos de água, em grande parte impede entrada externa de carbono e nutrientes em igarapés. Biota estão expostos a inúmeros estresses ambientais, incluindo o ano todo deficiência severa de nutrientes, baixas temperaturas, sombra extremo, hypersalinity, e 24 horas de escuridão durante o inverno 1. Essas condições ambientais extremas limitar a biota no Lago Bonney quase que exclusivamente para os microorganismos 2.
Eucariontes unicelulares microbiana (chamado "protistas") são jogadores importantes no ciclo biogeoquímico global 3 e desempenham papéis importantes ecológicos no ciclo do carbono nos lagos secos do vale, ocupando ambos os papéis primário e terciário da cadeia alimentar aquática. Nas secas vale alimentares aquáticas web, protistas que fixam inorganic carbono (autotrofia) são os principais produtores de carbono orgânico para os organismos organotrophic 4, 2. Phagotrophic ou protistas heterotróficos capazes de ingerir bactérias e protistas menores agem como predadores de topo da cadeia alimentar 5. Por último, uma proporção desconhecida da população protista é capaz de metabolismo mixotróficas combinado 6, 7. Mixotrofia em protistas envolve a capacidade de combinar a capacidade fotossintética com a ingestão de microorganismos phagotrophic presas. Esta forma de mixotrofia difere do metabolismo mixotróficas em espécies bacterianas, que envolve geralmente a moléculas de captação dissolvidos de carbono. Existem actualmente isolados protistas muito poucos de permanentemente gelo-capped lagos polares, e os estudos de diversidade protista e ecologia neste ambiente extremo ter sido limitada 8, 4, 9, 10, 5. Uma melhor compreensão da versatilidade metabólica protista no seco vale simples teia alimentar do lago irá auxiliar no desenvolvimento de modelos para o role de protistas no ciclo global do carbono.
Nós empregamos uma abordagem cultura enriquecimento para o isolamento protistas potencialmente fototróficas e mixotróficas do Lago Bonney. Profundidades na coluna d'água foram escolhidos com base na localização de produção primária maxima e filogenética protista diversidade 4, 11, bem como a variabilidade nas principais fatores abióticos que afetam os modos protista tróficos: profundidades rasas são limitadas por nutrientes importantes, enquanto mais profundas profundidades de amostragem são limitados pela disponibilidade de luz. Além disso, as amostras de água do lago foram suplementados com vários tipos de meios de crescimento para promover o crescimento de uma variedade de organismos fototróficas.
RuBisCO catalisa o passo limitante na Calvin Benson Bassham (CBB) ciclo, o caminho mais importante pelo qual os organismos autotróficos fixar carbono inorgânico e carbono orgânico para fornecer níveis tróficos superiores em cadeias alimentares aquáticas e terrestres 12. Neste estudo, we aplicado um ensaio radioisótopo modificado para amostras filtradas 13 para monitorar a atividade carboxilase máximo como um proxy para o potencial de fixação de carbono e versatilidade metabólica nas culturas de enriquecimento Lago Bonney.
Protocol
1. Aquisição Amostra
- Escolher e preparar o local de amostragem um dia antes da amostragem da coluna de água. Isso permitirá que as camadas estratificadas da coluna de água para reformar depois de perturbação devido à perfuração e gelo buraco de ponto de fusão. Identificar a localização do local de perfuração por GPS.
- Para acessar a coluna de água, comece a perfuração de um buraco no gelo com uma broca de gelo Jiffy ligado a uma extensão de vôo de 4 polegadas e Jiffy bit de corte. Para evitar o congelamento da broca no furo, para tentar evitar a perfuração para dentro da água líquida por suspensão de perfuração aproximadamente 4-6 polegadas acima do topo da coluna de água.
- O furo terá de ser alargada a partir de um diâmetro de 15 a 60 cm antes da amostragem. Isto é conseguido através da utilização de um aparelho de fusão furo (Modelo Hotsy) que circula polietilenoglicol aquecido através de um tubo de cobre. De fusão furo demora tipicamente até 18 horas.
- Antes de amostragem da coluna de água, garantir que todos os equipamentos necessários e st amostravasos orage são montados no local de amostragem. Materiais de amostragem incluem: garrafa Niskin (capacidade L 5-10), Guincho com profundidade calibrado cabo, Messenger, frascos de amostras suficientes para cada profundidade de amostragem e coolers para transporte de amostras.
- Comece a amostragem no início do dia (~ 5 horas), como filtragem de água do lago deve ser preenchido no dia da amostragem. Recolher amostras de água (1-5 L) de profundidades desejada (por este estudo: 6-M, 15-m e profundidades 18-M de amostragem, medidos a partir do nível da água piezométrica no furo de gelo), utilizando um amostrador Niskin ligado a um calibrado guincho mão. Para evitar distúrbios da coluna de água coletar profundidades rasas antes de mais profundas.
- Armazene as amostras do lago em refrigeradores e transporte do local de amostra para o laboratório de campo, utilizando um trenó anexado a um ATV (veículo todo o terreno). As amostras devem ser processadas ou estabilizado (por exemplo: flash congelamento em nitrogênio líquido) no laboratório de campo de amostragem imediatamente seguinte.
2. Desenvolviment de culturas de enriquecimento
- Para o cultivo de culturas de enriquecimento, Concentrado 0,5-1 L de água do lago em 47 mm 0,45 poros filtros de tamanho polietersulfona através de filtração suave (<atm 0,3). Se a diversidade da comunidade natural é desejada, filtrar uma segunda amostra para 47 mm 0,45 filtros de tamanho de poros polietersulfona e seguir os protocolos de acordo com Bielewicz et al. 4 para eucarionte diversidade filogenética.
- De transferência do filtro 50 para tubo Falcon mL estéril contendo ~ 20 mL de água do lago filtrada recolhidos a partir da profundidade de amostragem mesmo que o filtro. Suavemente lavar as células a partir do filtro, utilizando uma pipeta estéril.
- Transferir a suspensão de célula para um frasco de cultura de 25 centímetros 2 estéril célula. Adicionar água lago filtrada recolhidos a partir de cada amostra de profundidade para aumentar o volume da cultura para 45 mL. Configurar múltiplas repetições para cada profundidade de amostragem se enriquecimentos em diferentes meios de cultura são desejados.
- Suplemento frascos de cultura com 50x ssoluções terile para uma concentração final de 1X dos seguintes meios de cultura: meio basal Bold, BG11 e F / 2. Se o cultivo de organismos mixotróficas é necessária, set-up dois vasos F/2-supplemented e adicionar 2-3 grãos de arroz estéril para um dos frascos.
- Incubar frascos de cultura de a baixa temperatura (4 ° C) e baixa irradiância (20 umol fotões m -2 s -1) em um crescimento de temperatura controlada incubadora durante pelo menos 4 semanas na Antártida antes da transferência para o seu laboratório dos EUA. Se isolados são desejados, a placa 250 uL de cultura de enriquecimento em placas de agar contendo meio de crescimento adequadas, após 2 semanas de incubação.
- Para embarque para os EUA, as culturas de enriquecimento de transferência para tubos estéreis de 50 mL de falcão. Exigência de pedido de transferência "não congelar" e "manter a calma" no transporte pedido. Enquanto o processo de transporte da Antártica é relativamente rápida (2 semanas por via aérea comercial) e altamente fiável, existe uma possibilidade de perda de órgão fastidiosoismos durante o processo de transporte. Assim, os pesquisadores podem querer preservar uma subamostra antes do envio para que a perda de algumas espécies durante o processo de envio pode ser avaliado.
- Após a chegada, em os EUA, a transferência de 5 mL de cultura de enriquecimento em 45 mL de meio de crescimento apropriadas em um balão de Erlenmeyer de 125-mL estéril tapado com uma esponja estéril. Culturas de enriquecimento devem ser mantidos como culturas de pé em uma temperatura em câmara de crescimento controlado ambiental (câmara de crescimento diurna, VWR) a 4 ° C/20 fótons mmol m -2 s -1. As culturas deverão ser transferidos para meio fresco a cada 30 dias.
3. Extração de células Lysate de enriquecimentos filtradas
- Filtro de 5 mL de cultura de enriquecimento em um de 25 mm de filtros Whatman GF / F utilizando filtro de vácuo suave (menos de 10 psi). O filtro pode ser armazenada durante várias semanas a -80 ° C antes do ensaio actividade RuBisCO.
- Corte o filtro em seções 4-5 com uma tesoura de aço e estéreistransferir as peças com fórceps estéreis para um tubo de tampa de rosca 2 mL cheio 1/5 da maneira completamente com 0,1 mm de diâmetro de zircónio / sílica grânulos.
- Adicionar 1,25 ml de tampão de extracção de filtro (50 bicina mM, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, 5 mg / mL de BSA, e 0,1% de triton X-100; adicionar fresco: 10 mM de NaHCO3, 10 mM de DTT, 3,3 mM aminocapróico ácido, 0,7 mM de benzamidina, pH 7,8) 13 e perturbar células usando um batedor de Minibead três vezes por 30s na configuração de velocidade 48. Para evitar um aquecimento da amostra, beadbeating alternam com uma incubação de gelo min.
- Centrifugar lama filtro durante 2 min a 3000 xg, a 4 ° C para formar uma pelota solta de GF / F fibras do filtro e os restos da parede celular.
- Remover uma alíquota de 200 uL e imerso em 800 uL de gelo-acetona fria de 90%. Meça clorofila extraível (chl) um em um espectrofotômetro a valores de comprimento de onda de 664 nm e 647 nm 14. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifugar remaining sobrenadante a 4 ° C durante 2 min a 15.000 xg e transferir o sobrenadante (evitar o sedimento de membranas celulares insolúveis e restantes GF / F fibras do filtro) para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. Este lisado celular solúvel pode agora ser utilizado no ensaio de actividade carboxilase RuBisCO.
- Lisado pode ser armazenado a -80 ° C após a adição de glicerol 12,5% e de congelação de flash em azoto líquido. Uma perda de actividade pode ocorrer depois de múltiplas de congelamento / descongelamento ciclos dependendo da sensibilidade das enzimas no lisado. Portanto, a atividade de lisado fresco contra congelado deve ser testada antes em grande escala de células lisado extrações.
4. RuBisCO Ensaio Filtro Carboxilase Atividade
- Transferir 125 uL de lisado solúvel a um parafuso 15 mL tubo de microcentrífuga de tampão (tampão não necessário) que foi arrefecida em gelo. Para amostras de controlo negativo, adicionar 125 uL de lisado solúvel a 15 mL tubo de microcentrífuga com tampa de rosca, mas não se adicionar o substrato (no passo 4.7). Correrduplicar reacções para todas as amostras e controlos negativos.
- Preparar 10 ml de tampão de ensaio fresco (50 mM bicina-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO3, 25 mM MgCl2) e frio em gelo. Alíquota suficiente do tampão de ensaio para todas as amostras e controlos negativos (100 uL por amostra / controlo mais 100 uL adicional) para um tubo de 5 ml. Execute todas as etapas subseqüentes sob uma coifa.
- Adicionar 40 ul NaH 14 CO 3 (500 uCi / mL) por mL de tampão de ensaio para o buffer de alíquota e manter o tampão em gelo.
- Remover 10 uL de tampão de ensaio contendo 14 C e dilui-lo em 1 mL de tampão de ensaio. Após inversão de misturar, adicionar 100 uL da mistura de 1:100 diluída para 3 mL de Bio-Safe de cintilação II contando cocktail num frasco de cintilação. Inverta para misturar. Contagens de cintilação (Beckman LS6500) deve ser superior a 18.000 cpm, antes de continuar com o ensaio.
- Quando uma quantidade suficiente NaH 14 CO 3 foi adicionado ao tampão de ensaio,mover os tubos de reacção para um banho seco pré-definido para 25 ° C e incubar durante 3-5 minutos.
- Adicionar 100 uL de tampão de ensaio para os lisados e incubar durante 5 min a 25 ° C.
- Adicionar 20 ul de 15 mM bifosfato Ribulose, para amostras e permitir que a reacção prosseguir durante 5-10 minutos a 25 ° C.
- Adicionar 100 uL de ácido propiónico (100%) (Fisher) para parar a reacção. Centrifugar durante 1 hora a 2000 xg para esgotar unincorporated 14 C.
- Transferir o volume total das amostras para frascos de cintilação contendo 3 ml Bio-Safe cocktail de cintilação II a contagem. Determinar cpm de produtos finais de ácido estáveis por contagem de cintilação (B. Witte, R. comunicação Tabita pessoal).
- Calcular as taxas de atividade da Rubisco em um chl uma base 14.
5. Os resultados representativos
Utilizamos cultura enriquecimento para o isolamento fototrófico adaptadas ao frio e protistas mixotróficas que residem na Antártica Lake Bonney. Para capturar uma maior diversidade de organismos, testamos três meios de cultura tipos: meio basal Bold (BBM) 15, F/2-Si Marinha média 16, 17 e BG11 Médio 18. A inspecção visual das culturas de enriquecimento por microscopia de luz revelou que as culturas foram dominados por protistas fototróficas (indicado pela presença de pigmento de clorofila na maioria das células) e nutria uma variedade de morfologias de células, dependendo da profundidade de amostragem a partir do qual o inoculo foi tomada eo tipo de meios utilizados na cultura (Fig. 1).
Nós medimos as taxas máximas de atividade carboxilase catalisadas pela enzima RuBisCO como um proxy para o potencial de fixação de carbono. Abundância um Chl foi também monitorizada como uma estimativa da biomassa protista fototrófico (Fig. 2). Apesar de o cultivo de todas as culturas sob o regime de temperatura / luz mesmo (ou seja, 4 ° C/20 mmol m -2 s -1), o potencial de fixação de carbonoe biomassa fototrófico variou drasticamente entre as culturas de enriquecimento. Máxima actividade RuBisCO foi observada em culturas de enriquecimento de crescimento em qualquer BBM (enriquecimentos 4 e 6) ou BG11 (enriquecimentos 13 e 14) meios de crescimento, enquanto que as culturas enriquecidas em F / 2 meio de crescimento (enriquecimentos 19, 21, 23) exibiram uma 4 - a 34 vezes menor actividades carboxilase máximos. Estas diferenças não foram devido aos níveis mais baixos de biomassa nas culturas de F / 2, como a actividade carboxilase foi expressa numa base de uma Chl. Além disso, a actividade da RuBisCO não se correlacionou com a concentração de um chl (r = -0,023, p> 0,1;. Fig. 2, inserção). As culturas inoculadas com água BBM lago a partir de 6 e 15 m (enriquecimentos 4 e 5) apresentou o maior Chl a níveis, enquanto todas as outras culturas exibiram chl relativamente baixa um, independentemente da RuBisCO actividade da enzima (Fig. 2).
Figura 1.Representativos microbianas eucarióticas culturas de enriquecimento que tenham seleccionados para o crescimento de organismos diferentes. Identidade da cultura é dada no canto inferior esquerdo dos painéis. Todas as imagens representam micrografias luz gerada utilizando imersão em óleo e aumento de 1000x.
Figura 2. Capacidade de fixação potencial de carbono e de clorofila extraível um níveis em microbianas Antárctico culturas de enriquecimento eucarióticas isoladas de Lake Bonney e cultivadas em vários meios de cultura. Ver Tabela 1 para detalhes cultura Detalhe:. Correlação de Pearson entre clorofila a potencial de fixação de carbono em abundância e microbianos da Antártida culturas de enriquecimento eucarióticas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Estudos moleculares recentes têm relatado alta diversidade de unicelulares eucariontes através de uma variedade de ambientes 3, 19, 20, no entanto, devido à falta de isolados em toda a gama de habitats protista os papéis funcionais dessas espécies individuais em teias alimentares são largamente desconhecido. Neste estudo, descrevemos metodologias para enriquecer de espécies microbianas eucariotos exibindo versatilidade metabólica de um ambiente relativamente undersampled, um permanentemente coberta de gelo da Antártida lago. Culturas enriquecidas a partir de profundidades diferentes no Lago Bonney apresentaram taxas diferenciais de fixação de carbono que eram de crescimento a médio-dependente. Por exemplo, o potencial de fixação de baixo carbono em culturas enriquecidas em F / 2 versus BBM ou 11 BG meios de crescimento provavelmente reflete diferenças na diversidade protista e capacidade metabólica. BBM meio de crescimento selecciona para espécies de algas verdes (ou clorofíceas) e as nossas culturas parecem ser uma monocultura de uma espécie de algas verdes (Fig.1A, B). Estes organismos são conhecidos por grande parte dependem photoautotrophy. Um isolado do Lago Bonney metabolismo fotoautotrófico exposições pura, tendo uma exigência estrita para a luz como fonte de energia única 1. Em contraste, médio F / 2 de crescimento é concebido para enriquecer para uma ampla gama de protistas marinhos, incluindo os organismos potencialmente mixotróficas 12. Apesar de não explorar plenamente a diversidade das culturas F / 2, vistas microscópicas destes enriquecimentos mostram claramente um consórcio de protistas de morfologias de células diferentes (Fig. 1C, D). Assim, reduziu RuBisCO actividade nas culturas de F / 2 pode ser devido a utilização de alternativos modos de carbono / energia de aquisição. Em apoio a esta previsão, as culturas puras de isolados fotoautotróficas antárticas apresentam taxas significativamente maiores carboxilase da Rubisco máximo em comparação com os isolados da Antártica que mixotrofia exposição (Dolhi & Morgan-Kiss, resultados não publicados). Outros estudos de enz heterotróficaatividade Yme nestas amostras ajudaria a caracterizar plenamente a versatilidade metabólica das culturas de enriquecimento protista e estão em andamento em nosso laboratório. Além disso, os dados fisiológicos descritos neste documento, que será complementada com filogenética e informações de seqüenciamento metagenômico como parte de um esforço de seqüenciamento grande para caracterizar comunidades microbianas em todo o mundo chamado Terra Projeto Microbioma ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .
O ensaio modificado de filtro descrito neste relatório poderia também ser aplicada a lisado celular extraído de amostras de água filtrada lago. No entanto, para novas aplicações deste ensaio, o volume de lisado óptima deve ser determinada pelo ensaio de três volumes diferentes e utilizando-se que produz cpm pelo menos 3 a 4 vezes acima dos controlos negativos. As análises de potencial de fixação de carbono em conjunto com as análises enzimáticas de atividades heterotróficasty em comunidades naturais protista daria uma visão mais detalhada do papel da capacidade trófica protista e ciclagem de carbono em ambientes aquáticos. Estamos atualmente aplicando esta abordagem para entender o papel dos fatores abióticos na versatilidade metabólica protista no Lago Bonney e outros lagos da Antártida. A carboxilase RuBisCO método de ensaio filtro será uma ferramenta valiosa para estudar a fixação de carbono potencial e versatilidade metabólica em culturas de pequena escala de enriquecimento, bem como sistemas lago inteiro.
Antes do desenvolvimento de cultivo independentes ferramentas moleculares, protistas foram tradicionalmente identificado pelo cultivo e taxonomicamente classificado com base na sua morfologia celular. Assim, há uma longa história de enriquecimento e isolamento de protistas que residem em uma grande variedade de habitat. As primeiras investigações em particular, são historicamente valioso para identificação taxonômica detalhada (revisado em: 21, 22). Enquanto o isolamento de protistasusando abordagens baseadas em enriquecimento é relativamente raro em ambientes de água doce da Antártida, diversos isolados protistas marinhos do enriquecimento da água do mar da Antártica estão disponíveis 23-26. Além disso, coleções de culturas diversas são dedicados a protista e isolados das microalgas (por exemplo: a coleta de cultura Provasoli-Guillard, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Tecnologias de seqüenciamento confiável e barato ter produzido um enorme banco de dados genética de seqüências não cultivadas protistan. Enquanto estas bases de dados têm sido muito informativo sobre a diversidade e distribuição deste importante grupo de microrganismos, há um fosso cada vez maior na ligação de dados de seqüência com a nossa compreensão da ecologia e fisiologia protista. Assim, as técnicas tradicionais de cultivo, especialmente em ambientes undersampled como polares habitats aquáticos continuará a desempenhar um papel importante para a compreensão da importância e papéis ecológicosde protistas em ciclismo geoquímica global.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a J. Priscu, A. Chiuchiolo ea McMurdo LTER equipe limnologia para auxiliar na coleta e preservação das amostras na Antártida. Agradecemos Serviços Ratheon polares e helicópteros para apoio logístico PHI. Micrografias de luz foram gerados no Centro de Miami para microscopia avançada e Imaging Center. Este trabalho foi financiado pela NSF Escritório de Programas Polares Grants 0631659 e 1056396.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
- Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Hüner, N. P. A. Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments. Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).
- Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake. Biosci. 49, 997-1008 (1999).
- Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. Protists are microbes too: a perspective. ISME J. 3, 4-12 (2009).
- Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition. ISME J. 5, 1559-1564 (2011).
- Laybourn-Parry, J. No place too cold. Science. 324, 1521-1522 (2009).
- Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica. Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).
- Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare. Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).
- Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola. J. Phycol. 39, 644-649 (2003).
- De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia. Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).
- Laybourn-Parry, J. Survival mechanisms in Antarctic lakes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).
- Lizotte, M. P., Priscu, J. C. Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis. Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. Priscu, J. C. , 229-240 (1998).
- Ellis, R. J. Most abundance protein in the world. Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).
- Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages. Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).
- Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).
- Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., Hüner, N. P. A. Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata. Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of Marine Invertebrate Animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Plenum Publishing. New York. 29-60 (1975).
- Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora. J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. New insights into the diversity of marine picoeukaryotes. PLoS ONE. 4, e7143 (2009).
- Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. Oceanic Protists. Oceanography. 20, 130-135 (2007).
- Finlay, B. J. Protist taxonomy: an ecological perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).
- Foissner, W. Protist diversity: estimates of the near-imponderable. Protist. 150, 363-368 (1999).
- Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition. Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).
- Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea. Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).
- Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp. Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).
- Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist. The ISME journal. 3, 252-260 (2009).
