Summary
微生物的真核生物都在永久性冰雪覆盖的南极湖泊源的光合衍生的碳和顶级掠食性物种。本报告介绍了富集培养的方法分离代谢多功能微生物真核生物，从南极湖，湖波尼，使用核酮糖1,5 - 二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco活化酶）活性放射性同位素检测和评估无机碳固定潜力。
Abstract
波尼湖是众多永久位于麦克默多干谷，南极洲冰层覆盖的湖泊之一。常年冰盖保持化学分层的水柱，不同于其他内陆水体，主要是防止外部输入从河流的碳和营养。生物群暴露在众多的环境压力，包括全年的养分严重缺乏，气温低，极端的阴凉处，矿化，24小时黑暗，在冬季1。这些极端的环境条件限制在波尼湖生物群几乎完全微生物2。
单细胞微生物的真核生物（称为“原生生物”）是在全球生物地球化学循环的重要球员，在干热河谷湖泊的碳循环中发挥重要的生态作用，占小学和三级水生食物网中的角色。在干热河谷水产食品网站，修正我的原生生物organotrophic生物体的有机碳4，2 norganic碳（自养）的主要生产者。 phagotrophic或能异养细菌和较小的原生生物摄入原生生物作为食物网中的顶级掠食者。最后，未知的原生动物人口的比例是能够结合的混合营养代谢6，7。在原生生物mixotrophy涉及的能力结合猎物微生物phagotrophic摄入的光合能力。这种形式的mixotrophy不同于细菌混合营养代谢，一般涉及吸收溶解的碳分子。目前有极少数原生动物分离永久冰覆盖的极地湖泊，在这种极端环境中的原生生物多样性和生态的研究已经有限，8，4，9，10，5。的原生生物代谢的多功能性，将有助于更好地理解简单的干热河谷湖的食物网中的发展模式，为rOLE在全球碳循环中的原生生物。
我们采用隔离波尼湖潜在的光合和混合营养的原生生物富集培养方法。水柱采样深度被选为基于初级生产最大值和原生动物进化多样性4，第11的位置，以及影响原生动物的营养模式的主要非生物因素的变化：浅层取样深度为主要营养成分的限制，而更深层次的采样深度是有限的可用光。此外，湖水样品，辅以多种类型的生长介质，促进多种光合生物体的生长。
Rubisco活化酶催化的速率限制在CBB）卡尔文森Bassham（周期，主要途径，其中自养有机体修复无机碳和有机碳含量较高的营养水平，在水生和陆生食物链12步。在这项研究中，Wé应用放射性同位素法修改过滤样品13监察固碳潜力，并在湖的波尼富集文化的代谢多功能的代理最大的羧化酶活性。
Protocol
1。样品采集
- 选择和准备采样点有一天前采样水柱。这将使水柱分层层扰动后，由于钻井和冰孔熔化改革。识别GPS演练现场的位置。
- 要访问的水柱，首先通过一个瞬间冰到了4英寸的jiffy的飞行延伸和钻头的螺旋冰钻了一个洞。为了防止冻结孔钻，尽量避免停止钻探约4-6英寸以上水柱顶部钻成液态水。
- 钻孔将需要从15至60厘米，直径扩大采样前。这是通过使用一个洞熔炉（Hotsy模型），通过铜管循环加热的聚乙二醇。孔熔化通常需要长达18个小时。
- 采样前的水柱，确保所有必需的设备和样品STorage船只在采样现场组装。抽样材料包括：瓶（5-10升容量）Niskin，深度校准电缆绞车，信使，每个采样深度足够的样本瓶和运输样品冷却器。
- 开始采样年初的一天（5分），湖水过滤应抽样一天完成。使用连接到一个校准Niskin采样，收集所需深度（本研究为：6米，15米和18米采样深度，在冰孔测压水位测量）的水样（1-5升）手摇绞车。为了防止干扰的水柱收集之前更深的深度浅。
- 店湖样品冷却器和运输领域的实验室，使用连接到ATV（全地形车）乘雪橇从样品现场。样品应处理或稳定（如：闪光灯在液态氮冷冻）在现场实验室后立即采样。
2。高新区发展NT的富集文化
- 为培养富集培养，集中到47毫米0.45微米孔径聚醚使用温和过滤（<0.3 ATM）过滤器0.5-1大号的湖水。如果所需的自然社会的多样性，筛选到47毫米0.45微米孔径聚醚砜过滤器的第二个样品，并按照协议，根据Bielewicz 等 4真核生物进化多样性。
- 过滤器转移至50毫升无菌猎鹰〜20毫升过滤湖水从相同的采样深度过滤器收集管中。从过滤器使用无菌吸管轻轻洗细胞。
- 细胞悬液转移到25厘米的无菌细胞培养瓶。添加筛选湖水从每个样品深度收集至45毫升，以增加文化音量。设立多个每个采样深度复制如果需要不同的培养基富集。
- 补充50X小号的文化瓶Bold的基础培养基，BG11和F / 2：以下文化媒体的1X终浓度terile解决方案。如果混合营养生物体的种植需要，设置了两个F/2-supplemented船只，并添加2-3瓶不育水稻的谷物。
- 在低温（4℃）和低辐照（加入20μmol光子米-2 S -1），在一个温度控制的增长至少4周的孵化器在南极孵育培养瓶之前装运到美国实验室。如果需要，分离富集培养板250μL含有琼脂培养2周后的适度增长，媒体板块。
- 对于运往美国，50毫升无菌猎鹰管转移富集文化。要求装运要求“不冻结”和“保持冷静”对航运的要求。虽然来自南极的运输过程中是比较快的（2个星期的商用空调）和高度可靠的，是有讲究器官损失的可能性在运输过程中的ISMS。因此，研究者可能想保持一个子样本前航运在运输过程中的损失，可以使某些物种进行评估。
- 在抵达美国后，转让5毫升到45毫升的适度增长，在125毫升的无菌三角瓶媒体富集培养用无菌海绵上限。应保持站立在温度控制环境生长室（日生长商会，厂商VWR）在4°C/20号μmol光子米-2 S -1文化的丰富文化。文化应转移到新媒体每30天。
3。从筛选富集的细胞裂解液提取
- 过滤器5毫升到25毫米，使用温和的真空（<10磅）滤纸GF / F滤波器的富集培养。该过滤器可存储数周，在-80°C间前化验Rubisco活性。
- 用无菌钢剪刀削减过滤器，并为4-5节转让无菌镊子2毫升螺丝帽管件充满了直径为0.1毫米的锆/二氧化硅珠全的五分之一。
- 过滤提取液加入1.25毫升（1 mM的EDTA，MgCl 2的 10毫米，50毫米bicine，5毫克/毫升BSA和0.1％的Triton X-100补充新鲜：10毫米碳酸氢钠 ，10毫米数码地面电视，3.3毫米的氨基酸，苯甲脒0.7毫米，pH值7.8）13，破坏细胞，使用Minibead搅拌器速度设置48 30年代的三倍。 1分钟冰孵化，以防止加热样品，备用beadbeating。
- 在4°C离心过滤浆GF / F过滤纤维和细胞壁碎片，形成一个松散的颗粒，在3000 XG 2分钟。
- 取出200μL分装在800μL冰冷的90％丙酮和浸泡。测量提取叶绿素（CHL）在分光光度计在波长664 nm和647 nm的14值。将上清转移至1.5 mL离心管中。
- 离心remaini吴上清在4°为15,000 XG和2分钟，将上清转移（避免不溶性细胞膜沉淀和过滤纤维，余下的GF /）到一个干净的1.5 mL离心管中，这种可溶性的细胞裂解液，现在可能被用于在Rubisco的羧化酶活性测定。
- 可存放于-80°C后，另外12.5％的甘油和闪光冷冻在液氮裂解。一个失去活性后，可能会出现多个冻结/解冻周期取决于裂解酶的敏感性。因此，新鲜与冷冻裂解活性的大规模细胞裂解提取前应测试。
4。 Rubisco的羧化酶活性筛选检测
- 转移125μL15 mL的螺旋盖离心管（不需要CAP）已在冰上可溶性裂解。为阴性对照样品，添加125μL，溶于裂解15毫升螺丝帽离心管，但不加衬底（步骤4.7）。运行复制所有样品和阴性对照反应。
- 准备10毫升检测缓冲区新鲜（50毫米Bicine-50毫米25毫米MgCl 2的碳酸氢钠 ，氢氧化钠，pH值8.0）和冰浴。分装足够的缓冲液的所有样品和阴性对照组（100μL每采样/控制，加100μL的额外）5 mL管。通风柜下执行所有的后续步骤。
- 加入40微升的NaH 14 CO 3（500微居里/毫升）每毫升缓冲液分装缓冲区和保持冰缓冲区。
- 取出10μL检测含有碳-14的缓冲区，并在1毫升缓冲液稀释。经过相混合，添加100μL1:100稀释的混合物3毫升生物安全II闪烁计数闪烁小瓶鸡尾酒。反相混合。闪烁计数（贝克曼LS6500）应该超过18,000 CPM之前继续进行检测。
- 当有足够多的NaH 14 CO 3的已加入缓冲液，将反应管干浴预设为3-5分钟，25℃孵育。
- 加入100μL的裂解缓冲液孵育5分钟，在25°C。
- 加入20μL15毫米核酮糖二磷酸，来样，使反应进行5-10分钟25°C。
- 加入100μL丙酸（100％）（费舍尔）停止反应。在2000 XG离心1小时，用尽非法人14 C
- 转移样品的总体积闪烁小瓶含3毫升生物安全II闪烁计数鸡尾酒。确定由闪烁计数（B.维特，R. Tabita个人通信）CPM酸稳定的高端产品。
- 计算Rubisco活性，叶绿素基础 14。
5。代表结果
我们利用富集培养分离冷适应的光合和混合营养中居于南极大号的原生生物AKE波尼。为了捕捉一个更大的生物体的多样性，我们测试三个生长介质类型：大胆的基础中等（BBM）15，F/2-Si海洋中等16，17和BG11中等18。光镜的丰富文化的视觉检查发现，光合原生生物（在大多数细胞色素叶绿素的存在表示）为主的文化和窝藏了多种采样深度取决于细胞形态的接种和文化的媒体类型（ 图1）。
我们测量了催化的酶Rubisco的羧化酶活性的最大固碳潜力的代理费率。叶绿素a丰也被监测作为光合原生动物生物量的估计，（ 图2）。尽管所有的文化修养，在相同的温度/光照制度（即4°C/20号μmol米-2秒-1），固碳潜力和光合生物量变化显着的丰富文化之间。最大Rubisco活性，观察生长在任的BBM（富集4和6）或BG11（富集13和14）生长介质中富集文化，丰富的F / 2培养基中（富集19，21，23），而文化上展出了4 - 到34倍，最大羧化酶的活动。这些差异不是由于生物量水平较低的F / 2文化，羧化酶活性，叶绿素的基础上表示。此外，Rubisco活性，叶绿素浓度 （R = -0.023，P> 0.1;图2，插图）没有关联。接种湖水从6米和15米（富集4和5）的BBM文化最高的叶绿素 a水平，而所有其他文化表现出相对较低的叶绿素，无论Rubisco的酶的活性（ 图2）。
图1。代表微生物真核生物浓缩文化，而选择不同生物体的生长。文化认同是在面板的左下角。所有的图像，代表产生的光显微镜1000X倍率的油浸。
图2。潜在的固碳能力和在南极微生物真核生物富集分离湖波尼和文化上的各种文化传媒种植提取叶绿素a水平。文化的细节，请参阅表1 插图：叶绿素含量之间的相关性。皮尔逊在南极微生物真核生物的富集文化的丰富性和固碳潜力。
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Discussion
最近的分子研究报告通过一系列环境3，19，20高的单细胞真核生物的多样性;然而，由于缺乏整个完整的原生生物栖息地范围的分离，这些个别物种食物链的职能作用在很大程度上是未知之数。在这项研究中，我们所描述的方法，以丰富的真核生物的参展环境，从一个相对欠永久冰雪覆盖的南极湖泊的代谢多功能的微生物物种。从不同采样深度湖波尼丰富的文化表现差的固碳率，生长介质依赖。例如，低碳固定在F / 2的BBM或BG 11生长介质与丰富的文化潜力，很可能反映了在原生生物多样性和代谢能力的差异。的BBM培养基中选择绿色的藻类（绿藻）和我们的文化似乎是一个单一的绿色藻类（ 图1A，B）这些生物体被称为很大程度上取决于光合自养。一个孤立湖波尼展品纯光合自养代谢，有严格的要求作为其唯一的能量来源1。相比之下，生长介质中的F / 2的设计，丰富广泛的海洋单细胞生物，包括潜在的混合营养生物体12。虽然我们没有充分发掘的F / 2文化的多样性，这些富集的微观意见清楚地表明了不同的细胞形态的原生生物组成的财团（ 图1C，D） 的。因此，减少了F / 2文化中Rubisco活性可能是由于利用替代碳/能源采集模式。支持这一预测，光合自养南极菌株的纯培养表现出显着较高的最大Rubisco的羧化率相比，南极隔离，的展览mixotrophy（Dolhi与摩根亲吻，未公布结果）。进一步研究异ENZ这些样本yme活动将有助于充分体现代谢多功能的原生生物富集的文化，在我们的实验室目前正在进行中。此外，本文中所描述的生理数据将与进化和宏基因组测序，作为一个大型测序的努力，被称为地球的微生物群系项目遍布全球的表征微生物群落的一部分信息（ http://www.earthmicrobiome.org/~~V补充） 。
在本报告所述的修改过滤器检测也可应用于过滤湖水样品中提取的细胞裂解物。然而，此法的新应用，优化裂解量应确定通过测定三种不同的容量和使用，产生CPM至少有3至4倍以上的阴性对照。与酶异activi的分析结合在固碳潜力分析TY自然原生动物群落中原生动物的营养能力和水环境中的碳循环的作用将提供一个更详细的视图。目前，我们正在运用这种方法，了解湖波尼和其他南极湖泊中原生动物代谢多功能的非生物环境因素的作用。 Rubisco的羧过滤器的检测方法，将是一个有价值的工具，研究在小规模的铀浓缩文化以及整个湖泊系统固碳潜力和代谢的多功能性。
之前，培养独立的分子工具的发展，原生生物传统鉴定种植和分类根据其细胞形态分类。因此，历史悠久，是对居住在各种各样的栖息地的原生生物的富集和分离。早期的调查中特别是历史上宝贵的详细分类鉴定（评审，22：21）。而隔离的单细胞生物使用浓缩为基础的方法是比较少见的，在南极的淡水环境，从南极海水中富集的几个海洋原生动物分离可用23-26。此外，一些文化藏品致力于原生动物（例如：Provasoli-Guillard文化收集，微藻株https://ncma.bigelow.org/~~V ）。可靠和廉价的测序技术已经产生了大量未开垦protistan序列的基因库。虽然这些数据库已经非常丰富的关于这个重要的微生物群体的多样性和分布，是一个连接序列数据与我们的原生生物生态学和生理学的了解日益扩大的差距。因此，传统的栽培技术，特别是在欠如极地的水生栖息地的环境，将继续发挥重要作用，对理解的重要性和生态作用在全球地球化学循环的原生生物。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢J. Priscu，A. Chiuchiolo和麦克默多LTER网络湖沼队在南极样品的收集和保全的协助。我们感谢Ratheon极地后勤支援服务和PHI的直升机。光显微镜在迈阿密的先进的显微镜和影像中心为中心的产生。这项工作是由国家科学基金会极地项目办公室资助0631659和1056396的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
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