Summary
微生物の真核生物では、永久に氷に覆われた南極湖沼における光合成由来の炭素とトップ捕食種のソースの両方があります。このレポートでは、南極の湖、ボニー湖から代謝的に汎用性の高い微生物の真核細胞を分離するために集積培養のアプローチを説明し、リブロース-1,5 - bisphophateカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ）活性のために放射性同位体アッセイを用いて無機炭素固定の可能性を評価しています。
Abstract
ボニー湖では、マクマードドライバレーに位置する多数の永久氷で覆われた湖の一つ、南極です。多年生の氷は、化学的に成層水柱を維持し、水の他の内陸の機関とは異なり、主に炭素とストリームからの栄養分の外部入力を防ぐことができます。生物相は、冬の間に1年間深刻な栄養欠乏、低温、極端な日陰、hypersalinity、24時間の暗闇を含む多くの環境ストレスにさらされている。これらの極端な環境条件が微生物2にほぼ独占的にボニー湖での生物相を制限します。
単細胞微生物の真核生物は（ "原生生物"と呼ばれる）水生食物網内のプライマリおよび第三の両方の役割を占有し、グローバルな物質循環3の重要なプレーヤーであり、ドライバレー湖沼における炭素の循環に重要な生態学的な役割を果たしている。 iを修正する乾燥した谷の水生食物網、原生生物のnorganic炭素（独立栄養）がorganotrophic生物の有機炭素4、2の主要な生産者である。 Phagotrophicまたはバクテリアや小さな原生生物を摂取することのできる従属栄養原生生物は、食物網5の上の捕食者としての役割を果たします。最後に、原生生物の人口の未知の割合は、複合混合栄養代謝6、7のことができます。原生生物の混合栄養では、餌の微生物のphagotrophic摂取と光合成能力を結合する能力が含まれます。混合栄養のこの形式は、一般的に取り込み、溶存炭素分子を含む細菌種の混合栄養代謝とは異なります。そこに非常に少数の原生生物の分離株は永久に氷に覆われた北極の湖から現在、この極端な環境における原生生物の多様性と生態の研究は、限られた8、4、9、10、5でした。シンプルなドライバレー湖沼の食物網における原生生物の代謝多様性の理解は、Rのモデルの開発に役立ちますグローバル炭素循環における原生生物のOLE。
私たちはボニー湖から潜在的に光合成と混合栄養原生生物を単離するために集積培養のアプローチを採用しています。水柱のサンプリング深さは一次生産の最大値と原生生物系統多様性4、11と同様に、原生生物の栄養のモードに影響を与える主要な非生物的要因の変動の位置に基づいて選ば れた浅いサンプリング深さは主要な栄養素のために制限され、より深いサンプリング深さながら光可用性によって制限されます。さらに、湖の水のサンプルは、光合成生物の様々な成長を促進する増殖培地の複数の種類を添加した。
ルビスコは、カルビン·ベンソンBassham（CBB）サイクル、独立栄養生物は無機炭素を修正し、水生および陸生食物網12より高い栄養レベルの有機炭素を提供することによって主要な経路における律速段階を触媒する。本研究では、Weはボニー湖の濃縮培養における炭素固定の可能性と代謝の多様性のためのプロキシとして最大カルボキシラーゼ活性を監視するためのフィルタのサンプル13の変更された放射性同位体アッセイを適用した。
Protocol
1。サンプルの取得
- 選択して水柱をサンプリングする前に、一日のサンプリングサイトを準備します。これは、水柱の成層は、掘削し、氷穴の融解に起因する障害の後に改革することができます。 GPSによるドリルサイトの場所を識別します。
- 水柱にアクセスするには、4インチジフィー飛行拡張や切削ビットに取り付けられたジフィーアイスオーガーで氷に穴をあけることから始めます。穴のドリルの凍結を防ぐために、水柱の上端より上に掘削約4〜6インチを停止させることによって液体の水に掘削を回避しようとします。
- ドリル穴は、以前のサンプリング15〜60 cmの直径から拡大する必要があります。これは、銅管を介して加熱されたポリエチレングリコールを循環させる穴溶融装置（Hotsyモデル）の使用によって達成されています。穴の融点は、通常、18時間を要します。
- 前の水柱をサンプリングし、確実に必要なすべての機器とサンプルのSTオレージ船は、サンプリング現場で組み立てられています。サンプリング素材が含まれます：Lニスキンボトル（5-10 L容量）、深さ校正ケーブルでウィンチ、メッセンジャー、それぞれのサンプリング深さのために十分なサンプルボトルとサンプル輸送のためのクーラーを。
- 湖の水のフィルタリングは、サンプリングの完了日に完了する必要がありますので、早期の日（〜午前5時）のサンプリングを開始します。キャリブレーションに取り付けられたLニスキンサンプラーを使用して：（6-M、15-mと氷の穴で井戸水の水位から測定した18メートルのサンプリング深さ、この研究のための）は、所望の深さから水のサンプル（1-5 L）を収集ハンドウインチ。水柱の乱れを防止するためにはより深いものを前に、浅い深度を収集します。
- サンプルサイトからATV（全地形車両）に取り付けられたそりを使用してフィールド実験室にクーラーと輸送の店湖は、サンプル。フィールドラボすぐに次のサンプリング時：サンプルが処理されるか、（液体窒素中でフラッシュ凍結などのために）安定させてください。
2。 Developme濃縮文化のNT
- 濃縮培養の培養に、穏やかなろ過を（<0.3気圧）を使用して、47ミリメートル0.45μmの細孔径ポリエーテルスルホンフィルター上に湖の水の0.5〜1 Lを集中。自然界の多様性が必要な場合は、47ミリメートル0.45μmの細孔径ポリエーテルスルホンフィルター上に第二の試料をフィルタ処理し、4真核生物の系統多様性のBielewicz らによるとプロトコルに従ってください。
- フィルタと同様のサンプリング深さから採取したフィルタ湖の水〜20 mLを含む50 mlの滅菌ファルコンチューブにフィルターを転送します。穏やかに滅菌ピペットを用いてフィルタから細胞を洗浄する。
- 25cm 2の滅菌細胞培養フラスコに細胞懸濁液を転送します。 45 mLに培養液量を増やすために、各サンプルの深さから採取したフィルタ湖の水を追加します。異なる培地上で濃縮が必要な場合は、複数の各サンプリング深さのために複製する設定を行います。
- 50X sで培養フラスコを補う太字の基礎培地、BG11とF / 2：次の培地の1Xの最終濃度にterileソリューションを提供しています。混合栄養生物の栽培が必要な場合は、2 F/2-supplemented血管を設定し、フラスコのいずれかに無菌米の2-3粒を追加します。
- あなたの米国の研究室への出荷前に南極には、少なくとも4週間温度制御された成長のインキュベーター内で低温（4℃）、低照度（20マイクロモル光子m -2 s -1で ）で、培養フラスコをインキュベートします。 2週間のインキュベーション後に、適切な増殖培地を含む寒天プレート上での増菌培養の分離菌株が必要な場合は、プレート250μL。
- 米国への出荷のために、滅菌50 mlのFalconチューブに濃縮培養を転送します。の要求出荷の要件は、 "凍結しないでください"とリクエストを出荷し、 "冷静さを保つ"。南極からの出荷プロセスは比較的高速（商用飛行機で2週間）と信頼性の高いですが、潔癖臓器の損失の可能性がありますトランスポート·プロセス中にISMS。したがって、調査官は、出荷プロセスの間にある種の損失を評価することができるように出荷する前に、サブサンプルを保存することができます。
- 米国に到着し、125 mLの滅菌三角フラスコ内の適切な増殖培地45 mLに濃縮文化の転送5 mLを滅菌スポンジで蓋をした。濃縮培養物は、4で温度制御された環境成長チャンバー（日周成長チャンバー、VWR）°C/20モル光子m -2 s -1での立っている培養として維持されるべきである。培養は30日ごとに新鮮なメディアに転送する必要があります。
3。フィルタ処理された濃縮細胞ライセートから抽出
- 穏やかな真空（<10 PSI）を使用して、25ミリメートルワットマンGF / Fフィルター上に培養液のフィルターを5mL。フィルタは、°Cの前のRubisco活性を測定するに-80℃で数週間保存することができます。
- 滅菌鋼製ハサミで4から5セクションにフィルタをカットし、転送2mLのスクリューキャップチューブに滅菌ピンセットを持つ部分は、0.1mm径のジルコニア/シリカビーズとの完全な方法の5分の1を満たした。
- フィルタの抽出バッファー（50 mMのビシン、10mMのMgCl 2、1mMのEDTA、5 mg / mLのBSA、0.1％トリトンX-100の1.25 mLを加え、新鮮な追加の10mMのNaHCO 3、10mMのDTT、アミノカプロン3.3 mMの酸、0.7 mMのベンズアミジンは、pH 7.8）13および速度の設定48代のためにMinibeadビーター三回を用いて細胞を破壊する。 1分氷のインキュベーションで、サンプルの加熱、代替beadbeatingを防ぐことができます。
- GF / Fフィルター繊維や細胞壁の破片の緩いペレットを形成するために4℃で3000×gで2分間フィルタースラリーを遠心分離します。
- 氷冷90％アセトンの800μLに200μL分注し浸すを削除します。 664 nmと647 nmで14の波長値で分光光度計で抽出クロロフィル（CHL）を測定する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。
- remainiを遠心4でngの上清°15000 xgで2分間、Cと1.5 mlのマイクロ遠心チューブに（不溶性の細胞膜と残りのGF / Fフィルター繊維のペレットを避けるため）、上清を移す。この可溶性細胞溶解液は、現在のRubiscoカルボキシラーゼ活性のアッセイに使用することができます。
- ライセートは-80℃で液体窒素で12.5％のグリセロールとフラッシュ凍結を添加した後保存することができます。活性の損失は、溶解物中の酵素の感度に応じて、複数の凍結/融解サイクル後に発生する可能性があります。したがって、新鮮な対凍結ライセートの活性は、大規模な細胞溶解液の抽出の前にテストする必要があります。
4。ルビスコカルボキシラーゼ活性フィルターアッセイ
- 氷上で冷却された15mLのスクリューキャップマイクロチューブ（キャップは必要ありません）に水溶性の溶解液125μLを転送します。陰性対照サンプルについては、15mLのスクリューキャップマイクロチューブに125μL、可溶性溶解物を追加しますが、（ステップ4.7）基板を追加しないでください。実行すべてのサンプルとネガティブコントロールの反応を複製します。
- 氷の上でアッセイ新鮮な緩衝液（50mMビシン-NaOHで、pH8.0で、50mMのNaHCO 3を 、25 mMのMgCl 2）、チル10mLを準備します。十分に5 mLのチューブにサンプルとネガティブコントロール（サンプル/コントロールに加えて100μL追加ごとに100μL）のすべてのアッセイ用緩衝液のアリコート。ヒュームフードの下のすべての後続の手順を実行します。
- 等分バッファにNaHを加えアッセイ緩衝液あたり14 CO 3（500μCiの/ mL）を40μLを追加して、氷の上でバッファを保持します。
- 14 Cを含むアッセイ緩衝液10μLを削除して、アッセイ緩衝液1 mLに希釈します。混在させる反転した後、シンチレーションバイアル中でカクテルを数えるバイオセーフIIシンチレーションの3 mLに1:100希釈した混合物の100μLを追加します。混在させる反転します。シンチレーションカウント（ベックマンLS6500）は、アッセイを続行する前に、18000 CPM以上でなければなりません。
- のNaH 14 CO 3は、アッセイバッファーに追加されたときに十分な、3から5分間25℃でインキュベートしにプリセットされて乾燥した浴に反応管を移動します。
- ライセートに100μLをアッセイ緩衝液を追加し、25℃で5分間インキュベート℃、
- サンプルに、15mMのリブロースのビスリン酸20μLを追加し、反応は25℃で5-10分のために続行することができ℃の
- 反応を停止するには、100μLプロピオン酸（100％）（フィッシャー）を追加します。法人14℃を排気するために2000×gで1時間遠心
- 3 mLのバイオセーフIIシンチレーションカウンティングカクテルを含むシンチレーションバイアルにサンプルの総量を転送します。シンチレーション計数による酸安定した最終製品のCPM（B.ヴィッテ、R. Tabita私信）を決定します。
- CHL基礎14上のRubisco活性率を計算します。
5。代表的な結果
我々は寒さに適応した光合成と南極Lに存在する混合栄養原生生物を分離する濃縮培養を利用しエイクボニー。太字の基礎培地（BBM）15、F/2-Siマリンミディアム16、17とBG11培地18：生物の多様性をキャプチャするために、我々は3つの成長のメディアタイプをテストしました。光顕微鏡による濃縮培養液の目視検査では、文化が光合成原生生物（ほとんどの細胞ではクロロフィル色素の存在によって示される）によって支配されたことを明らかにし、接種が取得されたサンプリング深さに応じて細胞の形態の多様性と抱いて培養に使用されるメディアの種類（ 図1）。
我々は、炭素固定ポテンシャルのプロキシとして酵素ルビスコによって触媒カルボキシラーゼ活性の最大レートを測定した。クロロフィルが豊富また、光合成原生生物のバイオマス（ 図2）の推定値としてモニターした。同じ温度/光領域（つまり、4°C/20モルm -2 s -1で ）、炭素固定ポテンシャルの下にあるすべての文化の育成にもかかわらず、と光合成バイオマスの濃縮培養の間に劇的に変化した。文化4を示したF / 2培地（濃縮19、21、23）に濃縮されながら、最大のRubisco活性が、BBM（濃縮4および6）またはBG11（濃縮13および14）増殖培地のいずれかに成長して濃縮培養で観察された - 34倍低い最大カルボキシラーゼ活動へ。カルボキシラーゼ活性はクロロフィルaに基づいて発現していたように、これらの違いは、F / 2の文化ではバイオマスのレベルを下げることが原因ではありませんでした。また、Rubisco活性は、CHL濃度（;図2、挿入図はr = -0.023、P> 0.1）と相関しなかった。他のすべての文化にかかわらず、ルビスコ酵素活性の（ 図2）比較的低いCHLを示しながら、6メートルと15メートル（濃縮4と5）から湖の水を接種したBBMの文化は、最高CHLレベルを持っていた。
図1。異なる生物の成長のために選択されている代表的な微生物真核生物濃縮培養。文化のアイデンティティーは、パネルの左下に記載されています。すべての画像は、1000Xの倍率で油浸を使用して生成された光顕微鏡写真を表しています。
図2南極微生物の真核生物濃縮培養のレベルボニー湖から分離され、様々な培地上に成長した潜在的な炭素固定能力と抽出クロロフィル。文化の詳細については、表1を参照して挿入図：クロロフィルとの間のピアソン相関南極微生物の真核生物濃縮培養における量と炭素固定の可能性。
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Discussion
最近の分子生物学的研究は、環境3、19、20の範囲で単細胞真核生物の高い多様性を報告しているが、原生生物の生息地の全範囲にわたって分離株の不足のためにこれらの個々の種の機能的役割は、食物網の大部分です。不明。本研究では、比較的アンダー環境、永久に氷に覆われた南極の湖からの代謝多様性を示す微生物の真核生物種を濃縮する方法を説明してきました。ボニー湖で異なるサンプリング深さから豊かな文化が成長媒体に依存した差動炭素固定率を示した。たとえば、BBM、またはBG 11増殖培地に対し、F / 2に濃縮培養における低炭素固定の可能性はおそらく原生生物の多様性と代謝能力の違いを反映しています。 BBMの増殖培地は緑色藻類のために選択します（またはchlorophytes）と私たちの文化は緑色の藻類（ 図のモノカルチャーであるように見える1A、B）。これらの生物は、主にphotoautotrophyに依存することが知られています。一つは、ボニー湖から分離、その唯一のエネルギー源1として光の厳格な要件を有する、純粋な光独立栄養代謝を示す。対照的に、F / 2の増殖培地は、潜在的に混合栄養生物12を含む海洋原生生物の広い範囲のために豊かにするために設計されています。我々は完全にF / 2文化の多様性を探求しませんでしたが、これらの濃縮の微視的なビューには、明らかに様々な細胞形態の原生生物のコンソーシアム（ 図1C、D）を示しています 。したがって、F / 2の文化ではRubisco活性は、代替炭素/エネルギー収集モードの利用が原因である可能性が減少した。この予測を支持して、その展示混合栄養（Dolhi＆モーガン·キス、未発表の結果）を分離する光合成南極分離株の純粋培養が南極に比べて有意に高い最大のRubiscoカルボキシラーゼ率を示す。従属ENZのさらなる研究これらのサンプルでYME活動は完全に原生生物濃縮培養の代謝多様性を特徴づけるのに役立つと我々の研究室で現在進められていると思います。さらに、本 稿で述べた生理学的データは、系統によって補完され、世界中の微生物群集を特徴づける大型のシーケンスの一環としてメタゲノムシーケンス情報は、（地球Microbiomeプロジェクトと呼ばれるhttp://www.earthmicrobiome.org/~~V ） 。
このレポートに記載され変更されたフィルターアッセイもフィルタリング湖の水のサンプルから抽出された細胞溶解液に適用することができます。しかし、このアッセイの新しいアプリケーションでは、最適なライセートボリュームは、3つの異なるボリュームを測定すると、少なくとも3〜4倍のネガティブコントロール上にCPMが得られていることが使用することによって決定されるべきである。従属栄養活動の酵素分析と併せて炭素固定ポテンシャルの分析自然の原生生物群集のTyは原生生物の栄養機能及び水生環境における炭素循環の役割のより詳細なビューを提供するであろう。我々は現在、ボニー湖および他の南極湖沼における原生生物の代謝多様性に非生物的環境要因の役割を理解するには、このアプローチを適用している。ルビスコカルボキシラーゼフィルターアッセイ法は、小規模の濃縮培養と同様に湖全体のシステムに潜在的な炭素固定と代謝の多様性を研究する貴重なツールとなるでしょう。
栽培の独立した分子ツールの開発に先立ち、原生生物は、伝統的に栽培することにより同定したと分類学的にそれらの細胞の形態に基づいて分類されます。したがって、生息地の多種多様に存在する原生生物の濃縮と分離の長い歴史があります。特に初期の研究は詳細な分類学的同定（21、22に日）は歴史的に貴重なものです。一方、原生生物の分離濃縮ベースのアプローチを使用すると、南極の淡水環境では比較的まれであり、南極の海水の濃縮から、いくつかの海洋原生生物の分離株は、23から26まで用意されています。さらに、いくつかの文化のコレクションは、原生生物や藻類株（：Provasoli-ギラード·カルチャー·コレクション、などのために捧げられるhttps://ncma.bigelow.org/~~V ）。信頼性と安価なシーケンシング技術は、耕作protistanシーケンスの膨大な遺伝子データベースを作成しています。これらのデータベースは、微生物のこの重要なグループの多様性と分布に関する非常に有益なものでしたが、原生生物の生態や生理についての我々の理解と配列データをリンクするに格差があります。従って、特にそのような極性の水生生息地としてアンダー環境で伝統的な栽培技術は、重要性と生態系の役割を理解に向けて重要な役割を果たしていきますグローバルな地球化学的循環における原生生物。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、J. Priscu、A. Chiuchioloと南極のサンプルの収集と保全の支援のためマクマードLTER陸チームに感謝します。我々は後方支援のためにRatheonポーラーサービスおよびPHIのヘリコプターに感謝します。光顕微鏡は、高度な顕微鏡とイメージングセンターのマイアミのセンターで生成されました。この作品は、極性のプログラム補助金0631659と1056396のNSF Officeによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
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