Summary
Vi beskriver en metode for å lokalisere fluorescently merket proteiner i elektron mikrografer. Fluorescens er første lokalisert ved hjelp av foto-aktivert lokalisering mikroskopi på supertynne seksjoner. Disse bildene blir deretter justert til elektron mikrografer av den samme delen.
Abstract
Kartlegge fordelingen av proteiner er viktig for å forstå funksjonen av proteiner i en celle. Fluorescensmikroskopi er mye brukt for protein lokalisering, men subcellulære sammenheng er ofte fraværende i fluorescens bilder. Immuno-elektronmikroskopi, på den annen side, kan lokalisere proteiner, men teknikken er begrenset av mangel på kompatible antistoffer, dårlig bevaring av morfologi og fordi de fleste antigener ikke utsettes for prøveflaten. Correlative tilnærminger kan erverve fluorescens bilde fra en hel celle først, enten fra immuno-fluorescens eller genetisk merket proteiner. Prøven blir deretter fast og innebygd for elektronmikroskopi, og bildene er korrelert 1-3. Imidlertid lav oppløsning fluorescens bilde og mangelen på fiducial markører utelukke presis lokalisering av proteiner.
Alternativt kan fluorescens bildebehandling gjøres etter bevare prøven i plast. Idenne tilnærmingen, er blokken seksjonert, og fluorescens bilder og elektron mikrografer av den samme delen er korrelert 4-7. Imidlertid tilslører diffraksjon grensen av lys i den korrelerte bildet plasseringene av individuelle molekyler, og fluorescensen ofte strekker seg utover grensen av cellen.
Nano-oppløsning fluorescens elektronmikroskopi (nano-FEM) er utformet for å lokalisere proteiner på nano-skala av tenkelig de samme delene som bruker foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) og elektronmikroskopi. PALM overvinner diffraksjon grensen ved bildebehandling individuelle fluorescerende proteiner og deretter kartlegge Tyngdepunktet av hver fluorescerende flekk 8-10.
Vi skissere nano-FEM teknikk i fem trinn. Først, er prøven fast og innebygde hjelp betingelser som bevarer fluorescensen av kodede proteiner. Sekund, harpiks blokkene delt i ultratynne segmenter (70-80 nm) som er montertpå en cover glass. Tredje, fluorescens avbildet i disse delene ved hjelp av Zeiss PALM mikroskop. Fjerde, er elektron tette strukturer avbildet i disse samme seksjoner ved hjelp av en scanning elektronmikroskop. Femte, er fluorescens og elektron mikrografer justert bruke gull partikler som fiducial markører. Oppsummert kan det subcellulære lokalisering av fluorescently merket proteiner bestemmes ved nanometer oppløsning i ca en uke.
Protocol
1. Høytrykks-Frysing
- Klargjør Cryo-beskyttende ved tilsetning 0,2 g BSA til 1 ml av et egnet medium for prøven (for eksempel, kulturmedium for cellekulturer, M9 for C. elegans). Inkuber røret i en 37 ° C vannbad inntil alt BSA er oppløst.
- Før den fryses, fyll den automatiserte fryse-substitusjon enhet (Leica AFS) med flytende nitrogen
- Still AFS-programmet: -90 ° C i 5-30 timers *, 5 ° C / time til -60 ° C, -60 ° C i 2 timer (eller velg "pause" alternativet hvis du bruker Leica AFS 2), 5 ° C / time til -30 ° C og -30 ° C i 72 timer. Hvis AFS maskinen er i stand til å ha mer enn fem trinn, bør -30 ° C-trinnet erstattes med en "pause" alternativet satt til 0 hr, og to ytterligere trinn bør legges: 10 ° C / time til -20 ° C og 24 timer ved -20 ° C. Hvis maskinen er begrenset til fem trinn, sette opp en annen på et annet minnespor slik: 10 ° C / time til -20 ° C og 24 hr ved -20 ° C.
* Tiden her kan justeres slik at den -60 ° C-trinnet begynner i tidlig morgen. - Forbered 1% osmiumtetroksyd stamløsningen ved å blande 0,1 g osmiumtetroksyd krystaller (EMS, RT19134) med 10 ml vannfritt aceton (EMS, # RT10016). Klargjør fiksativer i en 50 ml konisk rør som følger. Først legger 1 ml milliQ vann og deretter oppløses i den 0,02 g kaliumpermanganat (EMS, RT20200). Legg 19 ml aceton og bland det godt. Endelig, tilsett 20 ul av 1% osmium stamoppløsning inn i røret. Aceton er en fri-radikal scavenger 11 og dermed hindrer polymerisasjon av plast, men bruk av aceton som et fryse-substitusjon medium er nødvendig for å bevare morfologi grunn av dets interaksjon med lipider. Aceton vil være substituert med etanol før plastisk infiltrasjon. Aliquot 1 ml til hver cryovial og holde fiksativer frosset ved å lagre rør i flytende nitrogen.
- Fyll en prøve bærer med 20% BSA eller bakterier.Både 20% BSA og bakterier tjene som Cryo-protectants. Valget for typen av prøven transportøren avhenger prøven. For C. elegans, bruker en 100 mikrometer godt.
- Plasser prøven i transportøren og fryse den med en høytrykks fryser.
- Etter frysing og under flytende nitrogen, overføre prøven i cryotube inneholder fiksativ. Kontroller at prøven forblir under væsken til enhver tid.
- Gjenta 1.5) - 1,7) inntil alle prøvene er frosset.
- Overføre alle kryorør i AFS enhet, og gjenoppta programmet.
2. Freeze-substitusjon
- Når temperaturen når -60 ° C, place hetteglass inneholdende 20 ml av 95% aceton i AFS.
- Når temperaturen er -50 ° C, erstatte fiksativ med 95% aceton seks ganger over en periode på to timer.
- Plasser en ampulle inneholdende 20 ml av 0,1% uranyl acetat (Polysciences, # 21447-25) i 95% aceton inn i kammeret ogpre-avkjøle det til -50 ° C.
- På slutten av vasketrinnet, tilsett ~ 1 ml uranyl acetat løsning til hver ampulle. Opphev stopp programmet om nødvendig.
- Når temperaturen når -30 ° C, må du bytte uranyl acetate med 95% etanol seks ganger over en periode på to timer.
- I mellomtiden, utgjør 97% glykol-metakrylat-harpiks (GMA, SPI Supplies / Struktur Probe, Inc., # 02630-AA) ved å blande 22,3 ml GMA, 10ml n-butylmetakrylat, 1 ml milliQ vann, og 0,2 g benzoylperoksid (katalysator). Oppbevar den i glass hetteglass (EMS, # 72632) og forberede 30% GMA ved å blande den med 95% etanol. Ikke oppbevar GMA media i plastrør fordi kvaliteten på polymerisasjon forringer med langtidslagring i polyetylen-basert plast. Pre-cool GMA løsningen til -30 ° C.
Tradisjonelle epoksyharpikser som Araldite og Epon kan ikke brukes i protokollen siden de er vannfri og syrlig som quenches fluorescerende proteiner. Akrylharpikser, slik som LR White, cen tolerere en liten mengde av vann og kan bevare fluorescerende protein, men dens sure pH en tendens til å slukke fluoroforen 12. GMA tolererer, faktisk krever, en liten mengde vann og er alkalisk (PH8) 12. GMA er dessverre noe sprøtt. Videre gjør GMA ikke cross-link med vev som tradisjonelle epoksyresiner do. Disse egenskapene GMA årsak inkonsekvens i seksjonering kvalitet spesielt når delt tynnere enn 80 nm.
Selv om holdbarheten av GMA er omtrent et år, bør GMA brukes innen 3 måneder etter kjøp for å sikre kvaliteten.
3. Infiltrasjon og polymerisering
Trinn 03.01 til 03.03 blir utført i de samme kryorør brukes for fryse-substitusjon. Infiltrasjon og polymeriseringen blir utført ved -30 ° C i AFS å bevare fluorescerende protein.
- Forbered infiltrasjonsanlegg medier ved å blande GMA stamoppløsning med 95% etanol. Inkuber prøveri 30% GMA i 3-5 timer.
- Inkuber prøver i 70% GMA for 4-6 timer.
- Inkuber prøver i 97% GMA natten.
- På neste dag, utgjør fersk 97% GMA.
- Overfør prøver til en innebygging mold (EBSciences, # TC). Forbered en disk av aclar film (EMS, # 50425-10) ved hjelp av en 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc.) og plasser disken i bunnen av BEEM kapsel.
- Utveksling de 97% GMA tre ganger over 6 timer ved -30 ° C.
- Etter tredje utveksling, legge initiativtakeren N, N-dimetyl-p-toluidin (Sigma-Aldrich, # D9912) til GMA ved en konsentrasjon på 1,5 pl / 1 ml GMA og anvende denne løsningen til hver prøve mold. Umiddelbart plassere prøven i embedding mold i AFS.
Merk at benzoylperoksid er katalysatoren og er til stede under alle infiltrasjonsanlegg trinnene så omrøring er ikke nødvendig. Benzoylperoksid tar polymerisere ikke plasten før det blir utsatt for den kjemiske initiator N, N,-dimetyl-p-toluidin. Initiativtaker aktiverer polymerization umiddelbart og vil polymerisere harpiksen selv i vev innen 1 hr. Likevel kan vev dropouts resultere i dype vev grunnet ufullstendig polymerisasjon. Videre betyr GMA ikke tverrbinde prøven til blokken godt, så skille prøven fra kryobeskyttende ved å trykke på matrisen av bakterier.
Hvis polymerisasjonen utføres utenfor en AFS må innebygging mould være dekket med et Aclar disk å blokkere eksponering for oksygen. GMA tar polymerisering ikke helt når de utsettes for oksygen. - Tillat plasten å kurere natten selv om det polymeriserer innen 1 hr.
- Oppbevar prøven i en nitrogen gassfylt vakuumsekken (Ziploc) i fryseren (-20 ° C) til videre behandling, slik at fluorescerende proteiner ikke er utsatt for oksygen.
4. Seksjonering
- Seksjonering av GMA-embedded prøver kan utføres på en lignende måte som for EPON-embedded prøver. Ekstra forsiktighet bør være å tan ikke å væte snitting overflaten fordi GMA er svært hydrofil og båndene vil bli drevet inn i vannbad hvis de er fuktet på begge sider.
- Samle bånd av seksjoner (50-80 nm) på et dekkglass hvis en TIRF mikroskop brukes til lokalisering. Ellers bruker et rutenett laget for transmisjonselektronmikroskopi. Skjærehastighet bør settes at1.6 mm / s eller høyere. Ellers kan et bånd ikke dannes.
- Oppbevar deler ved -20 ° C hvis ikke avbildet umiddelbart. Beskytt fluoroforer fra UV-lys ved å dekke delen holdere med aluminiumsfolie.
5. PALM Imaging
- Sett opp PALM mikroskop i henhold til produsentens anbefalinger. Temperaturen i en EMCCD kamera bør settes til -70 ° C eller lavere.
- Påfør gullpartiklene (# 790122-010 - 2x konsentrert, mikrokuler-nanospheres.com) i oppløsning (ca. 50 pl) til prøven som skal avbildes. Tillat løsningen å sitte i 30 sekunder på dekslerleppe mens under en svart beskyttelse.
- Fjern gull løsningen ved å blåse det til kanten av dekkglasset og absorberende den med en kimwipe.
- Sett dekkglasset i en sirkulær dekkglass holder. Hvis det er nødvendig, gjelder vakuum fett på felgen for å holde dekkglasset på plass.
- Påfør immersjonsolje til undersiden av dekkglasset, rett under prøvene.
- Sett prøveholderen inn i sporet på scenen av mikroskopet. Ta ekstra hensyn ikke å røre målene.
- Juster holderen så det er tett og sentre avsnittene ovenfor målet.
- Finn delene ved hjelp av en 10x objektiv.
- Endre til 100x objektiv.
- Fokuser på prøven.
- Finn en region av interesse ved å observere styrken av fluorescensen signaler. Bruk 488 nm laser og øke intensiteten i Kanaler-menyen til 10%. Fokuser på de områdene av smarteste fluorescens. Vær oppmerksom på at dette trinnet er ikke nødvendig hvis regionen of interesse kan identifiseres i den lyse feltet ved øyet.
- Slå laser til 561 nm og øke intensiteten til 100% for å bleke ut bakgrunnen autofluorescens. Blekemiddel prøven for ~ 2 min.
- Hvis fokuset endres under bleking, la 5 min skal gå før justering av fokus og ta bilder. Denne pausen gjør at temperaturen stabilisere seg. Hvis PALM omfanget er utstyrt med en inkubering kammer, stille inn temperaturen til 20 ° C og vente ~ 2 hr til stabilisere temperaturen i kammeret.
- Når bleking er fullført, må du aktivere 405 nm laser og sett den til den laveste intensitet.
- Begynne å samle bildene på 20 bilder per sekund. Vi innhenter vanligvis 5000-6000 bilder per eksperiment, men antall rammer bør justeres avhengig av formålet med forsøket. For eksempel, hvis alle proteiner i en region av interesse må avbildes, bør rammenummeret økes.
- Hvis signalene er sparsom eller svak, sakte øktese den 405 nm laser intensitet.
- Under kjøpsprosessen, sørg for å holde prøvene i fokus ved forsiktig justere rattet som er nødvendig.
- Når bildene er samlet, bør PALM analysen utføres. For tdEos, filtrerer vi ut noen signaler som fluoresce mer enn 500 msek fordi disse signalene skyldes mest sannsynlig autofluorescens.
6. SEM Imaging
- Før SEM avbildning flekken seksjonene med 2,5% uranyl acetat (i vann) i 4 minutter. Vask av uranyl acetate grundig med filtrert milliQ vann.
- Etter seksjonene er tørket, karbon-coat dekkglasset ved hjelp av en karbon frese til dekkglass blir ganske mørkt. Påfør ene enden av karbon ledende tape på kanten av dekkglasset og den andre enden på metal stubben slik at elektroner som akkumuleres på overflaten av dekkglasset er jordet.
- Monter prøven inn i SEM kammeret (FEI Nova Nano).
- Sett inn vcd detektoren. Lukk kammeret og pumpe den bruker høyvakuum innstillingen.
- Gang evakuert, åpne kolonnen ventil slik at elektronstråle påføres en prøve.
- Utfør en rutinemessig justering av elektronstråle.
- Finn prøven.
- Når fokus er justert, knytte prøveskinne og bringe opp scenen til 5 mm under polstykket.
- Tar en lav forstørrelse bilde av prøven (~ 5000 x).
- Zoom inn i regionen av interesse og få høy forstørrelse (50.000 x) bilder.
- Flytt til neste avsnitt, og gjenta trinn 6.10) og 6.11) til alle seksjonene er avbildes.
7. Samkjøre PALM og EM Images
- Åpne Photoshop og oppkjøpte SEM bilder.
- Opprette et nytt vindu med dimensjoner på 5000 x 5000 piksler og 300 piksler / tomme oppløsning.
- Kopiere lav forstørrelse SEM bilde i nytt vindu (Figur 1A).
- Skalere bildet slik at det fyller opphele vinduet ved hjelp av transformeringen manipulasjon (Command + T for en Mac).
- Kopier høyere forstørrelse SEM bilder og skalere dem etter behov.
- Vend summen TIRF bildet horisontalt ved å velge bilde rotasjon fra bildet rullegardinmenyen bar.
- Kopier og lim inn summen TIRF bildet (fra PALM) i et nytt lag.
- Skalere bildet ved hjelp av transform manipulasjon og roter som er nødvendig for å matche fluorescens av gull partikler (hvite piler i figur 1A) med tilsvarende strukturer visualiseres i SEM (figur 1B).
- Kopier PALM bilde inn et nytt lag og bruk samme transformasjon (figur 1C). En høyere forstørrelse bilde kan ekstraheres fra dette bildet (figur 2).
- For presentasjon, kopiere forvandlet PALM bilde inn et nytt lag. Velg de PALM signaler, men ikke bakgrunnen ved hjelp av "fargeområde" i "select" drop-down menyen. Sørg for å select bakgrunn pixel som en referanse pixel og slå på "invertere" alternativet.
- Skjær de ønskede PALM signaler og lime dem inn på et nytt lag.
- Bruke gjennomsiktighet til bakgrunnslaget, og sett den til 10%. Dette gjør det mulig for visualisering av håndflaten signaler ved å gjøre bakgrunnen transparent uten å svekke deres intensitet (figur 2D).
8. Representant Resultater
Histone merket med tdEos kan stabilt uttrykt i nematode C. elegans, og de transgene dyr ble behandlet ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor. Håndflaten og elektron mikrografer ble kjøpt fra samme seksjon (figur 1). Å justere bildene, er summen TIRF bildet, som summerer fluorescens over hele tidsforløpet, kledde på elektron micrograph. Gull nanopartikler vises i både fluorescens og elektron mikrografer og kan brukes til å justere de to bildene ved hjelp 'transform "-funksjonen i Photoshop (figur 1A og B). Deretter ble den samme 'transform' verdi påføres PALM bilde (figur 1C). På dette forstørrelse kan strukturelle detalj ikke skjelnes, så vi zoomet inn i et område nær den øvre enden av mikrografi (figur 2). I høy forstørrelse bildet, kunne subcellulære detaljer som en kjerne, en kjerne, kjernefysiske porene, og endoplasmatiske retikulum følges. Videre er de merkede histone molekyler utelukkende lokalisert til kjernen, men ikke til kjerne, som forventet. Den correlative PALM og elektronmikroskopi kan dermed for protein lokalisering på høyeste oppløsning.
Fem problemer kan kompromittere kvaliteten på bildene. Først, kan iskrystall skade forvrenge ultrastructure (Figur 3A og B). Plassere prøvene i en Cryo-protectant slik som bakterier, noe som reduserer spredning av iskrystaller, kan redusere disse skadene. Likevel,må man fortsatt skjermen prøver ved elektronmikroskopi og forkaste dem med frysing gjenstander. Det andre, GMA ikke tverrbinde til vev som epoksyharpikser, og dermed prøvene ofte bryte løs fra det omgivende plast og strekke, krympe eller falle ut av seksjonen (figur 3C og D). Disseksjon av prøven unna bakterier eller andre Cryo-beskyttelsesmiddel før innebygging tilveiebringer større adhesjon av plasten til prøven (Figur 3C). Tilsvarende strukturer som lipid dråper i tarmen ofte dissosiere fra vevet på grunn av fravær av tverrbinding (figur 3E). Tredje, ufullstendig polymerisasjon av plast årsaker strekking eller folding av vev (figur 3F), tilstedeværelse av oksygen i prøven hindrer også polymerisering av GMA. Fjerde, resulterer de fattige seksjonering kvaliteten på GMA ofte i en inkonsekvent morfologi (Figur 3G og H). GMA seksjoner bør kuttes på70 nm eller tykkere og ved en hastighet på rundt 1,6 mm / s for å minimere snitting artefakter. Femte, bakgrunn autofluorescens fra støv på dekkglasset eller delen er uunngåelig. Autofluorescens mot støv kan reduseres ved å bruke pre-renset dekkglass og ved å unngå støv forurensning fra kimwipes og filter papir som beskrevet i protokollen. PALM analyseprogrammet kan redigere ut signaler fra prøven eller plast som fluoresce lenger enn typiske signaler fra fluorescerende proteiner (figur 2 A og B). Det endelige bildet vil derfor være fri for slike gjenstander.
Figur 1. Justere fluorescens og elektron mikrografer med gull nanopartikler. (A) En lav forstørrelse elektron micrograph fra et tverrsnitt av C. elegans uttrykker de merkede histone tdEos :: HIS-11. Hvitrrows indikerer 100 nm elektron-tett gull nanopartikler brukt før PALM bildebehandling som fungerer som fiducial merker. (B) De gullperler fluoresce ved eksponering til ~ 580 nm lys og skape fiducial merkene i fluorescens bildet. Summen TIRF bildet er justert på et elektron micrograph basert på plasseringen av de fiducial merkene. Summen TIRF bilde representerer alle fotoner oppdaget av kameraet under den eksperimentelle tidsforløp. Vær oppmerksom på at lyse flekker på øvre venstre (hvit pil) oppstå fra klynger av gull partikler. (C) En PALM bildet blir deretter tilsatt til elektron mikrofotografi og rotert og oversettes basert på verdiene bestemt fra sammenstillingen av summen TIRF bildet i (B). Klikk her for å vise større figur .
Figur 2. Correlative nano-FEM hjelp histone fusjonsproteiner. (A) Sum TIRF bilde av tdEos :: HIS-11 kjøpt fra en tynn seksjon (70nm). (B) Tilsvarende PALM bilde av tdEos :: HIS-11. Autofluorescens (hvit pil) varer lenger enn 500 ms ble filtrert ut av PALM programmet. (C) Electron micrograph av en kjerne ervervet fra den samme delen. (D) correlative PALM bilde og elektron micrograph av tdEos :: HIS-11. Fluorescens er tett lokalisert til kromatin i kjernen.
Figur 3. Problemer forbundet med nano FEM. (A) Electron mikrografi av en C. elegans kroppens muskler uten iskrystall skade. (B) Electron mikrografi av en kropp muskel med iskrystall skade. Istedenfor diskrete tverrsnitt er aktin og myosin filamenter kollapset i tilslag på grunn av dannelsen av iskrystaller. (C, D) Lav forstørrelse elektron micrographs, som viser dissosiasjon av ormer fra de omkringliggende mediet. Seksjonen er mer forvrengt i en prøve som er omgitt av de Cryo-beskyttende bakterier (D) enn når prøven er omgitt av plast (C). Den bakterielle Cryo-beskyttelsesmiddel i gallette bør dissekert bort fra den fikserte prøve før plast omslutning. Legg merke til at dyret til høyre i (D) ble delt skrått, og dermed form er ikke på grunn av forvrengning av vev. (E) Electron micrograph av tarmen, viser dropouts av vev (svarte piler). (F) Electron micrograph av nerve ring viser bretting av seksjoner grunnet ufullstendig polymerisasjon av plast (svarte piler). (G, H) Electron mikrografer av nerveceller fra den samme prøven, seksjoneres på forskjellige datoer. Bevaring av vev er superb på én dag (G), men slik morfologi dekkes av inkonsekvent seksjonering kvalitet (H). Klikk her for å view større figur.
Discussion
Her beskriver vi hvordan å bevare fluorescerende proteiner i plast, lokalisere fluorescerende proteiner i seksjoner, og bilde av ultrastructure hjelp elektron mikroskopi. Proteiner ble lokalisert under diffraksjon grensen ved hjelp av PALM mikroskop for å nanometer oppløsning. For å tilpasse denne protokollen til bestemte prøver, bør følgende parametre tas i betraktning: fluoroforen, kvantifisering og justering.
Valg av fluorescerende protein eller organisk fluoroforen avhenger av programmet og modellsystem. Vi har testet en rekke fluorescerende proteiner, inkludert EGFP, YFP, Citrin, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry, og Dendra 12. Bevaring av fluorescens fra hver fluorofor var lignende, noe som tyder på at alle fluorescerende proteiner kan bevares ved hjelp av den beskrevne metode. Vi valgte tdEos fordi det uttrykt godt i C. elegans, forble proteiner funksjonell når smeltet tdEos, og fordifoto-aktivering karakteristika var optimal for PALM mikroskopi. Imidlertid har aggregering eller mislykkede uttrykk for tdEos stemt tidvis observert 12.
Avhengig av programmet, kan en annen fluorofor være bedre egnet. I mange tilfeller er det ikke nødvendig å bruke en foto-aktiverte fluorescerende protein. Enkelt correlative fluorescens elektronmikroskopi krever ikke foto-aktivert fluorescerende protein. GFP eller organiske fargestoffer kan brukes til å avbilde fluorescens fra kodede proteiner i avsnittene ovenfor diffraksjon grensen. For eksempel, kan en bilde en axon i neuropil med fluorescens mikroskopi og korrelere fluorescens signalet med en bestemt axon i elektronmikroskop micrograph av tenkelig fluorescensen på et fluorescensmikroskop. Andre super-oppløsningsteknikker som stimulert emisjon uttømming mikroskopi (Schibsted) 12, grunntilstanden uttømming mikroskopi etterfulgt av enkelt molekyl avkastning (GSDIM) 13, ogstrukturert belysning mikroskopi (SIM) 14, trenger ikke foto-aktiverte fluorescerende proteiner. Videre super-oppløsning imaging teknikker som bruker organiske fargestoffer 9,15,16 eller iboende egenskap av fluorescerende prober 17 er lett anvendelig.
I PALM, kan antallet molekyler kvantifiseres fordi fluorescens av hvert molekyl separeres romlig og tidsmessig. Imidlertid kan kvantifisering være misvisende for fire grunner: oksidasjon, undercounting, overcounting og overekspresjon. Først kan en brøkdel av de fluorescerende proteiner denatureres eller oksidert under prøvebehandling 5,12. Selv ~ 90% av den fluorescens-signalet ble bevart gjennom fiksering og innstøping i protokoll vår, kan oksydasjon av fluorescerende protein være etter prøven har vært delt og overflaten utsettes for oksygen. Sekund, er aktiveringen av foto-aktiverbart proteiner stokastisk, og dermed flere molekyler kan væreaktivert i en gitt diffraksjon begrenset spot 8. Fluorescens fra de multiple molekyler vil vises som en flekk, og dermed det totale antall proteiner vil bli undercounted. Tredje, kan et lignende problem føre til overcounting. I PALM er hver fluorescerende protein lokalisert og deretter "slettet" ved bleking. Imidlertid kan fluorescerende proteiner tilbake fra den mørke tilstanden uten å være permanent bleket 18. Slike molekyler blir deretter telles flere ganger. Fjerde, merket proteiner er uttrykt som transgener og er ofte til stede i flere eksemplarer, noe som kan føre til overexpression. Derfor kan kvantifisering fra PALM brukes til å anslå men ikke nøyaktig fastslå antallet av molekyler i et gitt sted.
Justeringen av en PALM bilde med en elektron mikrofotografi kan også være utfordrende på grunn av oppløsningen forskjellen i lys-og elektronmikroskopi og forvrengning forårsaket av elektronstrålen. Gullpartiklene tjene som tett localized fiducial markører i elektron mikrografer. Imidlertid er fluoresecence fra gull partikler ikke foto-aktivert, og fremstår som en stor diffraksjon-begrenset plass. Således er plasseringen av et fluorescens bilde over en elektron micrograph et estimat. Skjevheter kan også oppstå fra interaksjoner av elektroner med plastdelen. Akrylharpikser som GMA er mindre stabile under elektronstrålen, og dimensjonene på plasten kan endres. Under disse omstendigheter kan samkjøre fluorescensen med ultrastructure kreve ikke-lineær transformasjon av de fiducial markører.
Disclosures
Produksjon og fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Carl Zeiss, Inc.
Acknowledgments
Vi takker Harald Hess og Eric Betzig for tilgang til PALM mikroskop for proof-of-prinsippet eksperimenter, Richard Fetter for å dele fiksering protokoller, reagenser og oppmuntring. Vi takker Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema og Marc Hammarlund for DNA-konstruksjoner. Vi vil også takke Carl Zeiss Inc. for å gi tilgang til Zeiss PAL-M, en beta versjon av Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure freezer | ABRA | HPM 010 | EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used. |
| Automated freeze substitution unit | Leica Microsystems | AFS 2 | AFS 1 can also be used. |
| Zeiss PALM |  Carl Zeiss, Inc. |
ELYRA P.1 | Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes. |
| Scanning electron microscope | FEI | Nova nano | Other high-resolution SEM microscopes can be used. |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-1L | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19134 | |
| Potassium permanganate | EMS | RT20200 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | pH of uranyl acetate from this company is slightly higher. |
| Glycol methacrylate (GMA) | SPI Supplies | 02630-AA | Low acid, TEM grade. |
| N,N-Dimethyl-p-toluidine | Sigma-Aldrich | D9912 | |
| Cryo vials | Nalge Nunc international | 5000-0020 | |
| Glass vials | EMS | 72632 | |
| Aclar film | EMS | 50425-10 | |
| BEEM capsule | EBSciences | TC | Polypropylene |
| 3/8" DISC punches | Ted Pella, Inc. | 54741 | |
| Gold nanoparticles | microspheres-nanospheres.com | 790122-010 | Request 2x concentrated solution |
References
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).
- Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
- Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
- Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
- Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
