Summary
우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.
Abstract
단백질의 분포를 매핑하면 셀에 단백질의 기능을 이해하는 것이 필수적입니다. 형광 현미경은 광범위하게 단백질 현지화에 사용하지만, subcellular 문맥 형광 이미지에 자주 결석입니다. Immuno-전자 현미경은 반면에, 단백질을 지역화 할 수 있지만, 대부분의 항원이 표본 표면에 노출되지 않기 때문에 기술은 호환 항체, 형태와 가난한 보존의 부족에 의해 제한됩니다. 상호 접근 방식 중 하나 immuno-형광이나 유전자 태그 단백질, 먼저 전체 셀에서 형광 이미지를 취득 할 수 있습니다. 예제는 다음 고정 및 전자 현미경에 내장하고, 이미지가 1-3 상관이됩니다. 그러나, 낮은 해상도 형광 이미지와 fiducial 마커의 부족은 단백질의 정확한 현지화를 배제.
또한, 형광 이미징은 플라스틱의 표본을 보존 한 후에 수행 할 수 있습니다. 에이 방법은 블록 sectioned이며, 형광 이미지와 동일한 섹션의 전자 micrographs는 4-7를 서로 관련되어 있습니다. 그러나, 상관 이미지에 빛의 회절 한계는 개별 분자의 위치를 가린다하고, 형광은 종종 세포의 경계 넘어 확장합니다.
나노 해상도 형광 전자 현미경 (나노 FEM)이 사진 활성 현지화 현미경 (PALM)과 전자 현미경을 사용하여 이미징 같은 섹션으로 나노 스케일의 단백질을 현지화하기 위해 설계되었습니다. PALM는 영상 개인 형광 단백질에 의해 회절 한계를 극복하고 이후 각 형광 현장 8-10의 중심을 매핑.
우리는 다섯 단계에있는 나노 FEM 기술을 설명합니다. 먼저, 예제는 고정 및 태그 단백질의 형광을 보존 조건을 사용하여 포함하고 있습니다. 둘째, 수지 블록 장착 ultrathin 세그먼트 (70-80 nm 정도)에 sectioned 아르커버 유리에. 셋째, 형광은 Zeiss의 PALM 현미경을 사용하여 이러한 섹션에 이미징된다. 넷째, 전자 고밀도 구조는 스캔 전자 현미경을 사용하여 이러한 동일한 섹션에 이미징 있습니다. 다섯째, 형광 및 전자 micrographs는 fiducial 마커 등의 금 입자를 사용하여 정렬된다. 요약하면, 휘황 태그 단백질의 subcellular 지방화는 약 1 주일 나노 미터 해상도로 결정될 수있다.
Protocol
1. 고압 동결
- 귀하의 표본에 적합한 매체 (예를 들어, 셀의 문화를 문화 매체, C. elegans에 대한 M9) 1 ML에 BSA의 0.2 g을 추가하여 cryo-protectant를 준비합니다. 모든 BSA가 해소 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 품다.
- 냉동하기 전에, 액체 질소로 자동 냉동 대체 장치 (Leica AFS)를 작성
- AFS 프로그램을 설정 : -90 ° C 5-30 인사 * 5 ° C / 시간 -60에 ° C, -60 ° 2 시간 (또는 Leica AFS 2를 사용하는 경우 "일시 중지"옵션을 선택)에 대한 C, 72 시간 5 ° C / -30에 시간 ° C 및 -30 ° C. AFS 시스템 이상 다섯 단계를 가질 수 경우 -30 ° C 단계는 0 시간으로 설정 "일시 중지"옵션을 사용하여 대체해야 두 추가 단계를 추가해야합니다 : 10 ° C / -20 시간 ° -20 ° C.에서 C, 24 시간 기계 다섯 단계로 제한되어있는 경우 다음과 같이 다른 메모리 슬롯에 다른 프로그램을 설치 : 10 ° -20 C / 시간 ° C와 24 H를-20 ° C.의 연구
여기에 * 시간은 -60 ° C 단계는 이른 아침에 시작되도록 조정할 수 있습니다. - 무수 아세톤 (EMS, # RT10016)의 10 ML에 0.1 g의 오스뮴의 tetroxide 크리스탈 (EMS, RT19134)를 혼합하여 1 % 오스뮴의 tetroxide 주식 솔루션을 준비합니다. 다음과 같이 50 ML 원뿔 튜브에 fixatives를 준비합니다. 첫째, milliQ 물 1 ML을 추가 한 다음 거기에 칼륨 과망간산 염의 0.02 g (EMS, RT20200)을 분해. 아세톤의 19 ML를 추가하고 잘 섞는다. 마지막으로, 튜브에 1 % 오스뮴 주식 솔루션 20 μl를 추가합니다. 아세톤은 무료 라디칼 스 캐빈 저 11 그래서 플라스틱 중합을 방지하지만, 냉동 대체 매체로 아세톤의 사용 때문에 지질과의 상호 작용의 형태를 유지하는 데 필요합니다. 아세톤은 플라스틱 침투하기 전에 에탄올로 대체 될 것입니다. 나누어지는 1 개 cryovial에 ML 및 액체 질소에 튜브를 저장하여 냉동 fixatives을 유지.
- 20 % BSA 나 세균과 표본 캐리어를 입력합니다.20 % BSA와 박테리아 모두 cryo-보호제 역할을합니다. 표본 운송인의 유형에 대한 선택은 표본에 따라 달라집니다. C.에 대한 elegans는 잘 100 μm를 사용합니다.
- 이동 통신사에서 표본을 놓고 고압 냉동기를 사용하여 고정.
- 냉동 한 후 액체 질소에 따라, fixatives를 포함하는 cryotube으로 표본을 전송합니다. 표본은 항상 액체에서 유지해야합니다.
- ) 1.5를 반복 - 1.7)을 모든 표본이 고정되어 때까지.
- AFS 단위로 모든 cryotubes를 전송하고, 프로그램을 재개한다.
2. 냉동 대체
- 온도가 -60에 도달하면 ° C, AFS에 95 % 아세톤 20 ML을 포함하는 장소 병.
- 온도가 -50 ° C에 도달하면 여섯 시간은 2 시간의 기간 동안 95 %의 아세톤으로 fixatives를 교체하십시오.
- 챔버에 95 % 아세톤에 0.1 % uranyl 아세트산의 20 ML (Polysciences, # 21447-25)을 포함하는 병을 놓고사전 그만해 -50에 ° C.
- 세척 단계의 끝에서, 각각의 유리 병에 uranyl 아세트산 솔루션의 ~ 1 ML을 추가합니다. 필요한 경우 프로그램을 일시 중지를 해제.
- 온도가 -30 ° C에 도달하면 여섯 시간은 2 시간의 기간 동안 95 %의 에탄올과 uranyl 아세테이트를 교체하십시오.
- 한편, 22.3 ML GMA, 10ml N-부틸 메타 크릴 레이트, 1 ML milliQ 물, 그리고 0.2 g 벤조일의 과산화수소를 혼합하여 97% 글리콜 메타 크릴 레이트 수지 (GMA, SPI 용품 / 구조 프로브, 주식회사, # 02630-AA)를 구성 (촉매). (EMS, # 72632) 유리 병에 보관하고 95 % 에탄올로 혼합하여 30% GMA를 준비합니다. 중합의 품질 폴리에틸렌 기반 플라스틱의 장기 저장을 방해하기 때문에 플라스틱 튜브에 GMA 미디어를 보관하지 마십시오. -30 ° C.에 사전 시원한 GMA 솔루션
사람들이 무수와 형광 단백질을 quenches있는 산성 때문에 이러한 Araldite와 Epon 등 전통적인 에폭시 수지는 프로토콜에 사용할 수 없습니다. 이러한 LR 화이트, C와 같은 아크릴 수지,물 소량의를 용납하고 형광 단백질을 보존 할 수 있지만 산성 pH는 형광 12을 해소하는 경향이있다. GMA 사실은 필요 물을 작은 금액 및 (pH8) 12 알칼리성이며, 허용합니다. GMA 불행하게도 다소 부서지기 쉬운 것입니다. 또한, GMA는 기존 에폭시 수지 모른다 조직과 상호 연결하지 않습니다. 품질을 sectioning의 GMA 원인의 불일치 이러한 특성 특히 80 나노 미터보다 얇은 sectioned.
GMA의 수명은 년 정도이지만, GMA는 품질을 보장하기 위해 구입 3 개월 이내에 사용해야합니다.
3. 침투 및 중합
단계 3.1-3.3는 냉동 대체에 사용 된 것과 같은 cryovials에서 수행됩니다. 침투와 중합는 형광 단백질을 보존 할 수있는 AFS에서 -30 ° C에서 수행됩니다.
- 95 %의 에탄올과 GMA 주식 솔루션을 혼합하여 침투 미디어를 준비합니다. 표본을 품다3-5 시간 30 % GMA 인치
- 4-6 시간에 70% GMA의 표본을 품다.
- 밤새 97% GMA의 표본을 품다.
- 다음 날, 신선한 97% GMA를 구성합니다.
- 퍼가기 금형 (EBSciences, # TC)에 샘플을 전송합니다. "디스크 펀치 (테드 펠라 주식회사) 3 / 8을 사용하여 ACLAR 영화의 디스크 (EMS, # 50425-10)를 준비하고 BEEM 캡슐의 하단에있는 디스크를 넣습니다.
- 교환 -30 ° C.에있는 97% GMA 세 번 이상 6 시간
- 세 번째 교환 후, 1.5 μl / 1 ML GMA의 농도에서 GMA에 개시 N, N-디메틸-P-toluidine (시그마 - 알드리치, # D9912)을 추가하고 각 표본 금형에이 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 즉시 AFS에있는 퍼가기 금형의 표본을 배치.
과산화 벤조일 너무 감동이 필요하지 않습니다 촉매 및 모든 침투 단계에서 존재합니다. 이 화학 창시자 N, N,-디메틸-P-toluidine에 노출 될 때까지 과산화 벤조일은 플라스틱 중합하지 않습니다. 기자는 폴을 활성화ymerization 즉시 1 시간 이내에도 조직의 수지를 중합 것입니다. 그럼에도 불구하고, 조직 끊김은 불완전한 중합에 의한 깊은 조직 될 수 있습니다. 또한, GMA는 잘 블록에 표본을 crosslink하지 않기 때문에 박테리아의 행렬에 활용하여 cryoprotectant에서 표본을 구분합니다.
중합은 AFS의 외부 수행되는 경우 퍼가기 금형은 산소에 노출을 차단하는 aclar 디스크로 가득해야합니다. 산소에 노출되면 GMA는 완전히 중합하지 않습니다. - 가 1 시간 이내에 polymerizes에도 불구 플라스틱 밤을 치료 할 수 있습니다.
- 형광 단백질이 산소에 노출되지 않도록 추가로 처리 할 때까지 냉장고에 질소 가스 충전 진공 가방 (Ziploc) (-20 ° C)에서 표본을 저장합니다.
4. Sectioning
- GMA - 임베디드 표본의 Sectioning 것은 epon - 임베디드 표본에서와 동일한 방식으로 수행 할 수 있습니다. 추가주의 걸릴해야합니다GMA가 매우 친수성이며, 그들이 양쪽에 침수하는 경우 리본이 물 목욕으로 구동되기 때문에 N sectioning 표면에 오줌하기 않습니다.
- TIRF 현미경은 현지화에 사용하는 경우 유리 coverslip에 섹션 (50-80 nm 정도)의 리본을 수집합니다. 그렇지 않으면, 전송 전자 현미경에 만든 격자를 사용합니다. 절삭 속도는 at1.6 mm / s의 이상을 설정해야합니다. 그렇지 않으면, 리본이 형성되지 않을 수 있습니다.
- -20 ° C에서 저장 섹션이 아니라면 즉시 이미징. 알루미늄 호일로 섹션 소지자을 다루는하여 UV 빛에서 fluorophores를 보호합니다.
5. PALM 이미징
- 제조업체 권장 사항에 따라 PALM 현미경을 설정합니다. EMCCD 카메라의 온도는 ° C 또는 아래 -70로 설정해야합니다.
- 이미징 될 수있는 샘플에 솔루션 (약 50 μl) - 금 입자를 (배 농축, 마이크로 - nanospheres.com # 790122-010) 적용됩니다. 솔루션은 표지에 30 초 동안 앉아 할 수 있도록 허용검은 색 커버 케이스 하의 입술.
- coverslip의 가장자리에 불어와 kimwipe로 흡수하여 금 솔루션을 제거합니다.
- 원형 coverslip 홀더에 coverslip를 삽입합니다. 필요한 경우, 장소에 coverslip을 유지 가장자리에 진공 그리스를 적용 할 수 있습니다.
- 직접 샘플 아래 coverslip의 아래쪽에 집중 오일을 적용합니다.
- 현미경의 무대에 슬롯에 샘플 홀더를 삽입합니다. 목표를 만지지 마 특별히 조심하고.
- 꽉하고 객관적인 위의 부분을 센터를하도록 홀더를 조정합니다.
- 10X 목적 렌즈를 사용하여 섹션을 찾습니다.
- 100x 목표 렌즈로 변경합니다.
- 표본에 초점을 맞 춥니 다.
- 형광 신호의 강도를 관찰하여 관심 영역을 찾습니다. 488 nm의 레이저를 사용하여 10 % 채널 메뉴에서 강도를 높일 수 있습니다. 밝은 형광 등의 분야에 초점을 맞 춥니 다. 이 단계가 필요하지 않습니다 점에 유의 지역 O 경우F 관심은 눈으로 밝은 분야에서 식별 할 수 있습니다.
- 561 나노 미터로 레이저를 전환 배경 autofluorescence 아웃 표백제로 100 % 강도를 높일 수 있습니다. ~ 2 분에 대한 블리치 샘플을.
- 표백하는 동안 초점을 변경하면, 초점을 조정하고 이미지를 캡처하기 전에 경과에 5 분 할 수 있습니다. 이 일시 정지는 온도가 안정화 할 수 있습니다. PALM 범위는 배양 챔버가 설치되어있는 경우, 20의 온도를 설정 ° C와 챔버의 온도를 안정화 ~ 2 시간 기다립니다.에게
- 표백이 완료되면 405 nm의 레이저를 활성화하고 낮은 강도로 설정합니다.
- 초당 20 프레임의 이미지를 수집 시작합니다. 우리는 일반적으로 실험 당 5,000-6,000 프레임을 수집하지만, 프레임의 수는 실험의 목적에 따라 조정해야합니다. 관심 지역의 모든 단백질은 이미징해야하는 경우 예를 들어, 프레임 번호가 증가한다.
- 신호가 희박한 또는 희미한 경우, 천천히 increaSE 405 nm의 레이저 강도.
- 인수 과정에서 신중하게 필요에 따라 노브를 조정하여 초점이 샘플을 유지해야합니다.
- 이미지가 수집되면, PALM 분석이 수행되어야한다. tdEos를 들어, 우리는 그 신호 가능성이 autofluorescence로 인해 때문에 500 밀리 초 이상 형광 어떤 신호를 필터링합니다.
6. SEM 영상
- SEM 이미지에 앞서, 4 분에 대해 2.5 % uranyl 아세테이트를 (물)를 사용하여 섹션을 얼룩. 필터링 milliQ 물과 함께 철저하게 uranyl 아세트산을 씻으십시오.
- 섹션 건조 후 coverslip가 상당히 어두운 될 때까지 탄소를 사용하여 탄소 코팅 coverslip은 스퍼터. coverslip의 표면에 축적 전자가 접지되도록 금속에 적혀있는 coverslip과 다른 쪽 끝의 가장자리에 탄소 전도성 테이프의 한쪽 끝을 적용합니다.
- SEM 챔버 (페이 노바 나노)로 표본을 탑재합니다.
- VCD 검출기를 삽입합니다. 챔버를 닫고 높은 진공 설정을 사용하여 펌프.
- 그 전자 빔이 시편에 적용되므로 일단 대피, 열 밸브를 엽니 다.
- 전자 빔의 일상 정렬을 수행합니다.
- 표본을 찾습니다.
- 포커스가 조정되면 표본 단계를 연결하고 자극 조각 아래 5mm로 무대를 가져.
- 표본 (~ 5,000 x)의 낮은 배율 이미지를보세요.
- 관심 지역으로 확대하고 (50,000 X) 이미지를 높은 배율을 구하십시오.
- 다음 섹션으로 이동, 모든 섹션 이미징 될 때까지 단계 6.10)와 6.11)를 반복합니다.
7. 정렬 PALM 및 EM 이미지
- 오픈 포토샵과 인수 SEM 이미지.
- 5000 X 5000 픽셀, 300 픽셀 / 인치 해상도의 크기로 새 창을 만듭니다.
- 새 창 (그림 1A)로 낮은 배율 SEM 이미지를 복사합니다.
- 그가 채우도록 이미지 크기를 조정변환 조작 (명령 + Mac 용 T)를 사용하여 전체 창입니다.
- 이미지 SEM 높은 배율을 복사하여 그들에게 필요한 확장.
- 이미지 드롭 다운 메뉴 바에서 이미지 회전을 선택하여 수평 합 TIRF 이미지를 뒤집습니다.
- 합 TIRF 이미지 (PALM에서) 새 레이어에를 복사하여 붙여 넣습니다.
- SEM에 시각화 해당 구조 (그림 1b)와 금 입자 (그림 1A에 흰색 화살표)의 형광을 일치시킬 필요한 회전 후 변환 조작을 사용하여 이미지 크기를 조정합니다.
- 새 레이어로 PALM 이미지를 복사하여 동일한 변형 (그림 1C)을 적용 할 수 있습니다. 높은 배율 이미지가이 이미지 (그림 2)에서 추출 할 수 있습니다.
- 프리젠 테이션를 들어, 새 레이어로 변환 PALM 이미지를 복사합니다. '선택'드롭 다운 메뉴에서 "색상 범위를"사용하여 PALM 신호가 아닌 배경을 선택합니다. SEL에 있는지 확인참조 픽셀로 배경 픽셀 요법하고 "반전"옵션을 설정합니다.
- 원하는 PALM 신호를 잘라 새 레이어에 붙여 넣습니다.
- 배경 레이어에 투명도를 적용, 10 %로 설정합니다. 이 자신의 강도 (그림 2D)을 손상시키지 않고 배경이 투명하기로 PALM 신호의 시각화 할 수 있습니다.
8. 대표 결과
tdEos 태그가 히스톤은 안정적으로 선충류 C.로 표현 될 수있다 elegans, 그리고 유전자 변형 동물 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 처리 하였다. PALM 및 전자 micrographs은 같은 섹션 (그림 1)에서 획득했다. 이미지를 정렬하려면, 전체 시간 동안의 형광을 표현 합 TIRF 이미지가, 전자 현미경에 중첩되어 있습니다. 금 나노 입자는 형광 및 전자 micrographs 모두 표시하고 'transf을 사용하여 두 이미지를 정렬하는 데 사용할 수 있습니다포토샵의 ORM '기능 (그림 1A 및 B). 그런 다음, 같은 '변환'값은 PALM 이미지 (그림 1C)에 적용되었습니다. 이 배율에서 구조 상세는 구별 할 수는 없습니다, 그래서 우리는 현미경 (그림 2)의 상단 끝 부분 영역으로 확대. 높은 배율 이미지에, 이러한 핵, nucleolus, 핵 기공 및 endoplasmic 소포체 등의 subcellular 내용은 관찰 될 수 있습니다. 또한, 태그 히스톤 분자는 단독으로 핵에 번역되어 있지만하지 nucleolus에 예상대로. 상호 PALM과 전자 현미경 따라서 가장 높은 해상도 단백질 현지화 할 수 있습니다.
다섯 문제는 이미지의 품질을 손상 할 수 있습니다. 첫째, 얼음 크리스탈 손상 (그림 3A와 B) ultrastructure을 왜곡 할 수 있습니다. 얼음 결정의 전파를 감소 등 cryo-protectant 박테리아,에서 표본을 배치하면이 손상을 줄일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,하나는 여전히 전자 현미경으로 표본 검사를 실시하고 냉동 유물있는 사람을 삭제해야합니다. 둘째, GMA는 에폭시 수지와 같은 조직에 대한 연결을 통과하지 않으며, 따라서 표본은 종종 주위의 플라스틱 및 신장에서 판이, 축소 또는 부분 (그림 3C와 D)에서 떨어지다. 거리에 cryo-protectant 삽입하기 전에 박테리아 또는 다른에서 샘플의 해부는 표본 (그림 3C)에 플라스틱보다 접착력을 제공한다. 마찬가지로, 마음 속에서 지질 방울과 같은 구조는 종종 상호 연결의 부재 (그림 3E)로 인해 조직에서 떼어 놓다. 셋째, 조직의 스트레칭이나 개고 플라스틱 원인 불완전한 중합 (그림 3 층)은, 표본의 산소의 존재도 GMA의 중합을 막는. 넷째, GMA의 가난한 sectioning 품질은 종종 일관성 형태 (그림 3G 및 H)에서 발생합니다. GMA 섹션은 다음 페이지에서 절단해야70 나노 미터 또는 두꺼운 주위에 1.6 mm / s의 속도로이 유물을 sectioning 최소화합니다. 다섯째, coverslip 또는 섹션에 먼지 배경 autofluorescence은 피할 수 있습니다. 먼지 Autofluorescence는 미리 청소 coverslips를 사용하여 및 프로토콜에 설명 된대로 kimwipes 및 필터 종이에서 먼지 오염을 피하기로 최소화 할 수 있습니다. PALM 분석 프로그램은 형광 단백질의 전형적인 신호 (그림 2 A와 B)보다 더 형광 시료 또는 플라스틱에서 신호를 편집 할 수 있습니다. 최종 이미지는 따라서 이러한 유물을 무료로 될 것입니다.
그림 1. 금 나노 입자를 사용하여 형광 및 전자 micrographs를 정렬. C.의 단면에서 (A) A 낮은 배율 전자 현미경 태그 히스톤 tdEos을 표현 elegans :: HIS-11. 화이트rrows은 전자 집적 금은 사전 fiducial 마르크 역할을 PALM 영상에 적용 나노 입자 100 나노 미터를 나타냅니다. (B) 금 구슬 ~ 580 nm의 빛에 노출시 형광 및 형광 이미지의 fiducial 점수를 만들 수 있습니다. 합 TIRF 이미지가 fiducial 마르크의 위치에 따라 전자 현미경에 정렬된다. 합 TIRF 이미지는 실험 시간 과정 중에 카메라에 의해 감지 모든 광자를 나타냅니다. 왼쪽 상단 (흰색 화살표)에서 밝은 부분이 금 입자의 클러스터에서 발생합니다. (C) A PALM 이미지가 다음 전자 현미경 및 회전에 추가하고 (B)의 합 TIRF 이미지의 정렬에서 결정된 값을 기준으로 번역되어 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. tdEos의 히스톤 융합 단백질을 사용하여 나노 FEM 상호는. (A) 합계 TIRF 이미지 :: HIS-11은 얇은 섹션 (70nm)에서 인수했습니다. tdEos의 (B) 대응 PALM 이미지 :: HIS-11. Autofluorescence (흰색 화살표) 지속적인 이상 500 밀리 초는 PALM 프로그램에 의해 필터링되었습니다. (C) 핵의 일렉트론 현미경은 동일한 섹션에서 인수했습니다. (D) 상호 PALM 이미지와 tdEos의 전자 현미경 :: HIS-11. 형광은 단단히 핵의 염색질에 번역되어 있습니다.
그림 3. 나노 FEM과 관련된 문제. C.의 (A) 일렉트론 현미경 얼음 크리스탈 손상없이 elegans 몸의 근육. 얼음 크리스탈 손상과 신체 근육의 (B) 일렉트론 현미경. 대신 개별 크로스 섹션의, 고를와 마이 오신 필라멘트의이 얼음 결정의 형성으로 인해 집계에 무너 있습니다. (C, D) 낮은 배율 전자 현미경초, 주변 미디어에서 웜의 분리를 보여주고 있습니다. 섹션은 표본이 플라스틱 (C)로 둘러싸여 때보다 cryo-보호 박테리아 (D)로 둘러싸여 있습니다 표본 더 왜곡입니다. gallette의 세균 cryo-protectant는 플라스틱 삽입하기 전에 고정 샘플에서 떨어져 해부한다. (D)의 오른쪽에있는 동물이 obliquely sectioned이라고합니다, 따라서 형상은 조직의 변형으로 인해하지 않습니다. 조직의 끊김 (블랙 화살표)을 보여 소장의 (E) 일렉트론 현미경. 플라스틱의 불완전한 중합 (검은 색 화살표)로 인한 섹션 접이식을 보여주는 신경 고리의 (F) 일렉트론 현미경. 각기 다른 날짜에 sectioned 동일한 표본에서 뉴런의 (G, H) 일렉트론 micrographs. 조직의 보존은 하루 (G)에 탁월한이지만, 이러한 형태는 일관성 sectioning 품질 (H)에 의해 덮여 있습니다. V하려면 여기를 클릭하세요iew 큰 그림.
Discussion
여기 플라스틱, 전자 현미경을 사용하여 ultrastructure을 섹션에 형광 단백질을 현지화 및 이미지 형광 단백질을 유지하는 방법에 대해 설명합니다. 단백질은 나노 미터 해상도 PALM 현미경을 사용하여 회절 한계 이하로 현지화되었습니다. 특정 표본이 프로토콜을 적응하려면 다음 매개 변수 고려되어야합니다 : 형광, 정량화 및 정렬을.
형광 단백질 또는 유기 형광의 선택은 응용 프로그램 및 모델 시스템에 따라 달라집니다. 우리는 EGFP, YFP, 황수정, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry, 그리고 Dendra 12 등의 형광 단백질의 다양한, 테스트했습니다. 각 형광의 형광의 보존은 형광 단백질은 설명 방법을 사용하여 보존 할 수 있다는 제안, 비슷했다. 이 표현 때문에 우리는 C.에 잘 tdEos를 선택 elegans, 단백질은 tdEos에 융합 할 때 기능 유지, 그리고 또 다른 이유는 그사진 인증 특성은 PALM 현미경을위한 최적했다. 그러나, tdEos의 집합 또는 실패 표현식은 경우에 따라 12 관찰되었습니다.
응용 프로그램에 따라 다른 형광 더 적합한 수 있습니다. 대부분의 경우, 그것은 사진 활성 형광 단백질을 사용할 필요가 없습니다. 간단한 상호 형광 전자 현미경은 사진 활성 형광 단백질을 필요로하지 않습니다. GFP 또는 유기 염료는 회절 한도를 초과 섹션에 태그를 단백질에서 이미지 형광에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 이미지를 형광 현미경을 사용하여 neuropil의 축삭 및 이미징에 의한 전자 현미경에서 특정 축삭 형광 현미경에 형광과 형광 신호를 상관 관계 할 수 있습니다. 이러한 자극 방출 고갈 현미경 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 12, 개별 분자 수익 (GSDIM) 13 다음 바닥 상태의 고갈 현미경과 같은 다른 슈퍼 해상도 기술,구조적 조명 현미경 (SIM) 14 사진 활성 형광 단백질이 필요하지 않습니다. 또한, 유기 염료 9,15,16 또는 형광 프로브 17 본질적인 속성을 사용 슈퍼 해상도 이미징 기술은 쉽게 적용 할 수 있습니다.
각 분자의 형광이 spatially과 시간적으로 분리되어 있기 때문에 PALM에서 분자의 수는 정량화 할 수 있습니다. 산화, undercounting, overcounting 및 overexpression : 그러나, 정량화 네 이유로 오해의 소지가있을 수 있습니다. 첫째, 형광 단백질의 일부가 변성 또는 샘플 처리 5,12 동안 산화 할 수 있습니다. 형광 신호의 ~ 90 %가 우리의 프로토콜에 고정하고 삽입을 통해 보존되었지만 표본이 sectioned되었으며 표면이 산소에 노출 후, 형광 단백질의 산화가 발생할 수 있습니다. 둘째, 사진 activatable 단백질의 활성화 확률이며, 따라서 여러 분자가 될 수 있습니다주어진 회절 제한된 장소 8 활성화. 여러 분자의 형광은 한 점으로 표시됩니다, 따라서 단백질의 총 수는 undercounted됩니다. 셋째, 비슷한 문제가 overcounting 될 수 있습니다. PALM에서 표백하여 각 형광 단백질은 지역화되어 있으며 다음 "삭제". 그러나, 형광 단백질은 18 영구적으로 표백 않고 어두운 상태에서 돌아갈 수 있습니다. 이러한 분자 그런 다음 여러 번 계산 될 것입니다. 넷째, 태그 단백질은 transgenes으로 표현하고 자주 overexpression 될 수 있습니다 여러 복사본에 제시되어 있습니다. 따라서, PALM의 정량화는 지정된 위치에 분자의 수를 추정하지만, 정확하게 확인할 수 없습니다하는 데 사용할 수 있습니다.
전자 현미경과 PALM 이미지의 정렬은 또한 때문에 전자빔에 의한 빛과 전자 현미경과 왜곡의 해상도 차이에 도전 할 수 있습니다. 골드 입자는 단단히 LOC 제공전자 micrographs의 fiducial 마커를 alized. 그러나, 금 입자의 fluoresecence이 사진 활성화되어 있지 않습니다, 대형 회절 - 제한된 곳으로 나타납니다. 따라서, 전자 현미경을 통해 형광 이미지의 게재 위치는 추정치입니다. 왜곡은 또한 플라스틱 섹션 전자의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 같은 GMA와 같은 아크릴 수지는 전자빔에 따라 덜 안정적이며, 플라스틱의 크기가 변경 될 수 있습니다. 이러한 상황에서 ultrastructure으로 형광을 정렬하면 fiducial 마커의 비 선형 변환이 필요할 수 있습니다.
Disclosures
이 기사에 생산 및 무료 액세스 칼 Zeiss 주식회사가 후원합니다
Acknowledgments
우리는 증명 원리 실험, 고정 프로토콜 시약과 격려를 공유 리차드 족쇄를 채우다을위한 PALM 현미경에 대한 접근 랄드 헤스와 에릭 Betzig 감사드립니다. 우리는 DNA 구조에 대한 마이클 데이비슨, 제랄딘 Seydoux, 스테판 Eimer, 루돌프 Leube, 키이스 Nehrke, 기독교 Frøkjr - 젠슨, 오드 에이다 - Nguema과 마크 Hammarlund 감사드립니다. 우리는 또한 Zeiss PAL-M, Zeiss Elyra P.1 PALM 현미경의 베타 버전에 대한 액세스를 제공하기 위해 칼 Zeiss 주식회사 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure freezer | ABRA | HPM 010 | EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used. |
| Automated freeze substitution unit | Leica Microsystems | AFS 2 | AFS 1 can also be used. |
| Zeiss PALM |  Carl Zeiss, Inc. |
ELYRA P.1 | Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes. |
| Scanning electron microscope | FEI | Nova nano | Other high-resolution SEM microscopes can be used. |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-1L | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19134 | |
| Potassium permanganate | EMS | RT20200 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | pH of uranyl acetate from this company is slightly higher. |
| Glycol methacrylate (GMA) | SPI Supplies | 02630-AA | Low acid, TEM grade. |
| N,N-Dimethyl-p-toluidine | Sigma-Aldrich | D9912 | |
| Cryo vials | Nalge Nunc international | 5000-0020 | |
| Glass vials | EMS | 72632 | |
| Aclar film | EMS | 50425-10 | |
| BEEM capsule | EBSciences | TC | Polypropylene |
| 3/8" DISC punches | Ted Pella, Inc. | 54741 | |
| Gold nanoparticles | microspheres-nanospheres.com | 790122-010 | Request 2x concentrated solution |
References
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