Summary
وقد تم تطوير نظام بصري لتصور دوران الأوعية الدقيقة كبدي مع كرات الدم الحمراء FITC المسمى وقياس الضغط الجزئي للأكسجين في microvessels مع بمساعدة الليزر phosphorimetry. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في آليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تحليل بنية الاوعية الدموية الدقيقة، القطر، وسرعة تدفق الدم، وتوتر الأوكسجين.
Abstract
هناك تفاوت كبير بين العرض والطلب على الأوكسجين في الكبد بسبب كبدي استهلاك الأوكسجين مرتفعة نسبيا ولكن المؤكسج سيئة عن 70٪ من إمدادات الدم كبدي بوابة دم الوريد المستمدة من الجهاز الهضمي والطحال. يتم تسليم الاوكسجين الى خلايا الكبد عن طريق الدم يتدفق من فرع محطة من الوريد البابي إلى الوريد المركزي عن طريق الجيوب، وهذا يجعل من التدرج الأوكسجين في فصيصات الكبد. التدرج الأكسجين هو معلمة هامة المادية التي تنطوي على التعبير عن الأنزيمات المنبع والمصب في دوران الأوعية الدقيقة في الكبد، لكن عدم وجود تقنيات لقياس استهلاك الأوكسجين في دوران الأوعية الدقيقة كبدي أجلت استجلاء هذه الآليات المتعلقة التمثيل الغذائي للأكسجين في الكبد. ولذلك كنا FITC المسمى كريات الدم الحمراء لتصور دوران الأوعية الدقيقة كبدي واستخدامها بمساعدة الليزر phosphorimetry لقياس الضغط الجزئي للأكسجين في microvessels هناك. Noncontaويمكن التصوير المقطعي وقياس بصري مستمر قياس سرعات تدفق الدم، وبأقطار السفينة، والتدرجات الأكسجين تتعلق استهلاك الأوكسجين في الكبد. في نموذج التهاب الكبد الحادة التي قطعناها على أنفسنا من قبل إدارة اسيتامينوفين إلى الفئران لاحظنا زيادة ضغط الأكسجين في كل من الأوردة وبوابة مركزية ولكن الانحدار الأوكسجين انخفضت في الجيوب، مشيرا إلى أن نخر الكبدية في منطقة محيط بالمركز قد يغير ضغط الأكسجين تصل وتؤثر في التعبير عن انزيم في منطقة محيط بوريد الباب. في الختام، يمكن أن طرقنا البصرية لديناميكا الدم الكبد وقياس استهلاك الأوكسجين تكشف عن الآليات المتصلة مرض كبدي.
Protocol
1. وصفها الكريات الحمر مع الفصيلة فلوريسئين الأيسومر الأول (FITC)
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية كنا من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة كيو في كلية الطب.
- 1 تخدير الفئران المانحة، وبعد اجراء شق بطني سحب الدم الكامل من الوريد الأجوف السفلي مع حقنة 1 مل تحتوي على كمية صغيرة من الهيبارين. والموت الرحيم على الفور الماوس عن طريق الحقن بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كلغ IP).
- غسل الدم الكامل مرتين مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 400 غرام في الدوار الدلو المتأرجح.
- حل 10 ملغ من FITC في 5 مل من 100 هبو 2 مم نا (4) وتصفية ذلك مع وجود غشاء 0.22 ميكرون، المسام.
- في أنبوب اختبار مزيج 1 مل من الحل FITC مع 0.15 مل من الجلوكوز 3 مم، 0.25 مل من 180 مم ناه مل ص 4، و 1.5 2 من 100 مم نا 2 هبو 4. إضافة 0.2 مل من Rبيليه قبل الميلاد، والاستفادة من أنبوب للخلط.
- إبقاء الأنبوب لمدة 2 ساعة في درجة مئوية (4) وتغسل ثم كرات الدم الحمراء في برنامج تلفزيوني ملون مرتين.
- وضع كمية صغيرة من وقف RBC على العشب الشريحة ومعرفة ما إذا كان عدد كرات الدم الحمراء تبدو سليمة (أي أن شكل وحجم طبيعية)، وذلك لشدة الاستشعاع كاف.
- تعليق مل من كرات الدم الحمراء 0.1 في 0.9 مل من برنامج تلفزيوني في درجة الحموضة 7.4، والحفاظ على نظام التعليق في تمام الساعة 4 حتى حقن درجة مئوية.
2. إعداد الأوكسجين حساسة للصبغ
- حل 500 ملغ من جيش صرب البوسنة في 10 مل من برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني 7،4.
- إضافة 30 ملغ من المشتريات (II) والمتوسط ورباعي (4-carboxyphenyl) porphine (PD-TCPP) إلى حل جيش صرب البوسنة ويقلب بين عشية وضحاها.
- (اختياري) استخراج BSA المتجهة PD-TCPP باستخدام خطورة التدفق اللوني أو عمود الدوران لفصلها عن حر PD-TCPP.
- منبذة الحل لإزالة غير منحل PD-TCPP، وتصفية طاف مع فلتر وجود غشاء 0.22 ميكرون، المسام. </ لى>
- متجر 1 مل aliquots في الأنابيب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تجنب تكرار تجميد ذوبان دورات.
3. حيوان التحضير
- لمراقبة مجهرية من دوران الأوعية الدقيقة إعداد طبق من البلاستيك مع 20 ملم ثقب في القطر، وشريط لاصق لمدة 30 ملم مربع من الزجاج غطاء مربع فوق الحفرة.
- تخدير ماوس، وإزالة الفراء، والإعدادية في الجلد. وضع قسطرة في الذيل دون جدوى لحقن المخدرات عن طريق استخدام إبرة G 30 متصلة البولي ايثيلين 10 سم (بي 10) القسطرة مليئة PBS heparinized.
- بعد شق متوسط، تمديد فصيص الرئيسي للكبد على لوحة من البلاستيك، ووضع الماوس في الاستلقاء القصية.
- إعداد قسائم صغيرة مع التفاف المطبخ (3 مم × 8 مم)، والبلاط لهم حول حافة الفص الكبدي لمنع الانتقال من الكبد مع التنفس والحفاظ عليها من الجفاف.
- مراقبة دوران الأوعية الدقيقة كبدي تحت المجهر (مع الضوء المرسل)، وتؤكد أن بlood تدفق لا يوجد لديه ركود في مجال الرؤية لما لا يقل عن 15 دقيقة.
- حقن ببطء 0.2 مل من كرات الدم الحمراء fluorescently المسمى لمراقبة تدفق الدم أو 0.2 مل من PD-TCPP حل لقياس 2 PO. وهذه الكمية من كرات الدم الحمراء FITC المسمى تمثل 1/50 من كرات الدم الحمراء في الدورة الدموية للجميع في المنطقة تصور.
4. تدفق الدم التصور
- تثير FITC بواسطة تشعيع مع ضوء مصباح الزئبق الذي مر من خلال مرشح ممر الموجة (450-490 نانومتر) 1.
- تسجيل صورة فلوري مع كاميرا CCD.
5. ص 2 القياس
PD-TCPP تفسفر ضعيفة نسبيا ويجب أن يتم الكشف مع جهاز الكشف عن حساسية عالية. جميع التجارب التي تحتاج إلى القيام بها في غرفة مظلمة.
- قمم امتصاص PD-TCPP هي عند 410 نانومتر و 532 نانومتر، لذلك ينصح ثاني متناسق الطول الموجي 532 نانومتر عن الإثارة. ويمكن توليد هذه الموجة من قبل Nd: YAG لنبضة ليزر 2.
- إطعام شعاع من Nd: YAG ليزر في المنفذ المناسب على مجهر مقلوب، وضبط بقعة شعاع على مكانة مركزية في المستوى البؤري. القرار المكاني يعتمد على الليزر حجم البقعة، والتي تم تغيير عن طريق تمرير شعاع من خلال الثقب.
- للكشف عن تفسفر، ونعلق مرشح تمريرة طويلة (> 620 نانومتر) وأنبوب مضخم ضوئي (PMT) إلى منفذ آخر من المجهر. يجب أن PMT تكون حساسة لموجات حمراء، وخصوصا حوالي 700 نانومتر.
- أخذ عينات من إشارة تفسفر (500 نقاط العينة على 200 كيلو هرتز)، وحساب الوقت المستمر للتسوس من قبل تركيب أجهزة الدالة الأسية إلى الاضمحلال.
- لمعايرة تحضير 2 مجموعة من عينات من PD-TCPP حل مع مم زئبق ص 150 2 مم زئبق و0. إضافة الصوديوم dithionite 1٪ في حجم لأخذ عينات لانتاج غياب الأكسجين. الحفاظ على درجة الحموضة لعينات بنسبة 7.4 و درجة الحرارة للتلح على 37 درجة مئوية خلال المعايرة.
- إصلاح ستيرن، فولمر الاضمحلال التلألؤ ثابت س ك و الأكسجين الحر في الوقت τ 0 في المعادلة (1) 3. في حالتنا، مع PD-TCPP الحلول عند 37 درجة مئوية ودرجة الحموضة من 7.4، ك س 374 مم زئبق هو -1 S -1 و τ 0 هو 0.74 مللي. هذه المعايير قياس تعتمد على معدات (أي ليزر، كشف، والأجهزة البصرية الأخرى)، وأسلوب معالجة الإشارات، لذلك هناك حاجة إلى معايرة في كل نظام قياس 4.
τ 0 / τ = 1 + ك س • τ 0 • ص 2 (1) - وضع الماوس على لوحة على المسرح المجهر، ومراقبة دوران الأوعية الدقيقة في الكبد، وضبط الموقف من microvessel الهدف إلى نقطة للبقعة الليزر.
6. التهاب الكبد النموذجي
- سريع الفئران مع حرية الوصول إلى المياه بين عشية وضحاها.
- إعداد20 ملغ لكل حل مل من اسيتامينوفين (على شكل اختصار) في DMSO.
- حقنه intraperitonealy في 1 من وزن الجسم ز ml/100 (أي 200 ملغ / كغ من وزن الجسم). بعد الحقن، يمكن إعطاء الماوس حرية الحصول على الغذاء والماء 5.
- بعد 24 ساعة من الحقن، وتخدير الماوس وفضح الكبد عن طريق عمل شق متوسط. إذا تحقق التهاب الكبد، ونخر في المنطقة محيط بالمركز تكون مرئية بسهولة بالعين المجردة.
7. ممثل النتائج
وتظهر الصور مثل دوران الأوعية الدقيقة من كبدي في الشكل رقم 1، حيث (أ) هو الصورة المنقولة الضوء و (ب) هي صورة مضان. ويلاحظ الفرد الكريات الحمراء FITC المسمى في فيلم الفيديو، ويتم التعرف على الأوردة البوابة، والجيوب، والأوردة المركزية اتجاهات تدفق الدم.
كما هو مبين في الشكل 2، كانت بقعة ليزر تشعيع 1 الوريد المركزي من خلال عدسة X100 هدف approximately 10 ميكرومتر في القطر. وقد تم قياس داخل الأوعية ص 2 في دوران الأوعية الدقيقة في كبدي C57BL الذكور / الفئران 6، والشكل 3 (أ) يبين العلاقات بين ص (2) وقطر السفينة في الأوردة بوابة والمركزية. ال 2 ص التدرج من بوابة إلى الأوردة المركزية يشير إلى أن إطلاق كرات الدم الحمراء الأكسجين بكفاءة في الوقت الذي يمر من خلال الجيوب. كان متوسط 2 ص كما هو مبين في الشكل 3 (ب)، 59.8 مم زئبق في الأوعية بوابة، 48.2 مم زئبق في الجيوب، و 38.9 مم زئبق في الأوردة المركزية.
وعندما أنتجنا التهاب الكبد الحادة عن طريق حقن شكل اختصار intraperitonealy، مرتفعة بشكل ملحوظ داخل الأوعية ص 2 في كل جزء من دوران الأوعية الدقيقة كبدي: P <0.05 في الأوردة البابية وP <0.01 في الجيوب والأوردة المركزية (الشكل 3 (ج)).
الشكل 1. منخفضة التكبير أناالسحراء تبين دوران الأوعية الدقيقة كبدي مع (أ) الضوء المرسل ومضان (ب).
الشكل 2. صورة من بقعة ليزر تشعيع 1 الوريد المستهدفة المركزية لقياس 2 PO.
الشكل 3. ص 2 التدرج في دوران الأوعية الدقيقة كبدي من السيطرة على الفئران صحية والفئران مع اصابة كبدي اسيتامينوفين التي يسببها. (أ) يظهر ب 2 مقابل بقطر السفينة لالوريدات بوابة (PV) والمركزية الوريدات (CV)، و (ب) ويبين التدرج من الأكسجين الكهروضوئية إلى السيرة الذاتية عن طريق الجيوب (S). ال 2 ص الفرق بين PV والسيرة الذاتية تعكس استهلاك الأوكسجين من خلايا الكبد أو خلايا متني الأخرى. (ج) يدل على ان الظروف في التهاب الكبد الناجم عن إدارة على شكل اختصار، ومرتفعة بشكل ملحوظ ب 2 في PV، S، والسيرة الذاتية وص 2انخفضت الانحدار، مشيرا إلى أن تعرض للخطر كبدي استهلاك الأوكسجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إيصال الأوكسجين إلى الأنسجة هو الدور الأساسي للدوران الأوعية الدقيقة، والكثير من الأوراق تصف الأمراض المتصلة تشريح microvessel والريولوجيا 6. تدفق الدم في الكبد هو مزيج من الدم في الشرايين والأوردة. حوالي 30٪ من تدفق الدم الى الكبد جيدا الاوكسيجين في الدم التي قدمها الشريان الكبدي وغيرها من 70٪، التي قدمتها في الوريد البابي، وهو وريدي الدم المؤكسج من ضعف تدفق الطحال والجهاز الهضمي 7. أمراض الكبد مثل الكبد الدهني، صدمة، أو تغيير ورم من تدفق الدم في دوران الأوعية الدقيقة كبدي. لتحديد أكسجة الأنسجة، ويحتاج المرء لقياس كل من تدفق الدم وتركيز الأوكسجين في دوران الأوعية الدقيقة. جعلت من عدم وجود الأدوات المتاحة تجاريا لجعل هذه القياسات في دوران الأوعية الدقيقة كبدي من الصعب الحصول على البيانات الفيزيولوجية في هذا المجال.
نقطة مهمة في خطوات إعداد الحيوان هو تثبيت للالكبد على طبق من البلاستيك. تثبيت نتائج فضفاض في حركة الكبد متزامنة مع التنفس، والتي تتعارض مع الملاحظة المجهرية، ويجعل من الصعب تحليل. تثبيت ضيق، ومع ذلك، يؤدي ركود الدم في التدفق. ينبغي مراعاة ظروف تدفق الدم على الرغم من مجهر الطاقة المنخفضة أثناء إجراء الجراحة. أشعة الليزر عالية الطاقة تجرح بسهولة microvessels، لذلك ينبغي أن يكون الحد الأدنى تواتر الإشعاع. 1 هرتز عادة ما يكفي لقياس الزمنية 8. ومع ذلك، فإن قياس واحد للبريد 2 يأخذ أقل من 1 مللي ثانية، مما يعني أنه يمكن زيادة وتيرة تكرار إلى 1 كيلو هرتز من أجل التغيير السريع 2 PO، حسب الضرورة. وعلاوة على ذلك، فإن رد الفعل الضوئية للPD-TCPP يولد الأوكسجين القميص أن الأضرار microvessels ويؤدي تراكم الصفائح الدموية 9. ويمكن الجمع بين التصوير ومضان ص 2 قياس قياس ديناميكية تدفق الدم وتركيز الأوكسجين معا جميع. تشعيع الزئبق مصباحFITC مثير يثير أيضا PD-TCPP، ومع ذلك، مما يولد الكثير من الأوكسجين القميص ويؤدي إلى تدفق الدم ركود. عندما يتم قياس كل من تدفق الدم وتوتر الأوكسجين في الحيوان نفسه، ينبغي أن يتم التصوير FITC قبل إدارة PD-TCPP. بالإضافة إلى ذلك، النظامية مستوى الاوكسجين يدل على استهلاك الأوكسجين في الأنسجة. فمن الأفضل لأداء إدارة الجهاز التنفسي خلال التجارب أو تحليل مستويات الغاز في الدم بعد عدة تجارب.
تعودنا على شكل اختصار للحث على التهاب الكبد الحاد، في جزء منه لأنه من المعروف جرعة عالية من شكل اختصار أن تؤدي إلى نخر الخلية في المنطقة محيط بالمركز 10. وأظهرت جزئي قياس ضغط الاوكسجين على 20.9 مم زئبقي، ص 2 الفرق بين الأوردة والأوردة البوابة المركزية في السيطرة على الفئران انخفضت إلى 16.9 مم زئبق في الفئران على شكل اختصار المعاملة وأن ص 2 كانت أعلى في جميع أنحاء دوران الأوعية الدقيقة كبدي. التدرج الأوكسجين في دوران الأوعية الدقيقة الكبد بشكل رئيسي نتيجة لملحق الأكسجينالعبوات الناسفة من الوريدات بوابة يتم استهلاكه في خلايا الكبد. اعلى جرعة من يحرض على شكل اختصار نخر في المنطقة محيط بالمركز 11 و 12، والتي يمكن أن تقلل استهلاك الأوكسجين المصب كما هو مبين في الشكل 3C. لتحديد آليات مفصلة وراء التهاب الكبد الكبد، وعلاقة خاصة بين نخر الأنسجة ومستوى الأكسجين، والقياس الكمي لمدى نخر، ومستويات البيليروبين في المصل، ALT، AST، والسيتوكينات الالتهابية في حاجة إلى أن يقاس. وهناك الكثير من أمراض الكبد ترتبط دوران الأوعية الدقيقة في الكبد، وبعبارة أخرى، على توزيع الدم تدفق، والتسليم الأكسجين، واستهلاك الأكسجين في أنسجة الكبد. في حالات تناول الكحول المزمن، ويتم استقلاب حوالي 10-15٪ من الكحول من قبل نظام الايثانول الميكروسومي المؤكسدة، وP450IIE1 جزيء الناجمة عن تناول الكحول يولد NAPQI 13، وهو المستقلب السام الذي يؤدي إلى نخر الكبدية محيط بالمركز 14.
في الختام، لدينا شركة طيران الشرق الأوسط بصريويمكن استخدام أسلوب surement للتحقيق في آليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تحليل بنية الاوعية الدموية الدقيقة، القطر، وسرعة تدفق الدم، وتوتر الأوكسجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب: أشكر السيدة ريسا اوتسوكا للمساعدة التقنية والتجارب مساعدة. وأيد جزئيا هذا البحث من قبل وزارة التربية والتعليم والعلوم والرياضة والثقافة، ومنحة تقدمها الحكومة للعلماء الشباب (B)، 2010، 22700476، والنصب التذكاري للمؤسسة Suzuken 2010 لKT وبدعم هذه الدراسة عن طريق البحث والتنمية من في المحاكاة الجيل التالي المدمجة من المادة الحية، جزءا من التنمية والمستفيدة من المشروع العملاق الجيل التالي من وزارة التربية، وجزئيا من خلال مشروع JST Suematsu إراتو علم الأحياء الغاز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J. Acute liver failure. Lancet. 376, 190-201 (2010).
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P. Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis. Handb. Exp. Pharmacol. 169, 369-405 (2010).
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
