Summary
光学系统的开发，可视化与FITC标记的红细胞肝脏微循环和氧气在微血管局部压力测量激光辅助磷光。这种方法可以用来研究生理和病理机制，通过分析微血管结构，直径，血流速度和氧张力。
Abstract
因为肝脏耗氧量是比较高的，但约有70％的肝脏血液供应不足含氧从胃肠道，脾的门静脉血液，在肝脏中的氧气供应和需求之间有一个相当大的差异。氧气从门静脉的终末支流入通过血窦中央小静脉血液运送到肝，这使得在肝小叶的氧气梯度。氧梯度是一个重要的物理参数，包括酶在肝脏微循环的上游和下游的表达，但在肝脏微循环的氧气消耗测量技术的缺乏，已经推迟了与氧气在肝脏代谢机制的澄清。因此，我们用FITC标记的红细胞，肝脏微循环的可视化和使用激光辅助磷光测量氧气在微血管氧分压。 noncontaCT和可以量化的连续光学测量血流速度，血管直径，有关肝脏的氧气消耗的氧气梯度。在急性肝炎模型中，我们通过管理对乙酰氨基酚对小鼠，我们发现增加了门户网站和中央静脉氧气压力，但在血窦减少氧梯度，表明肝细胞坏死在pericentral区域转移氧气压力和影响酶的表达在汇管区。总之，我们的光学测量肝血流动力学和氧消耗的方法可以揭示有关肝病的机制。
Protocol
1。用异硫氰酸荧光素异构体（FITC标记）标记红细胞
我们使用的所有实验协议，由庆应义塾大学动物医学院护理委员会的批准。
- 捐助国小鼠麻醉，做开腹手术切口后退出下腔静脉全血1毫升含有少量的肝素的注射器。巴比妥钠注射液（100毫克/公斤的IP），鼠标立即被安乐死。
- 洗了两次全血离心5分钟400克摆动转头用PBS（pH值7.4）。
- 溶解在100毫米的Na 2 HPO 4 5毫升10毫克的FITC，有0.22微米孔隙过滤膜。
- 在试管中混合与0.15毫升的葡萄糖3毫米，180毫米的NaH 2 PO 4计 ，100毫米和1.5毫升的Na 2 HPO 4 0.25毫升1毫升的FITC标记的解决方案。加入0.2毫升的RBC球，和挖掘混合管。
- 管保持在4°C 2小时，然后在PBS洗两次染色红细胞。
- 幻灯片上的草把少量的红细胞悬液，如果红细胞看起来很健康（即，它们的形状和大小都正常）和荧光强度是足够的。
- 暂停0.9 PBS在pH 7.4毫升0.1毫升，红细胞，并保持悬浮在4°，直到注射Ç。
2。氧敏感的染料的制备
- BSA的500毫克溶于10毫升的PBS在pH 7.4。
- 添加30毫克的Pd（Ⅱ）-meso-四（4 - 羧基苯基）卟啉（PD-TCPP的）BSA溶液，搅拌过夜。
- （可选）BSA绑定钯TCPP的提取利用重力流层析或自旋列从自由钯卟分开。
- 离心除去不溶钯卟，过滤膜过滤器，具有0.22微米的毛孔上清溶液。 </ LI>
- 店1毫升分装在管，于-20°C避免反复冻融。
3。动物的制备
- 微循环显微镜观察，准备了一个洞20毫米直径，和磁带洞超过30平方毫米的方形玻璃盖塑料板。
- 麻醉鼠标，除去皮毛，准备的皮肤。放置在尾部使用地下30针连接到一个10厘米的聚乙烯（PE 10）导管肝素化PBS填充注射毒品的徒劳的导管。
- 后正中切口，延长塑料板的主要肝脏小叶，置于胸骨斜卧在鼠标。
- 厨房保鲜膜（3毫米x 8毫米）和周围边缘的的肝叶抑制肝脏与呼吸运动，并保持干燥瓷砖他们准备的小单。
- 在显微镜下观察肝脏微循环（透射光），并确认了B载量流有没有在视野瘀至少15分钟。
- 慢慢地注入0.2毫升的血流量观察钯TCPP的PO 2测量的解决方案或0.2毫升的荧光标记的红细胞。这FITC标记的红细胞数量将占到1/50的可视化区域中的所有流通中的红细胞。
4。血流量的可视化
- 汞灯光源，通过一个带通滤波器（450-490纳米）1通过辐照激发FITC标记。
- 与CCD相机记录的荧光图像。
5。 PO 2测量
PD-TCPP的磷光相对薄弱，应检测的高灵敏度探测器。所有实验必须在一个黑暗的房间中进行。
- 钯TCPP的吸收峰在410 nm和532 nm，激发二次谐波的波长532纳米的建议。这可以产生波长的Nd：YAG脉冲激光2。
- 喂梁钕：YAG激光，到相应的端口上的倒置显微镜和调整的光斑在焦平面的中心位置。空间分辨率取决于激光光斑大小，这是通过针孔梁，改变。
- 要检测的磷光，重视长期通滤波器（620纳米）和光电倍增管（PMT）显微镜的其他港口。光电倍增管，应该是红色的波长敏感，尤其是700纳米左右。
- 品尝的磷光信号（在200 kHz的采样500点），并计算拟合指数函数衰减衰减时间常数。
- 校准准备PO 2 150毫米汞柱，0毫米汞柱两个钯TCPP的解决方案的样品。添加亚硫酸钠钠量的1％来样生产缺乏氧气。保持在7.4样品的pH值和温度在校准过程中在37°C TURE。
- 修正的Stern-Volmer常数k q和无氧铜发光衰减时间τ0在方程（1）3。在我们的情况下，与钯TCPP的解决方案，在37℃，PH值为7.4，K q是374毫米汞柱-1 s -1和τ0为0.74毫秒。这些测量参数取决于设备（如激光器，探测器，其他光学装置）和信号处理方法，所以需要校准在每个测量系统4。
τ0 /τ= 1 + K Q•τ0•PO 2（1） - 设置鼠标板显微镜舞台上，观察肝脏微循环，调整目标微血管的位置，激光光斑点。
6。肝病模型
- 免费获得隔夜水快小鼠。
- 准备一个20毫克每毫升溶液对乙酰氨基酚（APAP）在DMSO。
- 1 ml/100，Ğ体重（即200毫克/公斤体重）腹腔注射注射。注射后，鼠标就可以免费获得食物和水5。
- 注射后24小时，麻醉鼠标和做正中切口，暴露肝脏。如果实现了肝炎，坏死在pericentral地区将是很容易以肉眼可见。
7。代表结果
例如肝脏微循环图像如图1所示，其中（a）是透射光图像和（b）是一种荧光图像。个人FITC标记的红细胞是在视频电影，观察和门户静脉，血窦和中央静脉血流方向确认。
正如图2所示，激光光斑照射通过X100物镜的中央小静脉approximately直径为10微米。在雄性C57BL / 6小鼠在肝脏微循环的血管PO 2测量， 图3（a）显示PO 2，在门户网站和中央静脉血管直径之间的关系。从门户到中央静脉PO 2梯度表明，红细胞释放出氧气，有效地通过血窦传递时。在图3（b）所示，PO 2平均为59.8毫米汞柱门户的船只，在血窦48.2毫米汞柱，在中央静脉和38.9毫米汞柱。
当我们生产的注射乙醯胺酚腹腔注射的急性肝炎，血管内埔2显着升高肝脏微循环的每个部分：在门静脉和血窦和中央静脉（ 图3（c））P <0.01 P <0.05。
图1。低倍率我法师（一）透射光及（二）荧光显示肝脏微循环。
图2。激光照射有针对性的中央小静脉PO 2测量点的图像。
图3 PO 2在健康对照组和对乙酰氨基酚引起的肝损伤小鼠肝微循环障碍的梯度。 （一）表明PO 2与血管直径为门户静脉（PV）和中央静脉（CV），（b）显示了通过血窦（）氧梯度从光伏到CV。 PO 2 PV和CV之间的差异，反映了肝细胞或其他实质细胞的耗氧量。 （c）所示，PO 2在APAP管理引起的肝炎的条件，在光伏，S，CV和PO 2显着升高梯度下降，表明肝氧耗被攻破。
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Discussion
组织提供氧气，是微循环的重要作用，和很多文件描述微血管解剖和流变6有关的疾病。肝血流的动脉和静脉血液的组合。肝脏的血流量约30％是提供由门静脉，肝动脉和其他的70％提供的含氧血，脾和消化道7不佳的含氧的血液从静脉流出。肝脏疾病，如脂肪肝，休克，或肿瘤在肝脏微循环的血流量变化的。为了确定组织氧合，需要测量的微循环血流量和氧浓度。市售仪器的缺乏，使这些在肝脏微循环测量已很难在这一领域取得的生理数据。
动物准备步骤中的一个重要的一点是固定肝脏上的塑料板。宽松的固定结果肝运动同步呼吸，干扰显微镜观察和分析困难。然而，紧固定，导致血流淤滞。虽然低功耗显微镜在手术过程中血液流动的条件，应遵守。高功率激光器很容易伤害微血管，所以应尽量减少照射的频率。 1赫兹通常是足够的时间测量8。然而，单次测量的PO 2小于1毫秒，这意味着，重复频率可提高到1千赫的快速PO 2变化，必要时需要。此外，钯TCPP的光化学反应，产生单线态氧，损害微血管，引起血小板聚集9。结合荧光成像和PO 2测量可以测量血流动力学和氧浓度都在一起。汞灯照射令人兴奋的FITC标记也激发钯卟然而，从而产生大量单线态氧，导致血流淤滞。 FITC标记成像时，血流量和氧张力测量在相同的动物，应做之前钯TCPP的管理。此外，全身氧水平是在组织的耗氧量的指标。最好是在实验过程中进行呼吸道管理或分析实验后的血气水平。
我们使用乙醯胺酚诱发急性肝炎，部分原因是高剂量的乙醯胺酚被称为细胞坏死导致的pericentral地区10。氧分压测试结果表明，20.9毫米汞柱2 PO之间的门户静脉和中央静脉对照组的差异下降16.9毫米汞柱的乙醯胺酚治疗的小鼠和PO 2是整个肝脏微循环。主要是在肝脏微循环的氧梯度氧增刊灭蝇灯消耗在肝门静脉静脉。高剂量的乙醯胺酚诱导坏死的pericentral地区11，12，可以减少氧气消耗，下游如图3c所示。以确定潜在的肝炎，尤其是组织坏死和氧气水平之间的关系，坏死的程度量化，血清胆红素，ALT，AST的，和炎性细胞因子的详细机制需要进行测量。很多肝病的肝脏微循环有关，换句话说，血流分布，氧气输送和肝组织中的氧气消耗。在慢性酒精摄入量的情况下，大约10-15％的酒精代谢微粒体乙醇氧化系统，酒精引起的的分子P450IIE1产生NAPQI 13日，14 pericentral肝细胞坏死，导致一种有毒的代谢产物。
总之，我们的光学测量分析微血管结构，直径，血流速度和氧张力surement方法可以用来研究生理和病理机制。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
著者感谢沙大冢女士提供技术援助和帮助实验。部分支持这项研究是由教育部，科学，体育和文化活动，资助青年科学家（二），2010，22700476，Suzuken 2010年纪念基金会为KT这项研究是由研究和开发的支持援助下一代集成模拟生命物质的发展和使用的文部科学省的下一代超级计算机项目的一部分，在垂询的ERATO Suematsu气体生物学项目的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
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