Summary
Een optisch systeem ontwikkeld lever microcirculatie visualiseren met FITC-gelabelde erythrocyten en de partiële zuurstofdruk in de microvaatjes meten laser-assisted phosphorimetry. Deze methode kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen onderzoeken te analyseren microvasculaire structuur diameter snelheid van de bloedstroom en zuurstofspanning.
Abstract
Er is een grote discrepantie tussen zuurstof vraag en aanbod in de lever, omdat de lever zuurstofverbruik is relatief hoog, maar ongeveer 70% van de lever bloedtoevoer wordt onvoldoende zuurstof krijgen poortader bloed afgeleid van het maag-darmkanaal en de milt. Zuurstof wordt geleverd aan hepatocyten door het bloed stroomt uit een terminal tak van de poortader naar een centrale venule via sinusoiden, en dit maakt een zuurstof gradiënt in de lever melkklieren. De zuurstof gradiënt is een belangrijke fysische parameter die de expressie van enzymen upstream-en downstream in de lever microcirculatie, maar het gebrek aan technieken voor het meten van zuurstof-consumptie in de lever microcirculatie heeft vertraagd het ophelderen van mechanismen met betrekking tot zuurstof stofwisseling in de lever gaat. Daarom gebruikt FITC gemerkt erythrocyten de lever microcirculatie visualiseren gebruikte laser-assisted phosphorimetry de partiële zuurstofdruk in de microvaatjes zijn meten. Noncontact en continue optische meting kan kwantificeren bloedstroom snelheden, schip diameters, en zuurstof hellingen met betrekking tot het zuurstofverbruik in de lever. In een acute hepatitis-model dat we hebben gemaakt door het toedienen van paracetamol aan muizen hebben we waargenomen verhoogde zuurstofdruk in zowel de portal en het centrum van venulen, maar een verminderde zuurstof gradiënt in de sinusoïden, wat aangeeft dat necrose en in de pericentral zone kan de zuurstofdruk te verschuiven en beïnvloeden enzym expressie in de periportale zone. Tot slot kan onze optische methoden voor het meten van de lever hemodynamica en zuurstofverbruik onthullen mechanismen in verband met leveraandoeningen.
Protocol
1. Labeling Erytrocyten met fluoresceïne isothiocyanaat isomeer I (FITC)
Alle experimentele protocollen gebruikten we zijn goedgekeurd door de Animal Care Comite van Keio University School of Medicine.
- Verdoof een donor muizen, en na het maken van een incisie celiotomy volbloed terug te trekken uit de vena cava inferior met een 1-ml spuit met kleine hoeveelheid heparine. De muis werd onmiddellijk door euthanasie natriumpentobarbital injectie (100 mg / kg ip).
- Tweemaal wassen geheel bloed met PBS (pH 7,4) door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 400 g in een zwaaiende-bucket rotor.
- Los 10 mg FITC in 5 ml 100 mM Na 2 HPO 4 en filteren met een membraan met 0,22 um poriën.
- In een reageerbuis gemengd 1 ml van de oplossing met FITC 0,15 ml 3 mM glucose, 0,25 ml 180 mM NaH 2 PO 4 en 1,5 ml 100 mM Na 2 HPO 4. Voeg 0,2 ml van de RBC pellet, en tik op de buis voor het mengen.
- Houd de buis gedurende 2 uur bij 4 ° C en vervolgens tweemaal wassen de gekleurde RBC in PBS.
- Breng een kleine hoeveelheid van de RBC vering op een dia gras en zien of de RBC's zien er gezond uit (dat wil zeggen, dat hun vorm en grootte normaal zijn) en dat de fluorescentie-intensiteit is voldoende.
- Hang de 0,1 ml RBC in 0,9 ml PBS bij pH 7,4, en houd de vering bij 4 ° C tot injectie.
2. Voorbereiding van de zuurstof-gevoelige Dye
- Los 500 mg BSA in 10 ml PBS bij pH 7,4.
- Voeg 30 mg van Pd (II) meso-tetra-(4-carboxyfenyl) porfine (Pd-TCPP) de BSA oplossing en roeren gedurende de nacht.
- (Optioneel) Extract BSA-gebonden Pd-TCPP met behulp van de zwaartekracht-flow chromatografie of een spin kolom te scheiden van de gratis Pd-TCPP.
- Centrifugeer de oplossing te verwijderen onopgeloste Pd-TCPP, en filteren het supernatant met een membraan filter met 0,22-um poriën. </ Li>
- Winkel 1 ml porties in buizen bij -20 ° C. Vermijd herhaaldelijk vries-dooi cycli.
3. Toebereiding van dieren
- Voor de microscopische observatie van de microcirculatie bereiden een kunststof plaat met een gat 20 mm in diameter, en tape een 30-mm-vierkant vierkante dekking van glas over het gat.
- Verdoof een muis, verwijder de vacht, en prep de huid. Plaats een katheter in de staart tevergeefs drugsinjectie met een 30 G naald verbonden met een 10-cm polyethyleen (PE 10) katheter vol gehepariniseerde PBS.
- Na het mediane incisie, het uitbreiden van een van de belangrijkste lobulus van de lever op de kunststof plaat, en zet de muis in borstbeen decubitus.
- Bereid kleine slips met keuken wrap (3 mm x 8 mm) en tegel ze rond de rand van de lever kwab te remmen verplaatsen van de lever met de ademhaling en het houden van het uit te drogen.
- Let op de hepatische microcirculatie onder een microscoop (met doorvallend licht), en bevestigen dat de blood stroom geen stilstand in het gezichtsveld van ten minste 15 minuten.
- Injecteer langzaam 0,2 ml van fluorescent gelabelde rode bloedcellen voor de doorbloeding observatie of 0,2 ml van Pd-TCPP oplossing voor pO 2-meting. Dit bedrag van FITC-gelabelde rode bloedcellen telt mee voor 1/50 van alle RBC's in omloop in de gevisualiseerde regio.
4. Blood Flow Visualisatie
- Opwekken FITC door bestralen met kwiklamp licht dat is via een banddoorlatend filter (450-490 nm) 1.
- Noteer de tl-beeld met een CCD-camera.
5. PO 2 Meting
Pd-TCPP fosforescentie relatief zwak en worden gedetecteerd met een hoge gevoeligheid detector. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in een donkere kamer.
- De absorptie pieken van Pd-TCPP zijn bij 410 nm en 532 nm, dus de tweede-harmonische golflengte 532 nm wordt aanbevolen voor excitatie. Deze golflengte kan worden opgewekt door een Nd: YAG laser 2 puls.
- Voer de straal van de Nd: YAG laser in de juiste poort op de omgekeerde microscoop, en pas de lichtstraal heeft om een centrale positie in het brandvlak. De ruimtelijke resolutie is afhankelijk van de laserspot omvang, die is gewijzigd door het passeren van de bundel door een pinhole.
- Om de fosforescentie detecteren hechten long pass filter (> 620 nm) en een fotomultiplicatorbuis (PMT) naar de andere aansluiting van de microscoop. De PMT moet gevoelig zijn voor rood golflengten, vooral rond 700 nm.
- Proef de fosforescentie-signaal (500 punten bemonsterd op 200 kHz) en bereken de tijdconstante van het verval door het plaatsen van een exponentiële functie om het verval.
- Voor de kalibratie voor te bereiden twee reeks monsters van Pd-TCPP oplossing met pO 2 150 mmHg en 0 mmHg. Voeg dithioniet natrium 1% in volume te proeven de afwezigheid van zuurstof te produceren. Houd de pH van de monsters 7,4 en de temperatuurtuur bij 37 ° C gedurende kalibratie.
- Bevestig de Stern-Volmer k q en zuurstofvrije luminescentie vervaltijd τ 0 in de vergelijking (1) 3. In ons geval met Pd-TCPP oplossingen bij 37 ° C en een pH van 7,4, k q 374 mmHg -1 s -1 en τ 0 is 0,74 ms. Deze meting parameters afhankelijk van de apparatuur (laser, detector, optische toestellen) en de signaalverwerking methode, zodat kalibratie nodig per meetsysteem 4.
τ 0 / τ = 1 + k q • τ 0 • pO 2 (1) - Zet de muis op de plaat op de microscoop podium, leven zij de hepatische microcirculatie, en pas de positie van het doel microvaatje tot het punt van de laser ter plekke.
6. Hepatitis Model
- Snel muizen met vrije toegang tot water 's nachts.
- Bereid een20 mg per ml oplossing van paracetamol (APAP) in DMSO.
- Intraperitonealy Injecteer het op 1 ml/100 g lichaamsgewicht (dat wil zeggen, 200 mg / kg lichaamsgewicht). Na de injectie, kan de muis worden de vrije toegang tot voedsel en water 5.
- 24 uur na de injectie, verdoven de muis en bloot de lever door het maken van een mediane incisie. Als hepatitis is bereikt, zal necrose in de pericentral regio goed zichtbaar met het blote oog.
7. Representatieve resultaten
Voorbeeld beelden lever microcirculatie worden getoond in Figuur 1, waarbij (a) een doorvallend licht beeld en (b) een fluorescentie beeld. Individuele FITC-gelabelde erytrocyten worden waargenomen in de video-film, en portal venulen, sinusoiden, en centrale venulen zijn erkend door de bloedstroom richtingen.
Zoals getoond in figuur 2, de laserspot bestralen van een centrale venule door een x100 objectieflens is approximdellijk 10 pm in diameter. Intravasculaire pO 2 in de lever microcirculatie werd gemeten bij mannelijke C57BL / 6 muizen, en figuur 3 (a) toont de relaties tussen PO 2 en de bloedvaten in de portal en het centrum van venulen. De PO 2 gradiënt van portaal naar het centrum van venulen geeft aan dat RBC het vrijkomen van zuurstof efficiënt tijdens het passeren van sinusoïden. Zoals in figuur 3 (b) de gemiddelde pO 2 was 59,8 mmHg portaal vaten, 48.2 mmHg sinusoiden en 38,9 mmHg centrale venules.
Wanneer we acute hepatitis geproduceerd door het injecteren van APAP intraperitonealy, intravasculaire PO 2 was significant verhoogd in elk deel van de lever microcirculatie: p <0,05 in portaalsite aderen en p <0,01 in sinusoiden en centrale aderen (figuur 3 (c)).
Figuur 1. Lage vergroting images zien lever microcirculatie met (a) doorvallend licht en (b) fluorescentie.
Figuur 2. Afbeelding van laserspot bestralen een gerichte centrale venule voor pO 2-meting.
Figuur 3. PO 2 gradiënt in de lever microcirculatie van gezonde muizen en muizen met paracetamol geïnduceerde leverbeschadiging. (A) toont pO 2 in plaats van bloedvaten voor portal venulen (PV) en centrale venulen (CV), en (b) toont de zuurstof gradiënt van PV naar CV via sinusoïden (S). De PO 2 verschil tussen PV en CV weerspiegelt de zuurstofverbruik van hepatocyten of andere parenchymcellen. (C) blijkt dat bij hepatitis omstandigheden veroorzaakt door APAP administratie, pO 2 aanzienlijk werd verhoogd in PV, S, en CV en de PO 2gradiënt is gedaald, wat aangeeft dat de lever het zuurstofverbruik in gevaar was.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het leveren van zuurstof naar weefsels is een essentiële rol van de microcirculatie, en een hoop papieren beschrijven ziekten die verband houden met microvaatjes anatomie en reologie 6. Bloeddoorstroming van de lever is een combinatie van arteriële en veneuze bloed. Ongeveer 30% van de bloedtoevoer naar de lever is goed zuurstofrijk bloed voorzien door de leverslagader en de andere 70%, op voorwaarde dat door de poortader, is het slecht zuurstofrijk bloed veneuze uitstroom uit de milt en maag-darmkanaal 7. Leverziekten zoals leververvetting, shock, of tumor verandering van de bloedstroom in de lever microcirculatie. Om te bepalen weefseloxygenatie, moet men meten zowel de bloedstroom en de zuurstofconcentratie in de microcirculatie. Het ontbreken van commercieel beschikbare instrumenten om deze metingen in de lever microcirculatie heeft het moeilijk om fysiologische gegevens in dit gebied te verkrijgen.
Een belangrijk punt in dierlijke voorbereiding stappen is de fixatie vande lever van een kunststof plaat. Losse fixatie resultaten in de lever beweging gesynchroniseerd met de ademhaling, die interfereert met microscopische waarnemingen en maakt analyse moeilijk. Tight fixatie, echter, veroorzaakt de bloedstroom stasis. Doorbloeding voorwaarden moeten in acht worden genomen maar een low-power microscoop tijdens de operatieve ingreep. Hoogvermogen lasers gemakkelijk microvaatjes verwonden, zodat de frequentie van de bestraling worden geminimaliseerd. 1 Hz is meestal genoeg voor tijdelijke metingen 8. Echter, een meting van pO twee in minder dan 1 ms, zodat de herhalingsfrequentie worden verhoogd tot 1 kHz voor snelle pO twee veranderingen nodig. Bovendien is de fotochemische reactie van Pd-TCPP genereert singlet zuurstof die schade microvaten en induceert plaatjesaggregatie 9. De combinatie van fluorescentie beeldvorming en PO 2-meting kan meten bloedstroom dynamiek en de zuurstofconcentratie allemaal samen. Het kwik lamp bestralingspannend FITC prikkelt ook Pd-TCPP, echter, waardoor het programma veel singlet zuurstof en leidt tot de bloedstroom Stasis. Wanneer zowel bloedstroom en zuurstofspanning gemeten in hetzelfde dier dient de FITC imaging worden voordat Pd-TCPP wordt toegediend. Bovendien systemische zuurstofgehalte indicatief is het zuurstofverbruik in het weefsel. Het is beter voor de ademhalingswegen beheer uit te voeren bij experimenten of bloedgas niveaus te analyseren na de experimenten.
We gebruikten APAP van acute hepatitis induceren, voor een deel omdat een hoge dosis van APAP is bekend dat het naar cel necrose leiden in de pericentral regio 10. Partiële zuurstofdruk meting bleek dat de 20,9-mm Hg PO 2 verschil tussen vergeten venulen en centrale venulen in de controle muizen afgenomen tot 16,9 mmHg in de APAP-behandelde muizen en dat de PO 2 was hoger in de lever microcirculatie. De zuurstof gradiënt in de lever microcirculatie is vooral het gevolg van zuurstof supplIED van portaal venulen wordt verbruikt in de levercellen. De hogere dosis APAP induceert necrose in het pericentral gebied 11, 12 en die zuurstofverbruik kan stroomafwaarts dalen zoals in figuur 3c. Om gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan de lever hepatitis, in het bijzonder de relatie tussen weefsel necrose en zuurstofgehalte, het kwantificeren van de omvang van de necrose, en serumspiegels van bilirubine, ALT, AST, en inflammatoire cytokines te bepalen moet worden gemeten. Veel van leverziekten gerelateerd zijn aan lever microcirculatie, met andere woorden, de bloedstroom verdeling zuurstoftoevoer en zuurstofverbruik in leverweefsel. In gevallen van chronische alcohol wordt ongeveer 10-15% van de alcohol gemetaboliseerd door het microsomale ethanol-oxiderende systeem, en de alcohol-geïnduceerde molecuul P450IIE1 genereert NAPQI 13, een toxisch metaboliet dat leidt tot pericentral necrose en 14.
Tot slot, onze optische measurement methode kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen onderzoeken te analyseren microvasculaire structuur diameter snelheid van de bloedstroom en zuurstofspanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs dank mevrouw Risa Otsuka voor technische bijstand en het helpen van experimenten. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Sport en Cultuur, Grant-in-Aid for Young Scientists (B), 2010, 22700476, en Suzuken Memorial Foundation 2010 voor de KT en deze studie werd ondersteund door onderzoek en ontwikkeling van de volgende generatie geïntegreerde simulatie van de levende materie, een deel van de ontwikkeling en toepassing van de Next-Generation Supercomputer Project van MEXT, en deels door JST ERATO Suematsu Gas Biology Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J. Acute liver failure. Lancet. 376, 190-201 (2010).
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P. Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis. Handb. Exp. Pharmacol. 169, 369-405 (2010).
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
