Summary
Un système optique est développé pour visualiser la microcirculation hépatique avec érythrocytes FITC marqués et pour mesurer la pression partielle d'oxygène dans le microvaisseaux avec assistée par laser Phosphorimétrie. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, le diamètre, la vitesse d'écoulement du sang, et la tension d'oxygène.
Abstract
Il ya un écart considérable entre l'offre et la demande en oxygène dans le foie, car la consommation d'oxygène hépatique est relativement élevé, mais environ 70% de l'approvisionnement sanguin hépatique est mal oxygéné sang de la veine portail dérivé du tractus gastro-intestinal et la rate. L'oxygène est livrée à des hépatocytes par le sang s'écoulant d'une branche terminale de la veine porte à une veinule centrale via sinusoïdes, ce qui rend un gradient d'oxygène en lobules hépatiques. Le gradient d'oxygène est un paramètre important physique qui implique l'expression d'enzymes en amont et en aval de la microcirculation hépatique, mais le manque de techniques pour mesurer la consommation d'oxygène dans la microcirculation hépatique a retardé l'élucidation des mécanismes relatifs à métabolisme de l'oxygène dans le foie. On a donc utilisé marqué FITC érythrocytes de visualiser la microcirculation hépatique et utilisé assistée par laser Phosphorimétrie pour mesurer la pression partielle d'oxygène dans le microvaisseaux là. Noncontact et continue de mesure optique permet de quantifier les vitesses d'écoulement de sang, les diamètres des navires, et les gradients d'oxygène liés à la consommation d'oxygène dans le foie. Dans un modèle de l'hépatite aiguë nous avons fait en administrant de l'acétaminophène pour les souris que nous avons observées pression d'oxygène a augmenté dans les deux veinules portales et central, mais un gradient d'oxygène a diminué dans les sinusoïdes, indiquant que la nécrose des hépatocytes dans la zone péricentral pourrait modifier la pression d'oxygène et affecter l'expression de l'enzyme dans la zone périportale. En conclusion, nos méthodes optiques pour l'hémodynamique hépatique de mesure et de la consommation d'oxygène peut révéler des mécanismes liés à la maladie hépatique.
Protocol
1. Étiquetage érythrocytes avec l'isothiocyanate de fluorescéine isomère I (FITC)
Tous les protocoles expérimentaux que nous avons utilisées ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de Keio University School of Medicine.
- Anesthésier un souris donneuses, et après avoir fait une incision coeliotomie retirer le sang total de la veine cave inférieure avec une seringue de 1 ml contenant petite quantité d'héparine. La souris a été immédiatement euthanasié par injection de pentobarbital sodique (100 mg / kg ip).
- Laver le sang total deux fois avec du PBS (pH 7,4) par centrifugation pendant 5 min à 400 g dans un rotor à oscillation-seau.
- Dissolvez 10 mg de FITC dans 5 ml de 100 mM de Na 2 HPO 4 et filtrer avec une membrane ayant des pores de 0,22 um.
- Dans un tube à essai mélanger 1 ml de la solution de FITC avec 0,15 ml de 3 mM de glucose, 0,25 ml de 180 mM NaH 2 PO 4 ml, et 1,5 de 100 mM de Na 2 HPO 4. Ajouter 0,2 ml de la RColombie-Britannique à granulés, et appuyez sur le tube pour mélanger.
- Garder le tube pendant 2 heures à 4 ° C, puis laver les hématies colorées dans du PBS deux fois.
- Mettez une petite quantité de la suspension de RBC sur une herbe diapositive et de voir si les globules rouges semblent en bonne santé (à savoir que leur forme et la taille sont normaux) et que l'intensité de fluorescence est suffisante.
- Suspendre l'0,1 ml de globules rouges dans 0,9 ml de PBS à pH 7,4, et de garder la suspension à 4 ° C jusqu'à l'injection.
2. Préparation de l'oxygène colorant sensible
- Dissoudre 500 mg de BSA dans 10 ml de PBS à pH 7,4.
- Ajouter 30 mg de Pd (II)-méso-tétra (4-carboxyphényl) porphine (Pd-TCPP) à la solution de SAB et agitation pendant une nuit.
- (Facultatif) Extrait BSA lié Pd-TCPP par écoulement par gravité en utilisant la chromatographie ou une colonne de centrifugation pour le séparer de libre-Pd TCPP.
- Centrifuger la solution pour éliminer non dissous Pd-TCPP, et filtrer le surnageant avec un filtre à membrane ayant des pores de 0,22 pm. </ Li>
- Magasin de 1 ml aliquotes dans des tubes à -20 ° C. Éviter la répétition des cycles gel-dégel.
3. Préparation des animaux
- Pour l'observation microscopique de la microcirculation de préparer une plaque en plastique avec un trou de 20 mm de diamètre, et la bande d'un verre de 30 mm carrés couverture carrée sur le trou.
- Anesthésier une souris, retirez la fourrure, et préparer la peau. Placer un cathéter dans la queue vain l'injection de drogues en utilisant une aiguille 30 G connecté à un polyéthylène de 10 cm (PE 10) cathéter rempli de PBS hépariné.
- Après incision médiane, d'étendre un lobule principale du foie sur la plaque en plastique et placez la souris en décubitus sternal.
- Établir des feuillets d'une pellicule de petites cuisine (3 mm x 8 mm) et la tuile entre eux autour du bord du lobe hépatique d'inhiber le déplacement du foie avec la respiration et l'empêcher de séchage.
- Observez la microcirculation hépatique sous un microscope (à lumière transmise), et de confirmer que le bdébit lood n'a pas la stase dans le champ de vision pendant au moins 15 min.
- Injecter lentement 0,2 ml de globules rouges marqués par fluorescence pour l'observation du flux sanguin ou 0,2 ml de Pd-TCPP solution pour pO 2 de mesure. Cette quantité de globules rouges marqués au FITC comptera pour 1/50 de tous les globules rouges en circulation dans la région visualisée.
4. Visualisation de l'écoulement du sang
- Exciter l'FITC en l'irradiant avec de la lumière lampe à mercure qui a traversé un filtre passe-bande (450-490 nm) 1.
- Enregistrez l'image fluorescente avec une caméra CCD.
5. pO 2 Mesure
Pd-TCPP phosphorescence est relativement faible et devrait être détectés avec un détecteur à haute sensibilité. Toutes les expériences doivent être effectuées dans une pièce sombre.
- Les pics d'absorption de Pd-TCPP sont à 410 nm et 532 nm, de sorte que la longueur d'onde de seconde harmonique à 532 nm est recommandé pour l'excitation. Cette longueur d'onde peut être générée par un laser Nd: YAG impulsion laser 2.
- Faites passer le faisceau de laser Nd: YAG dans le port approprié sur le microscope inversé, et d'ajuster le point de faisceau à une position centrale dans le plan focal. La résolution spatiale dépend de la taille du spot laser, ce qui est changé en passant le faisceau à travers un trou d'épingle.
- À détecter la phosphorescence, attacher un filtre passe-long (> 620 nm) et un tube photomultiplicateur (PMT) à l'autre port du microscope. Le PMT devrait être sensible aux longueurs d'onde rouges, en particulier autour de 700 nm.
- Échantillonner le signal de phosphorescence (500 points échantillonnés à 200 kHz) et calculer la constante de temps de la décroissance en ajustant une fonction exponentielle de la désintégration.
- Pour l'étalonnage préparer deux ensemble d'échantillons de Pd-TCPP solution avec pO 2 150 mmHg et 0 mmHg. Ajouter dithionite de sodium 1% en volume à utiliser pour produire l'absence d'oxygène. Maintenir le pH des échantillons à 7,4 et la températureture à 37 ° C pendant l'étalonnage.
- Fixer le Stern-Volmer constante de temps k q et de l'oxygène sans décroissance de la luminescence τ 0 dans l'équation (1) 3. Dans notre cas, avec Pd-TCPP solutions à 37 ° C et un pH de 7,4, k q est de 374 mmHg -1 s -1 et τ 0 est de 0,74 ms. Ces paramètres de mesure dépendent de l'équipement (c.-à-laser, détecteur, d'autres dispositifs optiques) et la méthode de traitement du signal, afin d'étalonnage est nécessaire dans chaque système de mesure 4.
τ 0 / τ = 1 + k q • τ 0 • pO 2 (1) - Régler la souris sur la plaque sur la platine du microscope, observer la microcirculation hépatique, et d'ajuster la position de la cible des microvaisseaux au point de la tache laser.
6. Modèle de l'hépatite
- Souris rapide avec un accès gratuit à l'eau durant la nuit.
- Préparer un20 mg par ml de solution d'acétaminophène (APAP) dans le DMSO.
- Injecter par voie intrapéritonéale à elle 1 ml/100 g de poids corporel (soit 200 mg / kg de poids corporel). Après l'injection, la souris peut être donné libre accès à la nourriture et l'eau 5.
- 24 heures après l'injection, anesthésier la souris et d'exposer le foie en faisant une incision médiane. Si l'hépatite est atteint, la nécrose dans la région péricentral sera facilement visible à l'œil nu.
7. Les résultats représentatifs
Des exemples d'images de la microcirculation hépatique sont représentés à la figure 1, où (a) est une image de lumière transmise et (b) est une image de fluorescence. Individuels érythrocytes marqués au FITC sont observées dans le film vidéo, et des veinules de portail, sinusoïdes, et des veinules centrales sont reconnus par les directions d'écoulement de sang.
Comme le montre la figure 2, le spot laser irradiant une veinule centrale à travers une lentille de l'objectif x100 était Approximimmédiatement 10 microns de diamètre. Intravasculaire pO 2 dans la microcirculation hépatique a été mesuré dans C57BL mâle / 6 souris, et la figure 3 (a) montre les relations entre pO 2 et le diamètre des vaisseaux dans les veinules portales et centrale. Le gradient de pO 2 à partir du portail aux veinules centrales indique que les globules rouges libèrent de l'oxygène de manière efficace tout en passant par des sinusoïdes. Comme le montre la figure 3 (b), la moyenne était de 59,8 pO 2 mmHg dans les vaisseaux, 48,2 mmHg portail de sinusoïdes, et de 38,9 mmHg dans les veinules centrales.
Lorsque nous avons produit une hépatite aiguë par injection intrapéritonéale APAP, intravasculaire pO 2 a été significativement plus élevées dans chaque partie de la microcirculation hépatique: p <0,05 dans les veines portes et p <0,01 dans les sinusoïdes et les veines centrales (figure 3 (c)).
Figure 1. Faible grossissement images montrant la microcirculation hépatique, avec (a) la lumière transmise et (b) de fluorescence.
Figure 2. Image de spot laser irradiant une veinule ciblée central pour pO 2 de mesure.
Figure 3. PO 2 gradient dans la microcirculation hépatique des souris témoins sains et des souris atteintes d'une lésion hépatique induite par l'acétaminophène. (A) montre pO 2 par rapport diamètre du vaisseau pour le portail veinules (PV) et le centre de veinules (CV), et (b) montre le gradient d'oxygène à partir de PV pour CV par sinusoïdes (s). La pO 2 différence entre PV et CV reflète la consommation d'oxygène des hépatocytes ou d'autres cellules du parenchyme. (C) montre que dans des conditions hépatite induite par l'administration APAP, pO 2 a été significativement plus élevée dans les PV, S, et le CV et la pO 2gradient a diminué, ce qui indique que la consommation d'oxygène hépatique a été compromise.
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Discussion
Fournir de l'oxygène vers les tissus est un rôle essentiel de la microcirculation, et beaucoup de documents décrivent les maladies liées à l'anatomie et la rhéologie des microvaisseaux 6. Le flux sanguin du foie est une combinaison de sang artériel et veineux. Environ 30% du flux sanguin vers le foie est bien oxygéné du sang fourni par l'artère hépatique et l'autre 70%, fourni par la veine porte, est la sortie du sang mal oxygéné veineux de la rate et du tractus gastro 7. Maladies hépatiques comme la stéatose hépatique, de choc, ou une tumeur changement du flux sanguin dans la microcirculation hépatique. Pour déterminer l'oxygénation des tissus, il faut mesurer à la fois le flux sanguin et la concentration en oxygène dans la microcirculation. Le manque d'instruments disponibles dans le commerce pour la fabrication de ces mesures dans la microcirculation hépatique a fait qu'il est difficile d'obtenir des données physiologiques dans ce domaine.
Un point important dans les étapes de préparation des animaux est la fixation dele foie sur une plaque en plastique. Les résultats de fixation lâches dans le mouvement du foie synchronisée avec la respiration, ce qui interfère avec l'observation microscopique et rend l'analyse difficile. Fixation serré, cependant, provoque un écoulement de la stase sanguine. Conditions d'écoulement de sang doivent être observées si un microscope de faible puissance au cours de la procédure opératoire. Lasers de forte puissance facilement blesser microvaisseaux, de sorte que la fréquence de l'irradiation doit être minimisée. 1 Hz est généralement suffisant pour la mesure temporelle 8. Cependant, une seule mesure de la pO 2 prend moins de 1 ms, ce qui signifie que la fréquence de répétition peut être augmentée à 1 kHz pour rapide pO 2 changements, le cas échéant. En outre, la réaction photochimique de Pd-TCPP génère de l'oxygène singulet que les dommages microvaisseaux et induit l'agrégation plaquettaire 9. La combinaison de l'imagerie par fluorescence et pO 2 de mesure peut mesurer la dynamique du flux sanguin et la concentration d'oxygène tous ensemble. L'irradiation lampe au mercureFITC excitante excite aussi Pd-TCPP, cependant, générant ainsi l'oxygène singulet et beaucoup menant au flux de la stase du sang. Lorsque le flux sanguin à la fois et la tension d'oxygène sont mesurées dans le même animal, l'imagerie FITC devrait être fait avant Pd-TCPP est administré. En outre, le niveau d'oxygène systémique est indicative de la consommation d'oxygène dans le tissu. Il est préférable d'effectuer la gestion des voies respiratoires au cours d'expériences ou d'analyser les niveaux de gaz de sang après les expériences.
Nous avons utilisé l'APAP pour induire une hépatite aiguë, en partie parce que une dose élevée de l'APAP est connue pour entraîner une nécrose des cellules dans la région péricentral 10. Partielle mesure de la pression d'oxygène a montré l'20,9 mmHg pO 2 différence entre les veinules et les veinules portail central chez la souris de contrôle a diminué à 16,9 mmHg chez les souris traitées à l'APAP et que la pO 2 était plus élevée tout au long de la microcirculation hépatique. Le gradient d'oxygène dans la microcirculation hépatique est principalement le résultat de l'oxygène supplIed des veinules portail étant consommés dans les hépatocytes. La plus forte dose de APAP induit une nécrose dans la région péricentral 11, 12, et qui pourrait diminuer la consommation d'oxygène en aval, comme le montre la figure 3c. Pour déterminer les mécanismes qui sous-tendent l'hépatite détaillées du foie, en particulier les relations entre la nécrose tissulaire et le niveau d'oxygène, la quantification de l'étendue de la nécrose, et les taux sériques de bilirubine, ALT, AST, et les cytokines inflammatoires doivent être mesurés. Un grand nombre de maladies du foie sont liés à la microcirculation hépatique, en d'autres termes, à la distribution du débit sanguin, l'apport d'oxygène, et la consommation d'oxygène dans les tissus du foie. En cas de consommation chronique d'alcool, environ 10-15% d'alcool est métabolisé par le microsomale éthanol-oxydant du système, et la molécule P450IIE1 induite par l'alcool génère NAPQI 13, un métabolite toxique qui conduit à la nécrose des hépatocytes péricentral 14.
En conclusion, notre optique meaméthode surement peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, le diamètre, la vitesse d'écoulement du sang, et la tension d'oxygène.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Mme Risa Otsuka pour l'assistance technique et les expériences d'aide. Cette recherche a été partiellement soutenu par le Ministère de l'Education, la Science, des Sports et de la Culture, Grant-in-Aid pour jeunes scientifiques (B), 2010, 22700476 et Suzuken Memorial Foundation 2010 pour KT et cette étude a été soutenue par la recherche et le développement de la simulation de la prochaine génération intégrée de la matière vivante, une partie de la mise au point et l'utilisation du projet superordinateur de la prochaine génération du MEXT, et en partie par JST ERATO Suematsu projet Biologie gaz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
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