Summary
מערכת אופטית שפותחה לדמיין microcirculation כבד עם אריתרוציטים FITC, שכותרתו למדוד את הלחץ החלקי של החמצן microvessels עם phosphorimetry בסיוע לייזר. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ניתוח מבנה בקוטר כלי הדם, זרימת דם מהירות, ומתח החמצן.
Abstract
קיימת אי התאמה ניכרת בין היצע וביקוש חמצן בכבד בגלל צריכת החמצן הכבד הוא גבוה יחסית, אך כ -70% מאספקת דם הכבד הוא מחומצן היטב דם בווריד השער הנגזר בדרכי העיכול הטחול. החמצן מועבר על ידי הדם הזורם hepatocytes מענף הטרמינל של הווריד לפורטל ורדיד מרכזי באמצעות sinusoids, וזה הופך את שיפוע החמצן אונות הכבד. שיפוע החמצן הוא פרמטר חשוב גופנית המערבת את הביטוי של אנזימים במורד הזרם ב microcirculation הכבד, אבל חוסר טכניקות למדידת צריכת החמצן microcirculation הכבד דחתה הבהרה מנגנונים הקשורים לחילוף חמצן בכבד. השתמשנו ולכן FITC שכותרתו אריתרוציטים לדמיין microcirculation הכבד והשתמש בסיוע לייזר phosphorimetry למדוד את הלחץ החלקי של החמצן microvessels שם. NoncontaCT ומדידה רציפה אופטי יכול לכמת את מהירויות זרימת הדם, קוטר כלי, וכן מילויים חמצן הקשורים צריכת חמצן בכבד. במודל צהבת חריפה עשינו ידי מתן פרצטמול לעכברים צפינו בלחץ החמצן מוגברת בשני venules פורטל מרכזי אך שיפוע החמצן ירדה sinusoids, המציין כי נמק hepatocyte באזור pericentral יכול להעביר את הלחץ חמצן מעלה משפיעים על ביטוי האנזים באזור periportal. לסיכום, שיטות אופטיות שלנו עבור ופרמטרים המודינמיים הכבד למדידת צריכת החמצן יכולה לגלות מנגנונים הקשורים למחלות כבד.
Protocol
1. תיוג אריתרוציטים עם fluorescein Isothiocyanate האיזומר אני (FITC)
כל פרוטוקולי הניסוי השתמשנו אושרו על ידי ועדת בעלי חיים טיפול קיו הספר לרפואה של אוניברסיטת.
- להרדים כמה עכברים התורמות, וכן לאחר ביצוע החתך celiotomy לסגת הדם כולו נחות הווריד הנבוב עם המזרק 1 מ"ל, המכיל כמות קטנה של הפרין. העכבר היה מורדמים מיד בזריקה pentobarbital נתרן (100 מ"ג / ק"ג IP).
- לשטוף את הדם הזה פעמיים עם PBS (pH 7.4) על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 400 גרם של הרוטור נדנוד הדלי.
- להמיס 10 מ"ג FITC ב 5 מ"ל של 100 מ"מ Na 2 HPO 4 ולסנן אותו עם קרום שיש 0.22-מיקרומטר הנקבוביות.
- במבחנה לערבב 1 מ"ל של תמיסת FITC עם 0.15 מ"ל של גלוקוז 3 מ"מ, 0.25 מ"מ 180 מ"ל לאא 2 PO 4, ו - 1.5 מ"ל של 100 מ"מ Na 2 HPO 4. הוסף 0.2 מ"ל של Rגלולה לפני הספירה, והקש צינור לערבוב.
- לשמור על צינור עבור 2 שעות 4 ° C ולאחר מכן לשטוף את RBCs מוכתמים ב PBS פעמיים.
- שימו כמות קטנה של השעיה RBC על הדשא שקופיות ונראה אם RBCs נראים בריאים (כלומר, צורתם וגודלם תקינות) וכי עוצמת הקרינה היא מספקת.
- להשעות 0.1 מ"ל של RBCs ב 0.9 מ"ל של PBS ב-pH 7.4, ולשמור את ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס עד ההזרקה.
2. הכנת דיי חמצן רגיש
- ממיסים 500 מ"ג של BSA ב 10 מ"ל של PBS ב-pH 7.4.
- הוסף 30 מ"ג של Pd (II)-Meso-TETRA (4-carboxyphenyl) porphine (PD-TCPP) לפתרון BSA ומערבבים למשך הלילה.
- (אופציונלי) חלץ BSA הנכנס PD-TCPP באמצעות כוח המשיכה זרימת כרומטוגרפיה או עמודה ספין להפריד אותו ללא PD-TCPP.
- בצנטריפוגה פתרון להסיר שלא נמס PD-TCPP, ולסנן supernatant עם מסנן ממברנה שיש 0.22-מיקרומטר הנקבוביות. </ Li>
- חנות 1-מ"ל aliquots ב צינורות ב -20 ° C. למנוע הופעה חוזרת של ההקפאה, ההפשרה מחזורים.
3. בעלי חיים הכנה
- להסתכלות מיקרוסקופית של microcirculation להכין צלחת פלסטיק עם חור 20 מ"מ בקוטר, ואת קלטת זכוכית של 30 מ"מ מרובע כיסוי מרובע מעל החור.
- להרדים העכבר, להסיר את הפרווה, ועל הכנה העור. מכניסים קטטר בזנב לשווא הזרקת התרופה בעזרת מחט 30 G מחובר פוליאתילן של 10 ס"מ (PE 10) קטטר מלא heparinized PBS.
- לאחר החתך החציוני, להאריך lobule העיקרי של הכבד על צלחת פלסטיק, למקם את העכבר שעינת חזה.
- להכין פתקים קטנים עם גלישת המטבח (3 מ"מ x 8 מ"מ) אריח אותם מסביב לקצה של האונה בכבד לעכב העברת הכבד עם הנשימה ולשמור עליו מפני התייבשות.
- שימו לב microcirculation הכבד תחת מיקרוסקופ (עם אור מסור), ולוודא כי בזרימת lood אין קיפאון בתחום התצוגה של לפחות 15 דקות.
- לאט לאט להזריק 0.2 מ"ל של RBCs שכותרתו fluorescently עבור תצפית זרימת הדם או 0.2 מ"ל של תמיסת PD-TCPP למדידת 2 PO. זו כמות RBCs FITC שכותרתו יביא בחשבון 1/50 של כל RBCs במחזור באזור דמיינו.
4. זרימת הדם ויזואליזציה
- לרגש FITC ידי בהקרנה אותו באור מנורה כספית שעבר דרך פילטר bandpass (450-490 nm) 1.
- להקליט את התמונה ניאון עם מצלמה CCD.
5. ת.ד. 2 מדידה
PD-TCPP זרחני הוא חלש יחסית, יש לזהות עם גלאי רגישות גבוהה. כל הניסויים צריך להתבצע בחדר חשוך.
- פסגות הקליטה של PD-TCPP נמצאים 410 ננומטר ו 532 ננומטר, אז השני הרמוני 532 ננומטר אורך גל מומלץ עירור. אורך גל זה יכול להיווצר על ידי Nd: YAG לייזר פולס 2.
- להאכיל את הקורה מ Nd: YAG לייזר ליציאת המתאים מיקרוסקופ הפוכה, ולהתאים את המקום קרן לתפקיד מרכזי במישור המוקד. רזולוציה מרחבית תלוי בגודל לייזר במקום, אשר משתנה על ידי העברת קרן דרך חריר.
- כדי לזהות את זרחני, חבר ארוכת לעבור סינון (> 620 ננומטר) ועל צינור מכפיל (PMT) לנמל השני של המיקרוסקופ. PMT צריך להיות רגיש באורכי גל אדומים, במיוחד סביב 700 ננומטר.
- לדגום את האות זרחני (500 נקודות שנדגמו ב kHz 200) ולחשב את זמן קבוע של ריקבון על ידי התאמת פונקציה מעריכית כדי ריקבון.
- לצורך כיול להכין 2 סט של דגימות של פתרון PD-TCPP עם מ"מ כספית ת.ד. 150 2 ו 0 מ"מ כספית. הוסף נתרן dithionite 1% בהיקף לטעום לייצר היעדר חמצן. שמור את ה-pH של הדגימות על 7.4 ו טמפרהture על 37 מעלות צלזיוס במהלך כיול.
- תקן שטרן-Volmer קבוע k ש וחמצן ללא ריקבון זמן הארה τ 0 במשוואה (1) 3. במקרה שלנו, עם PD-TCPP פתרונות ב 37 ° C ו-pH של 7.4, k q הוא 374 מ"מ כספית -1 s -1 ו - 0 τ הוא 0.74 אלפיות שנייה. פרמטרים אלה תלויים ציוד המדידה (כלומר, לייזר, גלאי, מכשירים אופטיים אחרים) ואת שיטת עיבוד אותות, כך נדרש כיול בכל מערכת המדידה 4.
τ 0 / τ = 1 + k ש • τ 0 • ת.ד. 2 (1) - הגדר את העכבר על הצלחת על הבמה מיקרוסקופ, לבחון microcirculation הכבד, ולהתאים את המיקום של microvessel היעד עד כדי נקודה לייזר.
6. הפטיטיס דגם
- עכברים מהיר עם גישה חופשית למים בלילה.
- הכן20 מ"ג לכל פתרון מ"ל של פרצטמול (APAP) ב DMSO.
- מזריקים אותו intraperitonealy ב 1 ml/100 גרם BW (כלומר, 200 מ"ג / ק"ג BW). לאחר ההזרקה, עכבר אפשר לתת גישה חופשית למזון ומים 5.
- 24 שעות לאחר ההזרקה, להרדים את העכבר תחשוף את הכבד על ידי ביצוע חתך החציוני. אם הפטיטיס מושגת, נמק באזור pericentral יהיה גלוי בקלות בעין בלתי מזוינת.
7. נציג תוצאות
תמונות דוגמה של microcirculation הכבד מוצגים איור 1, שם (א) היא תמונה משודר אור ו (ב) היא תמונה פלואורסצנטי. אריתרוציטים FITC שכותרתו אישיות הם נצפו בסרט וידאו, venules פורטל, sinusoids ו venules המרכזיים מוכרים על ידי כיווני זרימת הדם.
כפי שניתן לראות בתרשים 2, במקום הלייזר בהקרנה ורדיד המרכזי דרך העדשה המטרה היה 100 x approximately 10 מיקרומטר קוטר. Intravascular ת.ד. 2 ב microcirculation כבד נמדד C57BL זכר / 6 עכברים, איור 3 (א) מציג את היחסים בין PO 2 ו בקוטר כלי שיט venules פורטל מרכזי. שיפוע 2 ת.ד. מהפורטל כדי venules מרכזיים עולה כי שחרור חמצן RBCs ביעילות בעת שעבר דרך sinusoids. כפי שמוצג באיור 3 (ב), היה הממוצע ת.ד. 2 59.8 מ"מ כספית על כלי הפורטל, 48.2 מ"מ כספית ב sinusoids, ו 38.9 מ"מ כספית ב venules מרכזיים.
כאשר הפקנו צהבת חריפה על ידי הזרקת APAP intraperitonealy, intravascular ת.ד. 2 היה גבוה באופן משמעותי כל חלק של microcirculation הכבד: p <0.05 בוורידים פורטל ו-p <0.01 ב sinusoids וורידים מרכזיים (איור 3 (ג)).
באיור 1. נמוכה הגדלה אניהמגים מראה microcirculation הכבד עם האור (א) העברת ו (ב) פלואורסצנטי.
איור 2. תמונה של המקום לייזר בהקרנה ורדיד המרכזי ממוקד למדידת 2 PO.
3. איור 2 ת.ד. שיפוע ב microcirculation הכבד של עכברים שליטה בריאים של עכברים עם פגיעה הנגרמת פרצטמול בכבד. (א) מראה ת.ד. 2 לעומת קוטר כלי עבור הפורטל venules (PV) ומרכז venules (CV), ו (ב) מציג את שיפוע חמצן PV כדי קורות חיים דרך sinusoids (ים). ההבדל בין 2 ת.ד. PV ואת קורות החיים משקף את צריכת החמצן של hepatocytes או תאים parenchymal אחרים. (ג) עולה כי בתנאים צהבת הנגרמת על ידי הממשל APAP, ת.ד. 2 היה גבוה באופן משמעותי PV, S, ו קורות חיים ת.ד. 2שיפוע קטן, המציין כי צריכת החמצן הכבד נפגע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אספקת חמצן לרקמות הוא תפקיד חיוני של microcirculation, והרבה ניירות לתאר מחלות הקשורות האנטומיה microvessel ו rheology 6. זרימת הדם בכבד הוא שילוב של דם עורקי וורידי. כ -30% מזרם הדם אל הכבד היטב דם מחומצן מסופק על ידי עורק הכבד ואת 70% הנותרים, המסופק על ידי עורק הפורטל, הוא ורידי דם מחומצן נמוכים מ יצוא הטחול ומערכת העיכול 7. כבד מחלות כגון הכבד הלם שומן, או שינוי הגידול זרימת הדם microcirculation הכבד. כדי לקבוע חמצון רקמות, צריך למדוד גם את זרימת הדם ואת ריכוז החמצן microcirculation. חוסר בכלים העומדים לרשותו באופן מסחרי על ביצוע מדידות אלה ב microcirculation הכבד עשה את זה קשה להשיג נתונים פיזיולוגיים בתחום זה.
נקודה חשובה בצעדים הכנת בעלי חיים היא קיבעון שלהכבד על צלחת פלסטיק. תוצאות קיבוע רופף בתנועה הכבד מסונכרנת עם הנשימה, אשר מפריעה תצפית מיקרוסקופית ועושה ניתוח קשה. קיבוע חזק, עם זאת, גורם לזרימת דם קיפאון. תנאי הזרימה דם יש לשים לב כי מיקרוסקופ בהספקים נמוכים במהלך ההליך האופרטיבי. כוח גבוהה לייזרים בקלות לפגוע microvessels, ולכן התדירות של קרינה צריך להיות ממוזער. 1 הרץ היא בדרך כלל מספיק למדידת זמני 8. עם זאת, מדידה אחת של פו 2 לוקח פחות מ 1 ms, כלומר את תדירות החזרה ניתן להגדיל kHz 1 עבור שינוי מהיר 2 PO, לפי הצורך. יתר על כן, התגובה של פוטו PD-TCPP מייצר חמצן גופיה כי הנזקים microvessels וגורם טסיות 9. השילוב של הקרינה הדמיה ומדידה ת.ד. 2 יכול למדוד את זרימת הדם דינמיקה ריכוז החמצן הכל ביחד. הקרנה מנורת כספיתFITC מרגש גם מרגש PD-TCPP, לעומת זאת, ובכך לייצר חמצן גופיה הרבה המוביל זרימת הדם קיפאון. כאשר גם זרימת הדם ומתח החמצן נמדדים החיה אותו, הדמיה FITC צריך להיעשות לפני PD-TCPP מנוהל. בנוסף, רמת החמצן מערכתית מעיד על צריכת החמצן ברקמות. רצוי לבצע וניהול הנשימה במהלך ניסויים או לנתח גז בדם לאחר הניסויים.
השתמשנו APAP לגרום צהבת חריפה, בין השאר בשל מינון גבוה של APAP ידוע להוביל נמק בתא באזור pericentral 10. מדידת לחץ חלקי חמצן הראה 20.9 מ"מ כספית, ת.ד. 2 ההבדל בין venules הפורטל venules המרכזיים עכברים שליטה ירד ל 16.9 מ"מ כספית ב APAP שטופלו עכברים וכי ת.ד. 2 הייתה גבוהה לאורך כל microcirculation הכבד. שיפוע החמצן microcirculation הכבד הוא בעיקר תוצאה של Suppl חמצןIED מ venules פורטל נטרפו על hepatocytes. מינון גבוה יותר של APAP גורם נמק באזור pericentral 11, 12, אשר יכול להפחית את צריכת החמצן במורד כפי שמוצג באיור 3 ג. כדי לקבוע מנגנונים מפורטים שבבסיס הפטיטיס כבד, במיוחד הקשר בין נמק רקמות רמת החמצן, כימות היקף נמק, ורמות בסרום של בילירובין, ALT, AST, וכן ציטוקינים דלקתיים צריך להימדד. הרבה מחלות הכבד קשורים בזרימת הכבד, במילים אחרות, חלוקת זרימת הדם, העברת חמצן, ואת צריכת החמצן ברקמת הכבד. במקרים של צריכת אלכוהול כרונית, כ 10-15% של אלכוהול עובר מטבוליזם על ידי מערכת אתנול חמצון microsomal, ואת P450IIE1 אלכוהול הנגרמת מולקולה יוצרת NAPQI 13, מטבוליט רעיל שמוביל נמק hepatocyte pericentral 14.
לסיכום, מאה אופטית שלנושיטת surement ניתן להשתמש כדי לחקור מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ניתוח מבנה בקוטר כלי הדם, זרימת דם מהירות, ומתח החמצן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
המחברים מודים לגב 'ריסה אוצוקה לקבלת סיוע טכני ניסויים עוזר. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי משרד החינוך, המדע, הספורט והתרבות, גרנט-in-Aid למדענים צעירים (ב '), 2010, 22700476, ואת Suzuken הזיכרון Foundation 2010 עבור KT וזה המחקר נתמך על ידי מחקר ופיתוח של סימולציה של הדור הבא משולבת של החומר החי, במסגרת פיתוח ושימוש פרויקט הדור הבא של מחשב העל של MEXT, ובחלקו על ידי JST פרויקט ERATO Suematsu ביולוגיה גז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J. Acute liver failure. Lancet. 376, 190-201 (2010).
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P. Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis. Handb. Exp. Pharmacol. 169, 369-405 (2010).
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
