Summary
ووصف طريقة تعداد CD4، وα اختبار، والذي يستخدم لعاب كامل لتوفير سريعة ودقيقة CD4 التهم. وα اختبار تكاليف البنسات ويلغي الحاجة لتقنية الكواشف، والتدريب مكلفة مثل الاجسام المضادة، والأجهزة، والتبريد، ونقل العينات، فضلا عن جمع ومعالجة الدم.
Protocol
1. إعداد الطازجة حلول العمل
- التخزين المؤقت 0.05 متر تريس المالحة، ودرجة الحموضة 7.8 (TBS): TBS. تحضير 60 مل TBS / microplate.
- معدات الوقاية الشخصية: خنزيري إيلاستاز البنكرياس، نوع 1 (PPE) وعلى النحو المنصوص عليه تعليق. يهز جيدا وتخفف من وسائل الحماية الشخصية في TBS إلى ما يقرب من 0.01 يو / مل. إعداد 6 مل العمل حل / microplate).
- SA 3 NA: Succinyl-L-علاء-L-علاء-L-علاء-P-nitroanilide (SA 3 NA). تحضير 0.1 M الأسهم SA حل NA 3 في سلفوكسيد ميثيل (DMSO) واستخدامها على الفور أو تخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد 6ml حل الفريق / microplate بواسطة تمييع الأسهم SA حل NA 3 1/100 في TBS.
- COOMASSIE BLUE: تحضير محلول المخزون بنسبة 10٪ الزرقاء الرائعة Coomassie R-250 (Coomassie الأزرق) في TBS واستخدامها على الفور أو متجر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد 6 مل حل الفريق من قبل تمييع الحل الأوراق المالية 1/1000 في TBS.
2. إعداد اللعاب
3. Microplate مجموعة المتابعة
- عينات: إلى كل اختبار جيد، يضاف لعاب 20 ميكرولتر عن الحجم النهائي من 150 ميكروليتر / جيد. مزيج من قبل pipetting دون إدخال فقاعات.
- الضوابط: التحكم إيجابي على معدات الوقاية الشخصية، ولكن لا لعاب. سيطرة سلبية يحتوي اللعاب، ولكن لا PPE.To سيطرة إيجابية جيدا يضاف 20 TBS ميكرولتر. لسيطرة سلبية تماما يضاف لعاب 20 ميكرولتر.
- PPE الحضانة: هزة PPE حل يعمل بشكل جيد. إضافة 50 عامل PPE ميكرولتر حل كل بئر باستثناء آبار مراقبة سلبية. إلى آبار مراقبة سلبية، إضافة 50 TBS ميكرولتر. احتضان 10 دقيقة في 23 درجة مئوية.
- التحضين الركيزة: أضف 50 ميكرولتر SA حل NA 3 العمل على كل بئر. احتضان 45 دقيقة في 23 درجة مئوية.
- COOMASSIE BLUE: أضف 50 ميكرولتر حل الأزرق Coomassie العمل < / لى>
- قراءة-OUT: اقرأ الامتصاصية في قارئ microplate، ونانومتر 405 للكشف عن انشقاق NA SA (3) الذي يمثل نشاطا α 1 PI وألف نانومتر 595 للكشف عن Coomassie الأزرق الذي يمثل نسبة البروتين.
4. α حساب مؤشر بي 1
- تطبيع المتوسط نانومتر 405 و 595 ألف نانومتر: للحصول على كل ثلاث نسخ، وحساب متوسط. طرح متوسط مراقبة سلبية من متوسط العينة. للتقليل من لوحة إلى لوحة الاختلاف، وتطبيع المتوسطات بقسمة متوسط كل نموذج من متوسط مراقبة إيجابية على النحو التالي:
- احسب 1 α PI INEX: اقسم تطبيع ألف نانومتر 405 نانومتر من قبل تطبيع 595 ألف:
"jove_content"> 
5. ممثل النتائج
لتحديد ما إذا كان α تجارب قد تكون مناسبة للاستخدام على انها اختبار فحص نقطة من الرعاية لرصد CD4 التهم المستوطنة في المناطق ذات الموارد المحدودة، وقد تم جمع لعاب حفزت من 20 أنثى و 11 ذكرا HIV-1 عيادة الموضوعات يحضرون لل الرعاية الروتينية في الكاميرون. بما يتفق مع الملاحظات الأولية خلال تطوير اختبار α باستخدام اللعاب التي جمعت في مدينة نيويورك، ومؤشر α بي 1 في اللعاب التي تم جمعها في الكاميرون ترتبط التهم CD4 (ص 2 = 0.91، P <0.0001. ن = 31). تم تعريف العلاقة منحنى 3-المعلمة السيني وهو ما يتسق مع وجود علاقة بين الجرعة والاستجابة (الشكل 2A). وصفت ثقة 95٪، وفترات تنبؤ بخطوط زرقاء وحمراء، على التوالي (2B الشكل).
فيدراسة سابقة، توصلنا إلى أن خلايا CD4 + T عرض الدراجات جيبية مع تواتر 23 ± 3.5 أيام في المواضيع-1 فيروس نقص المناعة البشرية والموضوعات مع إصدار ورثت من PI α نقص 1 (PIZZ) 3. هنا يصور مثال ممثل ولدت كمبيوتر الجيب تحليل منحنى CD4 ركوب الدراجات في غير HIV-1 مراقبة صحية دورية المعرض 27 يوما (الشكل 3A).
الحاسوب ولدت منحنى جيب تحليل CD4 + الخلايا التائية أسفرت التغييرات في 6 موضوعات قيم الذروة إلى الذروة السعة ومحور التذبذب 3. كما هو متوقع، فقد ارتبط محور التذبذب مع السعة (ص 2 = 0.96، P = 0.009، ن = 6) (الشكل 3B). سوف CD4 في المرضى الذين يعانون انخفاض عدد خلايا تي +، والتغيرات الدورية في عدد الخلايا التائية CD4 كانت صغيرة، وعلى المرضى الذين يعانون من ارتفاع CD4 + عدد خلايا تي، التغيرات الدورية كانت كبيرة.
لأنخط الانحدار صورت في الشكل 2 ويقدر يرتبط المحور من التذبذب ومحور التذبذب مع السعة، ويمكن حساب سعة للخط الانحدار وبالتالي تقدير مدى فوق وتحت ويتوقع أن CD4 خط الانحدار + الخلايا التائية أن تختلف نتيجة لل ركوب الدراجات (الشكل 3C). تتراكب مع سعة محسوب في 3C الشكل وفاصل الثقة محسوبة في الشكل 2B، وجد أن السعة (الخط الأخضر) يقع ضمن 95٪ فاصل الثقة (الخط الأزرق) (الشكل 3D).
الشكل 1. ملخص الإجراء: حامض الستريك مكان في الفم وجمع اللعاب. إضافة إلى الآبار اللعاب المخفف من microplate في ثلاث نسخ. إضافة إلى كل وسائل الحماية الشخصية بشكل جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في 23 درجة مئوية. إضافة إلى معدات الوقاية الشخصية ركيزة كل جيدا واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 23 درجة مئوية. إضافة Coomassie الأزرق وقراءة في 405 نانومتر للكشف عن نشاط وسائل الحماية الشخصية في 595 نيوتن متر للكشف عن البروتين.
الشكل 2. مقارنة بين تجارب α مع أسلوب قياسي تعداد CD4. A) وقد أجريت تجارب بواسطة α quantitating مؤشر α بي 1 في تحفيز اللعاب الفم كله. وأجريت CD4 التهم من قبل مختبر طبي مستقل باستخدام معيار التدفق الخلوي. تم جمع الدم من أجل التدفق الخلوي واللعاب في زيارة عيادة نفسه. وقد تم تعريف العلاقة بين مؤشر α PI (1) والتهم CD4 بواسطة منحنى 3-المعلمة السيني (ص 2 = 0.91، P <0.0001، ن = 31). ب) وصفت والثقة 95٪، وفترات تنبؤ في الأزرق والأحمر خطوط، على التوالي.
الشكل 3. دقة حساب CD4 جounts باستخدام Index.A α1PI معارضها) خلايا CD4 + T الدراجات جيبية مع دورية يوم 27 في عنصر تحكم غير HIV-1 صحي. ويصور المحور من التذبذب (الخط المنقط باللون الأحمر). B) الحاسوب ولدت موجة جيبية تحليل CD4 T الدراجات استخدمت الخلية لحساب السعة الذروة إلى الذروة ومحور من التذبذب في 4 موضوعات-1 فيروس نقص المناعة البشرية (1)، غير فيروس نقص المناعة البشرية -1 PIzz الموضوع، وعدم HIV-1 مراقبة صحية صورت في ألف جزء العلاقة بين CD4 + T عرف سعة الخلية ومحور من التذبذب من قبل 3-المعلمة منحنى السيني (ص 2 = 0.96، P = 0.009، ن = 6). C) واستخدمت علاقة السيني بين السعة ومحور التذبذب المشتقة في جزء B) لحساب السعة المتوقعة (خطوط خضراء) من نقاط على طول خط الانحدار (الخط الأسود) من الشكل 2. D) والسعة المتوقعة وكان الفاصل الزمني (خطوط خضراء) تختلف اختلافا كبيرا من فترة الثقة 95٪ (الزرقاء خطوط) على النحو الذي يحدده اختبار مان ويتني مجموع الرتبة (على أساس المقارنة بين متوسط الفرق بين فاصل الثقة 95٪ و خط الانحدار (63 خلية / ميكرولتر) والفرق بين متوسط خط السعة وخط الانحدار (37 الخلايا / ميكرولتر)، P = 0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المصل غير مخفف يحتوي على متوسط 36 ميكرومتر α 1 PI و 3.6 ميكرومتر α 2 macroglobulin (α 2 م) فارق بمقدار 10 أضعاف 8. كلا البروتينات تنافس للربط إلى معدات الوقاية الشخصية. وقد تم استغلال هذه الخصائص اثنين والتركيز والانجذاب معدات الوقاية الشخصية، لوضع طريقة التي هي قادرة على قياس تحديدا α 1 PI في مصل الدم طبيعي في ظل وجود منافسة α 2 م 8. وهذه الطريقة يمكن الكشف عن أقل قدر 50 نانومتر μ 1 PI في مصل الدم بنسبة 0.3٪. حتى التخفيف من مصل الدم 2.5٪، ملزم للم 2 α إلى معدات الوقاية الشخصية ويصبح غير قابل للكشف، وهذا التخفيف يحتوي على حوالي 900 نانومتر α 1 PI و 90 نانومتر α 2 م.
وعلى النقيض من المصل الذي يتكون من أكثر ب 10 أضعاف PI 1 α α من 2 متر، كل لعاب الفم يحتوي على فارق 20 ضعفا 9. وجدنا في هذه الدراسة أن يضعف، لعاب حفزتيحتوي على ما يقرب من أقل من 30 أضعاف α 1 PI من المصل أو ما يقرب من 1200 نانومتر α 1 PI ويتوقع أن تحتوي على ما يقرب من 60 نانومتر α 2 م. تم العثور على تخفيف لعاب الأمثل للتجارب α أن يكون 13٪ لعاب حفزت، ويتوقع هذا التخفيف لاحتواء ما يقرب من 160 نيوتن متر α 1 PI و 8 نانومتر α 2 M، بتركيز م 2 α التي هي دون الحد الأدنى الكشف في البروتوكول. نظرا لتركيز منخفض من α 2 M، فمن الممكن أن تحدد بدقة النشاط المحدد من PI 1 α في اللعاب من دون قلق للمنافسة من α 2 م. سمح قياسات نشط PI 1 α ونسبة البروتين في اللعاب حساب مؤشر α PI (1) التي وجدت لربط مع الأسلوب القياسي لقياس CD4 التهم، التدفق الخلوي. الأهم من ذلك، نتائج تحليل الانحدار (ص طرق تعداد CD4 لم تتخذ سابقا في الاعتبار الاختلاف الذي يرجع إلى ركوب الدراجات. من الناحية العملية، يمكن أن تختلف من CD4 التهم بقدر 200 خلية / ميكروليتر بين الحضيض وقمة مع دورية من 23-27 يوما، وهذا صحيح بغض النظر عن طريقة لقياس خلايا CD4 + T 3. وهكذا، فإن محور شرط لموجة من التذبذب ويوفر مقياسا أكثر دقة للCD4 الفرد الحقيقي + T عدد خلايا من تدبير يوم واحد، لأن محور التذبذب هو ساعة مستمرة لساعة، أسبوع لآخر. في حين أنها قد لا تكون مجدية لقياس مباشرة محور التذبذب للCD4 الفرد + الخلايا التائية، يمكن تقدير هذا باستخدام متوسط CD4 + طولية عدد خلايا تي طالما الاختلاف في تعداد CD4 لا يتجاوز السعة المتوقعة. اختلاف كبيروالصورة في التهم CD4 تشير إلى تأثير المتغيرات الأخرى من ركوب الدراجات. خط الانحدار صورت في الشكل 2 هو تقدير من محور التذبذب. وأظهر حساب السعة المتوقع فوق وتحت خط الانحدار أن السعة يقع ضمن فاصل الثقة 95٪. الفرق بين متوسط فاصل الثقة 95٪، وخط الانحدار هو 63 خلايا CD4 / ميكرولتر، والفرق بين متوسط السعة وخط الانحدار هو 37 خلايا CD4 / ميكرولتر. ويمكن تفسير هذا يعني ان التهم حساب 95٪ من CD4 من القياسات α الاختبار سيكون في غضون ما يقرب من 63 خلايا CD4 / ميكرولتر من التهم CD4 الفعلية وأن ما يقرب من 58٪ من هذه الفرق ستكون نتيجة لركوب الدراجات CD4. وهكذا، فإن الدقة في تجارب α هي المسافة بين فاصل الثقة والسعة وهو ما يقرب من 26 خلايا CD4 / ميكرولتر، ودقة من اختبار α هو ارتباط coefficieالإقليم الشمالي من خط الانحدار الذي هو 0.95 أو 95٪. هناك العديد من القيود على تجارب α كما هو موضح هنا، ولكن الحلول متوفرة بسهولة. على سبيل المثال، على الرغم من أن α تجارب وصف يستخدم تنسيق microplate، والقدرة على أداء α اختبار باستخدام تخفيف اللعاب واحد يسمح لاستخدامها في اختبار α-مع تكنولوجيا مقياس، أداة خالية، نظام بسيط من الناحية التكنولوجية. وكان ما يقرب من 2٪ من عينات اللعاب التي تم جمعها في الكاميرون لزجة جدا لمعالجتها، وهذا ينسجم مع اللعاب التي جمعت في مدينة نيويورك. ويمكن استخدام التطبيق من الدناز إلى مثل هذه العينات لتحسين اللزوجة مما يسمح قياس 10. قد يكون حلا إضافية لاستخدام sialagogues الصيدلانية التي تحفز إفراز اللعاب على وجه التحديد عبر ممر السمبتاوي مقابل متعاطف المنتجة وبالتالي لعاب مائي. مدر اللعاب واحد مثل هذا بيلوكاربين 11. وأخيرا، فإن α الاختبار لا يوجد لديهتي يتم بعد التحقق من صحتها، وهذا ضروري لتحديد ما إذا كان الأداء غير تمييزي بما فيه الكفاية لمستويات حرجة من التهم CD4 12. مستويات حرجة من التهم CD4 في المنطقة خطية من منحنى الانحدار السيني الذي سمح ليتم احتساب هذه القيم عن طريق خوارزمية خطي. في هذه الفئة من السكان، والانحدار الخطي للقيم <860 خلايا CD4 / ميكروليتر (ص 2 = 0.86، ن = 30، ف <2x10 -7) كانت جيدة مثل الانحدار السيني (ص 2 = 0.88، ن = 30، ف < 0.0001). والانحدار الخطي للمؤشرات α PI (1) أعلاه 67 والتي تتطابق مع ما يقرب من 350 خلايا CD4 / ميكروليتر (ص 2 = 0.88، ن = 15، ف = 0.002) وكانت جيدة مثل الانحدار السيني (ص 2 = 0.89، ن = 15، ف <0.0001). ومع ذلك، كان لا ارتباط كبير في مؤشرات α PI (1) أدناه 67 وهو ما يعادل 350 CD4 <خلية / ميكروليتر. (ص 2 = 0.17، P = 0.54، ن = 15) هذا هو قيمة حرجة منذ Wالمبادئ التوجيهية HO يوصي تعداد CD4 <350 خلايا CD4 / ميكرولتر في التأهل للحصول على العلاج المضاد للفيروس 13. لتحديد أفضل أداء اختبار وتحسين α على حساسية في أدنى القيم، ويجري جمع عينات من اللعاب إضافي 800 في الكاميرون في الفترة من 4 مجموعات: الأطفال حديثي الولادة-2 سنوات، عاما 3-5 و 6-15 سنوات و 16 سنوات وكبار السن. في الختام، α اختبار مهم من الناحية الفسيولوجية على عدد خلايا CD4 في الدم يمكن أن يؤديها حتى الآن باستخدام اللعاب وبالتالي توفير موسع ودقيق ودقيق نقطة من الرعاية طريقة لرصد CD4 التهم في المناطق الموبوءة مع عدم وجود الأجهزة في التكلفة لكل اختبار التي هي أقل من دولار واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم البحوث ومؤسسة هاري وينستون للبحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
- Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
- Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
- Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
- de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
- Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
- Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
- Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
- LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
- Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
- WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).
