Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

doi: 10.3791/4000 Published: September 1, 2012

Summary

يوصف هنا نهج الروبوتية إلى الإنتاجية العالية بلورة البروتينات الغشاء في mesophases شحمي لاستخدامها في تصميم هيكل الجزيئات باستخدام الأشعة السينية البلورات. وقدم ثلاثة روبوتات قادرة على التعامل مع لزجة لزجة والبروتين لادن mesophase جزءا لا يتجزأ من أسلوب.

Abstract

هيكل الوظائف الدراسات البروتينات الغشاء تستفيد كثيرا من وجود المتاحة عالية الدقة هياكل 3-D من النوع المقدمة من خلال البلورات بالأشعة السينية الجزيئات (MX). عنصر أساسي من MX هو إمداد ثابت من بلورات حيود الجودة مثالي. وأو شحمي في المتوسط ​​مكعب المرحلة (LCP) طريقة لبلورة البروتينات الغشاء هي واحدة من العديد من الطرق المتاحة لبلورة البروتينات الغشاء. فإنه يجعل من استخدام mesophase bicontinuous التي تنمو البلورات. كوسيلة من وسائل، وكان له بعض النجاحات الرائعة في الآونة الأخيرة واستقطبت الكثير من الاهتمام مع العديد من المجموعات البحثية المهتمة الآن في استخدامه. واحدة من التحديات المرتبطة الأسلوب هو أن mesophase استضافة لزج للغاية ومثبت، تذكرنا معجون أسنان سميكة. وهكذا، فإنه يدويا الاستغناء بطريقة استنساخه في كميات صغيرة في بلورة الآبار يتطلب مهارة وصبر ومطرد من ناحية. بروتوكول للقيام جوش التي وضعت في الغشاء الهيكلي والوظيفي الأحياء (MS & FB) المجموعة 1-3. مقالات الفيديو إن الرب واصفا الطريقة هي 1،4 المتاحة.

النهج دليل لإقامة المحاكمات في المتوسط ​​لديها مزايا واضحة مع التطبيقات المتخصصة، مثل وضوح الشمس والتحسين الاشتقاق. ومع ذلك فإنه لا يعاني من كونها وسيلة إنتاجية منخفضة. هنا، ونحن يبرهن على وجود بروتوكول للأداء في بلورة التجارب المتوسط ​​آليا. والروبوت يوفر مزايا السرعة والدقة، والدقة، والتصغير والقدرة على العمل بشكل مستمر لفترات طويلة تحت ما يمكن اعتباره ظروف عدائية كما هو الحال في الظلام، في جو خفض أو في درجات حرارة منخفضة أو عالية. يمكن للروبوت في المتوسط، عندما تستخدم بشكل صحيح، تحسن كثيرا من إنتاجية بنية البروتين الغشاء وظيفة البحث من خلال تسهيل بلورة التي تعد واحدة من الخطوات البطيئة فيوعموما خط أنابيب هيكل المصير.

في هذه المقالة الفيديو، ونحن لشرح استخدام ثلاثة الروبوتات المتاحة تجاريا التي يمكن الاستغناء عن mesophase لزج ودبق جزءا لا يتجزأ من المتوسط ​​في crystallogenesis. تم تطوير أول روبوت في MS & FB مجموعة 5،6. أصبحت في الآونة الأخيرة اثنين آخرين المتاحة ويتم تضمين هنا للتأكد من اكتمالها.

ويقدم لمحة عامة عن بروتوكول المشمولة بهذه المادة في الشكل 1. تم تنفيذ كافة التلاعب في درجة حرارة الغرفة (~ 20 ° C) في ظل الظروف المحيطة.

Protocol

1. إعداد لوحة البلورة

إنشاء القيام محاكمة بلورة آليا يبدأ التحضير للوحة قاعدة تبلور الزجاج لوحة ساندويتش (الشكل 2)، وصفت بالتفصيل في المرجع 2. يجب أولا أن قاعدة لوحة silanized ويجب أن تطبق مثقبة مزدوجة عصا التبادل التي تخلق الآبار، الى لوحة. يتم تصنيف المواد والإمدادات اللازمة لهذا في إطار المواد.

  1. وضع لوحة على منشفة ورقية، وتطبيق بضع قطرات من محلول silanizing وتوزيعه بالتساوي على سطح لوحة بمنديل ورق.
  2. إزالة الزائدة حل silanizing بغمر لوحة في كوب من الماء.
  3. تأخذ اللوحة من الكأس، وضعه على منشفة ورقية جافة، جنبا silanized يصل، وتجفيف سطحها كشفها بواسطة المسح برفق مع منشفة ورقية.
  4. انزع الغطاء الواقي على التبادل مثقبة مزدوجة عصا،وتطبيق التبادل، جنبا مثبت أسفل، إلى السطح، silanized الجافة من لوحة زجاجية. تأكد من أن يتم وضع التبادل بشكل صحيح على لوحة قاعدة، مع الزاوية اليسرى العليا والجانبين المتاخمة للوالتبادل لوحة، تتزامن.
  5. استخدام الأسطوانة أو براير لشد خارج التبادل على لوحة قاعدة لخلق وختم ضيق بينهما.

لوحات ما قبل تجميعها متاحة تجاريا (HR3-151، هامبتون البحث؛ MD11-55-100، الأبعاد الجزيئية، وLCP96T UVP70U، Swissci). لأسباب التكلفة، ونحن نفضل لتجميع لوحات الخاصة بنا بعد بروتوكول أعلاه.

2. وفي الوسطى روبوت 1

أول روبوت في المتوسط ​​أن أظهر في هذه المقالة الفيديو هو حاليا قيد الاستخدام في مجموعة الفيس بوك MS & (الشكل 3). ويمكن الاطلاع على التفاصيل الكاملة للروبوت تحت المواد والمراجع في القسم 5. المواد وصناعة اجهزةمطلوب NT لاقامة محاكمة تبلور باستخدام الروبوت يتم تصنيف المواد تحت.

  1. وضع قاعدة مع لوحة التبادل أعد القسم 1 على سطح السفينة للروبوت. لديها برنامجها الخاص ملحوظ مع المواقف بشكل جيد لأغراض قاعدة لوحة المحاذاة. يجب أن يكون المسمى لوحة لأغراض تحديد الهوية.
  2. تأمين كتلة 96-الكثيرمن جيدا في منصة خاصة به على سطح الروبوت بجانب لوحة التبلور.
  3. فتح كتلة بعناية من قبل تقشير قبالة كاب مواسير صرف من البلاستيك.
  4. بدوره على المرطب وتوجيه تيار من الهواء الرطبة وعبر أكثر من لوحة قاعدة على سطح السفينة للروبوت. وقد تبين للحد من المرطب التبخر من الحل مرسب وتعزيز استنساخ عبر لوحة تبلور 5. يمكن تشغيله قبل انشاء في مرحلة ما قبل ترطيب المنطقة عندما الرطوبة النسبية المحيطة منخفضة، أو غير ذلك، قبل الاستغناء عن mesophase تبدأ.
  5. تهيئة الروبوت باتباع إرشادات الشركة المصنعة. لن تعليمات محددة يمكن وصفها أداة هنا بأي قدر من التفصيل لأن الإجراءات بالضبط سوف تتغير مع مرور الوقت. أساسا، ما يحدث أثناء تهيئة هو أن يتم توفير mesophase الاستغناء ذراع الروبوت على مواقع مرجعية مع في ثلاثة اتجاهات متعامدة X، Y وZ.
  6. إرفاق mesophase البروتين لادن في حقنة هاميلتون، مع استكمال الاستغناء الإبرة، لتسليح 1 من الروبوت (الشكل 3). وقد وصفت التفاصيل الكاملة لكيفية إعداد mesophase وكيفية تحميله في المحقنة في المراجع 3،7-10.
  7. إزالة الغطاء العلوي واقية من التبادل على بلورة قاعدة لوحة ومحاذاة الآبار على لوحة مع fiducials على منصة قاعدة لوحة. علما، لغرض هذا الفيديو، وترك الغطاء الواقي في مكان لمساعدة عارض أثناء الخطوة المحاذاة.
  8. محاذاة الطرف إبرة من سيرينج الاستغناءه مع الجزء السفلي من العلوي بشكل جيد في الزاوية اليسرى من لوحة تبلور (حسنا A1). يتم ذلك عن طريق ضبط ارتفاع العين أو Z-تنسيق للذراع أثناء مشاهدة الاستغناء مدى قرب الطرف إبرة يأتي إلى أسفل البئر. يمكن أن الاتجار بالبشر هو مجرد لمس قاع البئر يكون الحكم عن طريق تحريك لوحة من جانب إلى آخر على منصة في حين من أي وقت مضى حتى قليلا ضبط ارتفاع الذراع الاستغناء.
  9. الدخول في الكمبيوتر Z-تنسيق للذراع حيث الاستغناء الاتصالات تلميح لوحة. وتمت برمجة الاستغناء عقده مع طرف الإبرة 80 ميكرومتر من هذا المرجع Z-الموقف الذي يتوافق مع سطح اللوحة قاعدة.
  10. موقف بالعين غيض من إبرة في مركز A1 حسنا. مخزن في الكمبيوتر والمسيطر X المرجعية، Y إحداثيات الذراع الاستغناء حيث يتم توسيط طرف. يستخدم هذا التنسيق لتحديد المركز من الآبار المتبقية على اللوحة.
  11. العلاقات العامةIME الحقنة باستخدام الأمر المناسب على الكمبيوتر الروبوت لضمان mesophase جديدة تملأ الإبرة والاستغناء أن الآبار الأولى واللاحقة تلقي تكملة كاملة من mesophase. تمحو mesophase مقذوف على الطرف إبرة بمنديل.
  12. بدء تشغيل الروبوت (X-AP) برنامج لبدء جولة من الخطوات التنظيف حيث يتم غسل نصائح الكثيرمن الاستغناء على ذراع 2 من الروبوت ونحن على استعداد لنضح حلول من كتلة الكثيرمن.
  13. تفعيل. الاستغناء الدالة على الروبوت لحركت التحميل متتابعة من الآبار مع البروتين لادن mesophase (عادة 50 NL) أولا، عمود من ثمانية آبار في كل مرة، تليها حلول مرسب (عادة 800 NL) بين الأعمدة التحميل، مبلل الذراع الاستغناء عوائد mesophase إلى موضع وقوف السيارات حيث يتم وضع نهاية الإبرة في اسفنجة لمنع mesophase في الطرف من الجفاف. يتم تكرار العملية من mesophase الاستغناء ومرسب11 مرة عبر لوحة حتى يتم تعبئة اللوحة. التحميل من لوحة 96-mesophase بشكل جيد مع ومرسب يأخذ 5 دقائق لإكمال.
  14. بمجرد يتم تعبئة لوحة والأسلحة الروبوت عادوا إلى مناصب بارك لهم، وإزالة لوحة من على ظهر الروبوت ووضعه على سطح صلب مسطح.
  15. على الفور، وختم لوحة زجاجية مع غطاء لتقليل الوقت التي تعتمد على التغيرات في التركيبة جيدا. من المهم لضمان تغطية كاملة جميع الآبار 96، أن يتم محاذاة غطاء من الزجاج مربع مع لوحة قاعدة وأن أيا من الزجاج غطاء يمتد إلى أبعد من البصمة من لوحة قاعدة. يتم استخدام الأسطوانة أو براير لخلق ضيقة وختم موحدة بين الزجاج وغطاء التبادل و.
  16. تفقد لوحة للتأكد من أن مجموعة قد ارتفع ليصل كما يجب. ما كان المرء يبحث عن هو 'بيض مقلي في مقلاة' ظهور له في كل بئر. صفار البيض المقلي ليتوافق مع mesophase. بياض البيضة هو soluti مرسبوعلى حافة الحوض طبيعي هو محيط تبلور بشكل جيد. من الناحية المثالية، والثلاثة هم متحدة المركز.
  17. وضع لوحة في منطقة التخزين التحكم في درجة حرارته لنمو البلورات.
  18. إذا لا أكثر لوحات هي التي يتم إقامتها، إلى رفع الحظر عن الكثيرمن من على ظهر الروبوت، ختم عليها بإحكام ووضعها مرة أخرى إلى التخزين.
  19. إزالة حقنة تحتوي على mesophase من الذراع الاستغناء عن الروبوت، تفكيكه، وغسل أجزائه بما في ذلك تركيب الإبرة والطويق، بعناية مع الميثانول والجافة استعدادا لاستخدام المقبل.

3. وفي الوسطى روبوت 2. البعوض LCP

نظام الإجراءات الجزائية البعوض الروبوت (الشكل 4) يشتمل على موزع mesophase مماثلة لتلك المستخدمة من قبل روبوت 1. وعلى النقيض من الروبوت 1، فإنه يوزع الكثيرمن عن طريق نصائح التخلص منها. يتم استخدام البرمجيات البرمجة لإعداد صك للعمل مع لوحات خاصة وبلورة precipitكتل النمل، والاستغناء مجلدات المعرفة من قبل المستخدم من mesophase ومرسب في تسلسل محدد. وترد تفاصيل هذه من قبل الشركة المصنعة، وسوف لا يمكن وصفها هنا.

  1. إعداد حقنة هاميلتون، مع استكمال إبرة ومليئة بالبروتين لادن mesophase، كما هو موضح أعلاه في إطار روبوت (1) والمادة 1712 إن الرب في 1.
  2. المشبك الحقنة في الذراع موقف بشأن الاستغناء عن الروبوت.
  3. شنت استخدام سطح السفينة استشعار ليزر لتحديد X Y إحداثيات وللإبرة الحقنة على الاستغناء. هذا هو خطوة هامة مطلوبة لضمان الاستغناء عن mesophase بدقة في مركز كل بئر على لوحة.
  4. مع لمسة زر واحدة على لوحة التحكم، رئيس الحقنة لطرد mesophase من الإبرة. إزالة mesophase مقذوف من طرف الإبرة بمنديل استعدادا لاستخدام الروبوت لتحميل الآبار.
  5. قبل وضع لوحة على سطح بلورة من رطبة الروبوتEN سطح المنصة مع بضع قطرات من المياه للمساعدة في اجراء لوحة وضعتها الشعرية.
  6. إزالة الغطاء الواقي من التبادل على زجاج قاعدة لوحة ووضعها على منصة بحزم لضمان التقيد جيدة. استخدام fiducials الثلاثة على منصة لمحاذاة الزاوية الآبار 3 وبالتالي ضمان تحديد المواقع المناسبة للآبار على لوحة فيما يتعلق غيض إبرة الاستغناء. ويقود الان الصك لدخول دورة تركيب الأدوية.
  7. دورة تبدأ بخطوة فتيلة الثاني حيث يتم الاستغناء mesophase على لوحة زجاجية صغيرة على الفور قبل أن ينتقل لتحميل الآبار مع mesophase الطازجة. الأحمال أول روبوت مع mesophase عمود رأسي من 8 آبار على لوحة ومن ثم يستخدم نصائح القابل للتصرف في الاستغناء حل الكثيرمن على رأس البلعة mesophase. يتم تكرار العملية 11 مرة على طول لوحة حتى يتم شغل جميع الآبار. العملية برمتها يستغرق حوالي 5 دقائق لإكمال.
  8. نزعلوحة شغله من النظام الأساسي للروبوت وختم عليه مع كوب الغلاف كما هو موضح أعلاه في إطار روبوت 1.
  9. وضع لوحة، وصفت بشكل صحيح، في بيئة درجة الحرارة للرقابة لنمو البلورات.

4. وفي الوسطى روبوت 3. العنقاء LCP

نظام الإجراءات الجزائية العنقاء الروبوت (الشكل 5) يشتمل على نظام mesophase مماثلة لتلك التي وصفها الاستغناء عن الروبوتات أعلاه 1 و 2. ما يميزها عن الاثنين الآخرين هو أن الاستغناء عن حلول مرسب 96 في وقت واحد.

  1. إعداد mesophase البروتين لادن وتحميله في المحقنة صرفها، كما هو موضح أعلاه، تحت الروبوتات 1 و 2، وفي المادة 1 إن الرب 1712.
  2. المشبك الحقنة في الذراع موقف بشأن الاستغناء عن الروبوت.
  3. وضع كتلة الحل ومرسب لوحة تبلور على سطح السفينة للروبوت.
  4. تحميل هيئة التعليم العالي 96-تلميحد مع حلول الكثيرمن. ويرد المعرفة من قبل المستخدم تأخير الوقت لتسهيل الشفط مسببات لزج.
  5. قيادة صك لدخول دورة تركيب الأدوية. تبدأ الدورة مع يجري الاستغناء عن mesophase بالتتابع في الآبار 96 في عملية تستغرق حوالي 1 دقيقة لإكمال. رئيس 96-تلميح يوزع بعد ذلك كل الحلول في آن واحد 96 مرسب على رأس boluses mesophase في الآبار التبلور. الانتهاء من كامل عملية التحميل لوحة في 2 دقيقة.
  6. إزالة لوحة شغله من النظام الأساسي للروبوت وختم عليه مع كوب الغلاف كما هو موضح أعلاه في إطار روبوت 1.
  7. وضع لوحة، وصفت بشكل صحيح، في بيئة درجة الحرارة للرقابة لنمو البلورات.

5. ممثل النتائج

والغرض من هذه المقالة هو لإظهار الفيديو كيفية إعداد التجارب تبلور تلقائيا مع لزج، غشاء البروتين لادن mesophase في الشطائر الزجاجلوحات H 96-بلورة أيضا. وينصب التركيز على التشغيل الآلي من خلال استخدام الروبوتات المتخصصة التي تتطلب الحد الأدنى من التدخل اليدوي. ومن المتوقع تكرار والدقة، من حيث حجم mesophase ومرسب الاستغناء ووضع داخل البئر، وعندما يتم استخدام الروبوت. هذه هي مهمة من وجهة نظر الفرز الفعال للظروف التي تدعم crystallogenesis. بل هي أيضا حاسمة لاتخاذ الخطوة التالية في خط أنابيب التحليل الذي هو تقييم نمو البلورات ذلك غالبا مع معدات التصوير. انخفاض أو البلعة الموقع هو المفتاح لعملية التصوير، والتنسيب غير النظامية وغير لائق من البلعة في البئر وعادة ما يتطلب تدخل المستخدم لتصحيح ويستغرق وقتا طويلا. لأغراض التوضيح، ترد أمثلة لوحات صحيح وغير صحيح تحميل في الشكل 6.

الشكل 1
الشكل 1. ومخطط يلخص الخطوات المتبعة في حصاد وإنتاج وتبريد البرد في المتوسط ​​من بلورات البروتين، نمت الغشاء. الخطوات محاطة الخط الأحمر متقطع هي محور هذه المقالة إن الرب. كانت الروبوتات تستخدم لحلول الاستغناء mesophase ومرسب في خطوات 29-32. من المرجع 3. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. A محملة بالكامل ومختومة ساندويتش الزجاج 96-وحة تبلور بشكل جيد. كل بئر يحتوي على 50 مرحلة NL مكعب و 1 ميكرولتر حل الكثيرمن. من أجل الوضوح، وقد ملطخة المرحلة مكعب مع الأحمر السودان والحل يتضمن الكثيرمن الأزرق الميثيلين. من المرجع 5.

_upload/4000/4000fig3.jpg "بديل =" الشكل 3 "/>
الشكل 3. والروبوت في المتوسط ​​(روبوت 1). الروبوت لديه ذراعين. الذراع 1 يوزع mesophase البروتين شحمي لادن. ذراع 2 يوزع حلول الكثيرمن. أثناء التعبئة، لوحة 96-جيدا لا تزال ثابتة في موقفها من سطح السفينة للروبوت والتي هي نفسها ثابتة. نقل اثنين من الأسلحة لتقديم حلول mesophase ومرسب. من المرجع 3.

الشكل 4
الشكل 4. نظام الإجراءات الجزائية البعوض الروبوت (الإنسان الآلي 2). وعلى النقيض من الروبوت 1، وسطح السفينة من نظام الإجراءات الجزائية البعوض، والتي يعتمد عليها الجلوس لوحة 96-جيدا وكتلة الحل مرسب، يتحرك أفقيا أثناء التعبئة.

الشكل 5
الشكل 5. نظام الإجراءات الجزائية العنقاء الروبوت (الإنسان الآلي 3). خلالإعداد وشحمي موزع المرحلة مكعب يتحرك لتقديم البروتين لادن على طبق mesophase 96-أيضا. سطح السفينة ثم يترجم أفقيا لوضع لوحة تحت الرأس حل الكثيرمن تلميح. والاستغناء عن حلول مرسب 96 في وقت واحد. صور مصادر من الشركة المصنعة ( http://www.artrobbins.com/ ) والمسمى.

الشكل 6
الشكل 6. A محملة بالكامل ومختومة ساندويتش الزجاج 96-جيدا لوحة (A) والآبار بشكل صحيح (B) وغير صحيح (C، D) شغلها باستخدام الروبوت في المتوسط ​​(روبوت 1). التسمية قانون نقابة المحامين على لوحة في يستخدم لتعقب لوحة في الجهاز حاضنة / التصوير وحة. في لوحات وتتميز BD، حل الكثيرمن وmesophase P وM، على التوالي. المتوقع 'بيض مقلي في مقلاة'ظهور بشكل جيد في B هو سمة من تحميل بشكل صحيح ومختومة جيدا. في C، تم الاستغناء عن الكثيرمن إلى غير صحيح جيدا في موقف خارج مركز وتأتي في اتصال مع التبادل. في C، يبدو أيضا أن حجم mesophase هو أقل مما ينبغي أن يكون. ويرد مثال على التحميل غير كاملة مع حل الكثيرمن في لD. الحجم، قطر كل بئر هو 6 ملم.

Discussion

في هذه المقالة الفيديو وأثبتنا كيفية استخدام الروبوت لتعيين تلقائيا في التجارب تبلور في المتوسط ​​96-وحات جيدة ساندويتش الزجاج باستخدام mesophase البروتين شحمي لادن. وقد صممت خصيصا للروبوتات المستخدمة في هذا العمل ليشمل الزجاج الإزاحة الموجبة للتسليم حقنة دقيقة وقابلة للتكرار وحدات التخزين نانولتر من mesophase لزج ودبق، كما هو موضح في الأصل 7.

الدقة والدقة هي السمات الهامة لالروبوت. ومع ذلك، وهذه الخصائص هي فقط جيدة بقدر درجة وانتظام التي يتم تقييم أداء الروبوت ويتم تنفيذ المعايرة. فمن نافلة القول أنه ينبغي تقييم أداء الروبوت في حين أنه يتم حاليا وضع لوحات فردية. من غير المناسب أن نفترض أن الروبوت سوف تعمل لا تشوبه شائبة وترك الروبوت لتشغيل غير المراقب. يقوم مشغل اليقظة وملاحظ تكون في نقاط البيعition أن نلاحظ من خلال الصوت أو ظهور عندما يكون هناك شيء لا يعمل بشكل صحيح وتصحيح على الفور. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تفقد كل لوحة بعناية من قبل العين توحيد محتويات جيدا بمجرد اغلاق لوحة وقبل وضعه بعيدا عن المحاكمات التبلور. وينبغي أن يتطلب سوى بضع ثوان لأداء ويمكن القيام به في حين يتم تحميل لوحة القادم. يلاحظ، على سبيل المثال، قد لا يتم بشكل صحيح ملء الآبار خاصة تسليط الضوء على حقيقة أن بعض تلميح الاستغناء الكثيرمن تعمل بصورة صحيحة. يجب تسليم mesophase أن ينظر إليها على أنها غير منتظمة، فإن البند ذي الصلة خلل تحتاج إلى تصحيح على الفور. بالإشارة إلى هذه القضايا وإجراء التعديلات ذات الصلة خلال مجموعة سيوفر وقتا والمواد، بما في ذلك البروتين والدهون قيمة الغشاء. إذا تم استخدام تصوير لتتبع نمو البلورات، ويمكن أيضا أن دقة ودقة رصد خلال التصوير. على سبيل المثال، مشاكل منهجية مع انخفاض أو البلعةالموقع من قبل تصوير تشير إلى أن شيئا ما ليس صحيحا وأنه يلزم اتخاذ إجراءات تصحيحية المنبع في مكان ما في البروتوكول.

في مصلحة الأداء الموثوق ذلك يجب معايرة الروبوت على جدول منتظم وحسب الحاجة. يجب أن تشمل المعايرة حجم مرسب وmesophase تسليمها وكذلك التنسيب بلعة ومرسب في البئر. من الواضح، ينبغي أن يتم معايرة حيثما كان ذلك ممكنا باستخدام وحدات التخزين والمواد مماثلة لتلك التي سيتم استخدامها في التجارب التي أجريت في الفترة التي يغطيها نوعية ممارسة السيطرة.

بنفس أهمية المعايرة وذلك أيضا هو وجود في سوق الأسهم إمدادات كافية من قطع الروبوت واللوازم. يمكن فشل كارثي وغير متوقعة، وانسداد حوادث والقيام تحدث. في مثل هذا الحدث، وكان يتوفر على معلومات سرية استبدال تسليم الكثيرمن، على سبيل المثال، قد يعني أن يتم استخدام البروتين الغشاء قيمة للغاية كما يجب إعداد ولا يضيع.

بعض من مزايا الروبوت تشمل حقيقة أنه سوف يعمل بشكل مستمر في الأساس، وأنه لا يعاني من أو "يشكون من" التعب. ويمكن أيضا أن تستخدم الروبوت في ظل ظروف التي لا تعتبر الإنسان والعائلات، كما هو الحال في الظلام، تحت اضاءة مسيطر عليها والظروف البيئية، وعلى اقصى درجة الحرارة. واستخدمت جميع الروبوتات موضح في هذه المقالة في ظل الظروف المحيطة في C. ~ ° 20 ومع ذلك، هناك بروتينات والمشاريع التي تتطلب درجات حرارة غير المحيطة، وعلى ضوء سيطرة 11،12 والمؤكسدة وتقليل أو بيئة 13. يمكن كل هذه لبيت، بسهولة نسبية، عند استخدام الروبوت التبلور.

في مقال سابق إن الرب فيديو أثبتنا كيف يتم تعيين التجارب التي تبلور في طريقة المتوسط ​​يصل يدويا 1. ويقتصر حجم الحد الأدنى من mesophase التي يمكن الاستغناء موثوق باليد بذ البصرية وحدة ثابتة الإنصاف للشخص إقامة المحاكمات. في تجربتنا، يتم التعامل مع بسهولة حجم mesophase منخفضة تصل إلى 100 NL. ونحن نعرف من أحد المختبرات حيث حجم الافتراضي يدويا الاستغناء حوالي 40 NL. ومع ذلك، حجم أصغر بكثير ممكنة باستخدام الروبوت. بشكل منفصل، وقد أظهرنا أنه يمكن الاستغناء عن كميات منخفضة mesophase إلى 550 picoliters آليا 14. من أن العمل كان من الواضح أن المزيد من التصغير الروبوت المحتملة التي، إذا ما نفذت، من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض كبير في كمية البروتين الغشاء قيمة اللازمة لإجراء المحاكمة التبلور.

في هذه المقالة الفيديو، تم استخدام ثلاثة الروبوتات المتاحة تجاريا لإثبات عالية الإنتاجية بلورة البروتين غشاء شحمي باستخدام mesophases. تم تطوير أول هذه المجموعة في الفيس بوك وMS بناء على خبرتنا إقامة محاكمات يدويا، كما هو موضح في 1712 إن الرب 1. هذا هو الصكوكمنة لدينا أكثر ألفة مع ويخصص الجزء الأكبر من المادة الحالية لاستخدامها. كانت الآخران الروبوتات على مظاهرة في مجموعة الفيس بوك وMS في وقت كتابة المقال ويتم تضمين لقطات ذات الصلة هنا في مصلحة اكتمالها. جميع الروبوتات تستخدم ثلاثة منها كثيرا نفس الاستغناء عن نظام mesophase، وسمة أساسية من سمات وهو الزجاج الإزاحة الإيجابية حقنة 5،7. أنها تختلف الأهم فيما يتعلق تسليم الكثيرمن. يمكن الروبوتات 1 و 2 في وقت واحد الاستغناء الكثيرمن إلى 8 آبار، عمود واحد على لوحة تبلور في وقت واحد. في المقابل، روبوت 3 يوزع كل الحلول مرسب 96 وذلك في خطوة واحدة. الروبوت 2 هو الأداة الوحيدة مع نصائح الكثيرمن المتاح الاستغناء. هناك إيجابيات وسلبيات المرتبطة مختلف الصكوك التي تعتمد على تطبيق معين، لن يتم وضع هذه هنا. ويكفي ان نقول ان كل عمل لمدة ثلاث وأنتجت بلورات ليالبروتينات mbrane من قبل في طريقة المتوسط.

الخطوات التالية في العملية الشاملة لتصميم الهيكل من قبل البلورات الجزيئات هي الحصاد والبرد بارد بلورات من إعداد لوحات كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو وتسجيل وعملية حيود الأشعة السينية منها. وتغطي هذه المواضيع في مقالات منفصلة إن الرب في هذه السلسلة 1،15.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هناك العديد من الذين ساهموا في هذا العمل ومعظمها من الغشاء الهيكلية والوظيفية المجموعة الأحياء، وكلاهما عضو في الماضي والحاضر. لجميع نتقدم بأحر الشكر والتقدير. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم ايرلندا (07/IN.1/B1836)، والمعاهد الوطنية للصحة (GM75915، وP50GM073210 U54GM094599)، وFP7 CM0902 العمل COST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brayer (roller) Fisher Scientific 50820937 Tool
Gas-tight syringes Hamilton 81030 Tool
Glass coverslips Marienfeld 01029990911 Disposable
Glass plates Marienfeld 1527127092 Disposable
Gryphon LCP Robot Art Robbins NA Tool
In meso robot Anachem/Gilson NA Tool
Lab notebook Various NA Tool
Mosquito LCP Robot TTP Labtech NA Tool
Perforated double-stick spacer tape Saunders Corporation (hole-punched) customized Disposable
Precipitant solutions Various Various Reagent
Purified water Millipore NA Reagent
Rain-X Shell Car Care 80199200 Reagent
Syringe tips Hamilton 7770-020 (gauge 22) Tool
Tissues Various Various Disposable
Water bottle various NA Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases. J. Vis. Exp. (45), e1712 (2010).
  2. Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).
  3. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
  4. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. (49), e2501 (2011).
  5. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
  6. Peddi, A. High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases. IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).
  7. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
  8. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases. Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).
  9. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
  10. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).
  11. Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping. J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).
  12. Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution. Nature. 411, 909-917 (2001).
  13. Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).
  14. Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).
  15. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography. J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).
استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000, doi:10.3791/4000 (2012).More

Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000, doi:10.3791/4000 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter