Summary
本文所描述的过程中实现卡弗里膜的结构和功能的生物集团收获和低温冷膜蛋白晶体生长大分子的X射线晶体结构测定中使用的油脂的立方和海绵阶段。
Abstract
了解蛋白质的功能在机械水平的一个重要途径是，有靶蛋白的结构，最好是在原子级分辨率。目前，只有一个施加到完整的膜蛋白（ 图1），和它们形成的复合物的方式来捕捉此类信息，并且该方法是大分子X-射线结晶器（MX）。要做到MX衍射质量晶体的需要，在膜蛋白的情况下，不容易形成。膜蛋白，包括利用，脂质介孔，特别是的立方和海绵阶段1-5，结晶的方法获得了相当的关注的晚期由于取得了G蛋白偶联受体领域6-21（ WWW 。mpdb.tcd.ie ）。但是，方法，以下简称为中观或脂质立方相法，配有其自身的技术的挑战。这些出现时，一部分原因是由于脂质中间相性质，在其中，这往往是微晶体，晶体生长的一般粘性和粘性。操作晶体的结果变得困难，特别是在收获22,23。问题出现时太在收获的步骤之前要求的玻璃夹层板，其中晶体的生长（ 图2）24,25被打开以暴露中间相丸剂，其中的结晶，收获，低温冷却和最终X -射线衍射数据的收集。
立方和的海绵中间相变体（ 图3）晶体收获都必须有深刻的不同的流变性4,26。立方相的粘性和粘类似于一个厚厚的牙膏。与此相反，海绵相多个流体流动具有鲜明的倾向。因此，不同的方法来打开结晶井containing的晶体生长在立方相和海绵相被称为作确实需要不同的方法收获从两个中间相类型的晶体。协议只是做，已细化和落实在膜结构与功能的生物集团（MS＆FB），并详细介绍了在此朱庇特的文章（ 图4）。实施例中给出的情况，在结晶成功收获和低温冷却的。我们还提供例子的情况下，出现问题，导致无法挽回的损失的晶体，并说明如何避免这些问题都可以。在这篇文章的浏览器提供了一步一步的指示，打开玻璃夹层的结晶井，收获和低温冷却的膜蛋白晶体生长立方和海绵阶段。
Protocol
1。实验室设置捕前
- 在收获的准备，填补了干性发泡杜瓦用液态氮，并把它旁边的收获是发生在显微镜下。
- 被淹没的存储冰球，打开结束了，里面的泡沫杜瓦在液态氮中，并允许它完全冷却下来。
- 固定安装的尺寸相匹配的晶体上的磁力棒（ 图5）将收获微。这是重要的手头上有一些备用磁性棒预装微坐骑，以配合的情况下，这是必要的收获几个晶体从一个大丸剂。备用魔杖应该是可以在任何时候进行。
- 将微管，技巧和沉淀的解决方案，用于晶体生长的收获显微镜。它可能需要以覆盖中间相和，以防止干燥的井被打开时。
- 在板凳上有一个笔记本和一支笔，关闭和/或在计算机上打开。这些将被用来记录有关的质量，外观，位置，存储圆盘号码，等，结晶，因为他们被采伐，低温冷却，并放置在存储的观测。
- 如果一个助理可以帮助与收获的人一定要了解清楚的协议之后，将各个步骤的顺序会发生，和他们在整个过程中的作用。
所有的材料和设备在我们的下一个任务是：
2。确定板和样品中的晶体
- 最简单和最直接的方法寻找收获的晶体是手使用正常和交叉的偏振光显微镜检查井。在显微镜下可以帮助调整照明光线强度与定位的结晶。
- 另外，成像板自动筛选与正常和交叉极化D灯，可以用来寻找晶体。
- 评估用眼睛记录的数字图像在计算机显示器上。
- 清楚地标明这些井的大小，质量和位置的中间相在笔记本电脑或一台计算机上的晶体在晶体的收获和记录意见。
- 删除板中晶体的热像仪的收获。
3。打开以及与立方中间相。方法1
由内消旋方法，其中晶体生长的板是玻璃夹心板（ 图2）。为了访问的中间相，其中的结晶，它是必要的，以打开孔。这是通过使用一个玻璃切割工具切割的上部的盖片玻璃密封的井可以被删除。
切割和取出盖玻片的结晶，有几种方法。使用的是出于O型f中间相的晶体生长。这可以是很粘稠的和粘性的立方相（ 图3A）或更多的流体变型中，海绵相（ 图3B）。在这个视频文章中，我们将展示如何打开井和收获这些托管材料的晶体。
- 放置在舞台上的光显微镜的玻璃夹层结晶板。
- 使用的玻璃切割工具得分盖玻片轻轻带两个同心圆，位于上方的隔板和外面的周边的阱。有了一个新的刀具，需要施加的压力降至最低得分。更换时所需的压力得分甚至小幅增加一个新的工具，这通常发生在开放10口井。
- 分手两个得分圈之间的空间中的玻璃释放的内盖片玻璃的目的。这会产生大量的玻璃碎片和尘埃。清除他们用湿纸巾。
- 抓住用细尖镊子和倾斜距离和关闭以及删除释放的玻璃罩。在这种情况下，立方相仍然卡住，以代替在底板上的阱。
- 放大得到一个更清晰的视野立方中间相准备收获的晶体使用。
4。打开一个井三次中间相。方法2
- 使用刀具得分直的平行线，在盖玻片一侧的阱和延伸横跨井本身的玻璃。这使得更容易镊子访问和去除盖玻片。
在这个特殊的示范，使盖玻片粘垫片表面裂缝的玻璃罩。盖玻片转移的过程中，在适当位置，从立方相分离和沉淀剂。当玻璃罩取消一些的沉淀“。我们只剩下裸露bOLUS的中间相，没有任何沉淀。随即，丸，用微量吸移管，以防止中间相从干燥和经历相变，这可能会损坏晶体上加1微升新鲜沉淀剂。丸是现在随时可以使用的晶体收获。
5。打开井与海绵相。未成功
海绵相是不够宽容，因为它的流动能力。如果该流的查询结果在海绵中相接触的周边的阱毛细将抽出的中间相，将丢失的结晶。发生这种情况的一个例子是在这个视频剪辑。
- 放大的海绵上的相和正常和正交偏振光之间来回切换，定位在海绵相的晶体。
- 在开放的好成绩，并削减盖玻片，在第3节的准备。在这个过程中，在盖片玻璃裂纹。在这方面所做的尝试ING打开以及沉淀剂的变化的方向的裂纹，并最终它是在与隔板接触。随着沉淀“的海绵相及其晶体，丢失的货物。
在这个特定序列，在显微镜上的偏振片没有完全划线，并晶体明亮的物体，在同一时间可以被看作是该井和其内容保持可见。
6。打开井与海绵相。顺利
- 缩小在海绵阶段和拣选晶体在正常和正交偏振光。
- 分数，剪切和删除一个部分的盖玻片覆盖的良好，在4.1节。不完全交叉的偏振光被用于跟踪的晶体。
- 通过开放的玻璃罩和入井，直到它刚好接触到沉淀剂溶液一块干纸巾介绍。通过毛细作用带走的解决方案小心LY，直到它几乎全部消失了，然后取下的组织。这将导致剩余的沉淀剂和海绵相，与晶体仍然到位，回缩根据盖玻片。
- 分数，剪切和删除与镊子盖玻片的其余部分，如在4.1节。在这种情况下，海绵相分裂;一些保持在阱和一些枝盖玻片。该晶体是在盖玻片上的丸。因为很少有沉淀剂本，海绵相开始经过相变可能是由于干燥。这可以看出，作为环的双折射迁移丸剂朝向中心。立即加入沉淀剂，丸剂，以制止过渡。丸是现在准备收获的晶体使用。
7。收获和低温冷晶体立方相
- 回正常和正交偏振光之间来回定位在公开以及在立方相丸剂晶体。在t可以看出，在正交偏振光的的立方相丸剂与他的视频序列4双折射晶体。
- 使用安装冷冻循环（ 图5），探讨新暴露的中间相对于晶体，捞出，然后令它们的晶体，在低温循环，放入液氮杜瓦后， 立即收获。理想的情况下，收获和冷却单元应该发生在一个连续和快速运动。尽可能少附着中间相应尽可能与晶体收获。在我们的经验中，不需要冷冻保护与细观生长的晶体。
- 因为它是不可能的晶体在低温循环收获后立即检查中间相丸用于收获验证的晶体不再存在，这表明它是收获成功的。
8。采收和低温冷晶体的海绵相
- 回正常和正交偏振光之间来回定位在海绵中的结晶相在公开以及丸剂。在这个视频序列的许多双折射晶体，可以看出，在正交偏振光下的丸剂。
- 使用安装低温回路（ 图5），捞出晶体的海绵相，并令它们，载或上cryoloop，投入液氮杜瓦后， 立即收获。理想的情况下，立方相的收获，低温冷却过程应该立即发生的晶体收获尽可能短的时间内可能经过的实际收获事件和陷入液氮。尽可能少附着海绵相应尽可能与晶体收获。如前所述，不需要冷冻保护与细观生长的晶体。
9。在杜瓦存储晶体
- 使安装循环转换成液态Ni含氮将其放置在一个存储在泡沫杜瓦冰球的保持槽。完成所有的操作循环，磁性棒的顶部和冰球浸没在液氮中。
- 记录的位置和细节的收获和低温冷却结晶中的笔记本电脑和/或计算机上。
- 当冰球在泡沫杜瓦是充满收获的一天填妥之过户成一个搁置冰球冰球在存储或传输杜瓦持有人充满液态氮。晶体可运交通杜瓦瓶收集衍射数据的同步辐射设施。
10。代表性的成果
这里展示的是收获和低温冷却练习的目标转移从托管到冷冻循环的中间相的晶体，玻璃化的环形晶体，并把它储存在液氮的杜瓦。理想的情况是收获和c坂冷却完成在这样一种方式，衍射的晶体质量的过程中被保留。尽可能少的中间相应尽可能与晶体收获。这是为了使定位的晶体和围绕它的X-射线束，少得多有挑战性，加快低温冷却下玻璃化的视图，并尽量减少干扰背景散射衍射数据收集期间，从中间相。低温冷却的样品的晶体能够和不能够被看到的一些例子示于图6。凡晶体不能看到它的眼睛通常是必要的，以便找到的晶体和数据收集27中的光束，使其中心诉诸衍射光栅。
图1的示意图示出的脂质双分子层，并在其上的生物膜芳ë位于的各种蛋白质。
图2，一种完全加载并密封的96孔玻璃夹心结晶板。在各孔中含有50 NL立方相和1μl的沉淀剂溶液。为了清楚起见，立方相已与苏丹红染色和沉淀剂溶液包括亚甲基蓝。从参考文献5。
图3。膜蛋白的晶体生长在脂质中间相。 H.细菌视紫红质晶体的立方相杆菌 。B.海绵相的维生素B12受体/转运，BtuB的含有晶体，从大肠杆菌大肠杆菌 。从参考文献25。立方和海绵阶段有对比APPEA的rances是显而易见的通过比较面板A和B A是极其粘稠的，并保持其原来的形状的立方相。它不流动。这是特别明显的，在边缘处的中间相的大丸剂，具有粗糙的外观。合同，的海绵相是相当少的粘性和不流。因此，海绵相不保留其原来的形状，是典型的边缘平滑。沉淀剂，其中包括聚醚胺，2 -甲基-2,4 -戊二醇丙氧基化物，丁二醇，己二醇，季戊四醇，聚乙二醇400，可能会导致在一个过渡海绵从立方相4,26。
图4。流程图总结了在生产，收获和低温冷观种植的膜蛋白晶体（A）所涉及的步骤。只有那些红色虚线包围的步骤线，和（B）中，详细描述在此JOVE文章覆盖。 A组是从参考文献3。 点击此处查看大图 。
图5。举行的PIN码在地方上的磁力棒安装在一个空的冷冻循环。扩展的意见引脚（A）和微卡口（B）的收获和低温冷却这一重要工具，如图所示。接环B 中的微空循环结束时的直径为30μm。虽然没有广泛测试了其他类型的循环中，我们发现循环显示，MiTeGen面心立方和海绵阶段的工作。
图6。收获和低温冷却的膜蛋白晶体在低温循环与同步辐射光束线在显微镜观察A，B，例如收获的晶体（caa3细胞色素氧化酶34（A），甘油二酯激酶，DgkA （B））的结晶（蓝色箭头）通过低温冷却的中间相上的冷冻回路。C.实施例，其中收获晶体上的冷冻回路中的低温冷却的中间相是不可见的可见。用红色箭头标识的尖端循环。秉承低温冷却的中间相确定了一个蓝色的箭头。
Discussion
在这个视频文章中，我们演示了如何脂质中间相的晶体生长，收获和低温冷却衍射数据收集的准备，最终确定的结构。主机中间相的粘性和粘立方相或更流畅的海绵相4。玻璃夹层板被打开，如何晶体的收获非常依赖于中间相类型。因此重要的是知道这两个1处理的时间提前。托管脂质的身份和所用的沉淀剂在这方面是重要的，和大丸剂中的结晶化的中间相的物理外观，以及可以用来告诉他们分开（ 图3）。在这篇文章中，收获从两者中间相类型进行了说明。
收获小晶体从的脂质中间相在玻璃夹层板是一个艰苦的过程，需要时间，技巧，experience，耐心和稳健的手。重要的是要预留适量的收获，并设立了实验室，使所有的用品和设备在手提前。第二协助收割的人是没有必要的，但建议使用。这个人可以帮助提供预显着的板，做收获的个人以及低温冷却安装到存储冰球收获晶体的循环。助理也发挥了重要的支撑作用在记录观察在收获的晶体衍射数据收集过程中，这可能是至关重要的。在一个助手的情况下，语音激活音频记录装置可以有利地使用的文档。
在这篇文章中描述的协议将有助于启动和运行的浏览器与晶体收获。然而，重要的是要理解，该过程并不简单，，的PRActice之前，需要启动到收获宝贵的膜蛋白晶体。因此，建议先测试板不是特别宝贵的蛋白质晶体进行实验。这将提供了宝贵的经验，在切割玻璃的新手，取出玻璃碎片，抬起玻璃罩从中间相，采用偏光显微镜功能晶体和跟踪他们在收获，最后处理不同类型的介孔从他们和收获。中间相的质地，并且通过扩展的难易程度，晶体可以收获，不随时间变化，在结晶过程中。因此重要的是练习价值较低的晶体，但是与那些已经为更有价值的相同的条件下生长的收获。它可以由消旋或脂质立方相的方法28和晶体生长的溶菌酶和thaumatin应应该考虑这些ERED等效的方式获得的材料和方法的熟悉。人们还应该考虑与无蛋白质的中间相，首先要学会它的变幻莫测。
这里展示的程序都在一个舒适的20°C或左右完成。这是可能的内消旋的方法中，在较低的温度下晶体生长。因此，油酸单甘油酯作为宿主脂质在亚稳相状态，可以使用在4℃下1,2,29,30。一种替代方法是使用合理设计的7.9 MAG低温晶化31。我们通常做低温crysallogenesis的，具有一定的膜蛋白指标。在这种情况下，晶体生长和收获在散步，在4℃冰箱中。在这样的条件下工作，有其自身的挑战，其中最重要的是需要温暖和舒适的服装。
使用大分子晶体结构测定的整体过程中的下一步骤的tallography是收获和管理单元冷却在这篇文章中所表现出的对晶体的衍射数据收集。， 在细观生长的晶体通常小。然而，有用的衍射数据收集有可能与具有最大尺寸为20μm的9的晶体。为了这个目的，使用微束同步辐射X-辐射，是一个单独的JOVE这一系列中的相关文章32,33的焦点。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
有很多谁促成了这一工作，大部分是从卡弗里膜的结构与功能的生物集团，无论是过去和现在的成员。 ，尤其是景泉潭和约瑟夫·利昂，我们致以最热烈的感谢和赞赏。这项工作是支持的，部分资金从科学基金会爱尔兰（07/IN.1/B1836人），美国国立卫生研究院（GM75915，P50GM073210的和U54GM094599），FP7成本和玛丽·居里行动（CM0902和PIEF-GA-2009 -235612）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
| Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
| Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
| Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
| Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
| Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
| Lab notebook | Various | NA | Tool |
| Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
| Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
| Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
| Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
| Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
| Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
| Purified water | Millipore | Reagent | |
| Safety goggles | Various | NA | Tool |
| Sample Pin Bases - Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
| Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
| Tissues | NA | NA | Disposable |
| Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |
References
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