Summary
Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l'uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.
Abstract
Un percorso importante per capire come le proteine funzionano ad un livello meccanicistico è quello di avere la struttura della proteina bersaglio disponibile, idealmente a risoluzione atomica. Attualmente, vi è solo un modo per acquisire informazioni come applicato alle proteine integrali di membrana (Figura 1), ed i complessi che formano, e questo metodo è macromolecolare cristallografia a raggi X (MX). Per fare MX cristalli qualità di diffrazione sono necessari che, nel caso delle proteine di membrana, non formano facilmente. Un metodo per cristallizzare proteine di membrana che prevede l'utilizzo di mesofasi lipidiche, in particolare le fasi cubi e spugna 1-5, ha guadagnato una notevole attenzione a causa del ritardo per i successi che ha avuto nella proteina-recettore accoppiato campo G 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Tuttavia, il metodo, d'ora in poi denominato in meso o lipidica metodo fase cubica, viene fornito con il proprio tecnicosfide. Questi derivano, in parte, a causa della natura generalmente viscoso e appiccicoso della mesofase lipidico in cui i cristalli, che sono spesso microcristalli, crescono. Manipolando cristalli diventa difficile a causa e in modo particolare durante la raccolta 22,23. Sorgono problemi anche nella fase che precede la raccolta che richiede che le lastre di vetro sandwich in cui i cristalli crescono (Figura 2) 24,25 sono aperte per esporre il bolo mesofase, ed i cristalli in esso, per la raccolta, crio-raffreddamento e X eventuali diffrazione raccolta dati.
Le varianti mesofase cubi e spugna (Figura 3), da cui cristalli devono essere raccolti hanno reologie profondamente diversi 4,26. La fase cubica è viscoso e appiccicoso simile a un dentifricio spessore. Per contro, la fase spugna è più fluido con una spiccata tendenza a flusso. Di conseguenza, i diversi approcci per l'apertura di pozzi cristallizzazione containing cristalli crescono nel cubo e la fase spugna sono chiamati a effetti diversi metodi sono necessari per la raccolta di cristalli dai due tipi mesofase. Protocolli per fare proprio che sono state perfezionate e attuate nella membrana Biologia Strutturale e Funzionale (MS & FB) del Gruppo, e sono descritte in dettaglio in questo articolo JoVE (Figura 4). Alcuni esempi sono riportati di situazioni in cui i cristalli sono raccolti con successo e crio-raffreddato. Forniamo anche esempi di casi in cui sorgono problemi che portano alla perdita irrimediabile di cristalli e descrivere come questi problemi possono essere evitati. In questo articolo il Viewer è dotato di passo-passo le istruzioni per l'apertura di pozzi di cristallizzazione a sandwich di vetro, per la raccolta e per la crio-raffreddamento cristalli di proteine di membrana che crescono in cubi e nelle fasi spugna.
Protocol
1. Laboratorio Set-up pre-raccolta
- In preparazione per la raccolta, compila il asciutta schiuma Dewar con azoto liquido e posizionarlo accanto al microscopio in cui la raccolta è quello di prendere posto.
- Immergere il disco di memoria, aprire finiscono, in azoto liquido all'interno del Dewar schiuma e lasciarlo raffreddare completamente.
- Garantire un micro-montaggio di una dimensione che corrisponde il cristallo per essere raccolto su un magnete (Figura 5). È importante avere a disposizione un numero di ricambio rilevatori magnetici precaricato con micro-supporti per le situazioni in cui è necessario raccogliere cristalli diversi dai uno bolo. Bacchette di ricambio dovrebbero essere disponibili in qualsiasi momento.
- Posizionare una micropipetta, suggerimenti e la soluzione precipitante che è stato utilizzato per la crescita di cristalli vicino al microscopio raccolta. Può essere necessario per coprire la mesofase e l'essiccamento quando il bene viene aperto.
- Hanno un quaderno e penna sul banco vicino e / oil computer aperto. Questi saranno utilizzati per registrare le osservazioni riguardanti la aspetto, la qualità, la posizione, il numero della disco, ecc, di cristalli in cui sono raccolte, crio-raffreddato e messo in deposito.
- Se un assistente è disponibile per aiutare con la raccolta che la persona deve capire chiaramente il protocollo che sarà seguito, l'ordine in cui le varie fasi si svolgeranno, e il loro ruolo nel processo globale.
Con tutti i materiali e delle attrezzature in atto il nostro compito successivo è quello di:
2. Identificare Piatti e Wells che contengono cristalli
- Il metodo più semplice e diretto per la ricerca di cristalli raccoglibile è di ispezionare pozzi a mano utilizzando un microscopio con normale e con luce polarizzata incrociata. Regolazione dell'intensità luminosa della luce del microscopio può aiutare con localizzazione cristalli.
- In alternativa, un riproduttore di immagini in cui vengono proiettati automaticamente con piastre normale e attraversato polarizzared luce, può essere usato per cercare cristalli.
- Valutare a occhio registrate immagini digitali su un monitor di computer.
- Contrassegnare chiaramente quei pozzi con i cristalli per i commenti di raccolta e registrazione sulla qualità dimensione e la posizione dei cristalli nel mesofase all'interno del notebook o su un computer.
- Rimuovere la piastra che contiene cristalli per la raccolta dal sensore CCD.
3. L'apertura di un bene con mesofase cubica. Metodo 1
Le piastre in cui i cristalli crescono dal metodo in meso sono lastre a sandwich di vetro (Figura 2). Per accedere mesofase ei cristalli in esso, è necessario aprire il pozzo. Questo viene fatto utilizzando un utensile di taglio per tagliare il vetro coverglass superiore che sigilla il pozzo, che può poi essere rimosso.
Esistono diversi approcci per il taglio e la rimozione del coverglass da cristallizzazione in un pozzo. Quella da utilizzare è dettata dal tipo of mesofase in cui il cristallo è trovato crescere. Questa può essere la fase molto viscoso e appiccicoso cubica (Figura 3A) o la sua variante più fluido, la fase spugna (Figura 3B). In questo articolo vi mostriamo il video come aprire pozzi e per raccogliere i cristalli da entrambi questi materiali di hosting.
- Mettere il panino lastra di vetro cristallizzazione sul palcoscenico di un microscopio ottico.
- Utilizzando un punteggio di taglio di vetro lo strumento coverglass leggermente con due cerchi concentrici situati sopra il distanziale e appena fuori il perimetro del pozzo. Con un utensile di taglio nuovo, punteggio richiede minima pressione applicata. Sostituire l'utensile con una nuova quando la pressione necessaria per punteggio aumenta anche frazionata, questo si verifica in genere dopo l'apertura di 10 pozzi.
- Rompere il vetro nello spazio tra i due cerchi ottenuto al fine di rilasciare il coprioggetto interna. Questo genera un sacco di frammenti di vetro e polvere. Cancellare via con un panno umidotovagliolo di carta.
- Rimuovere il coprioggetto liberata da presa con una pinzetta a punta sottili e inclinando lontano da dentro e fuori dal pozzo. In questo caso, la fase cubica rimane bloccato in posizione e sulla piastra di base del pozzo.
- Lo zoom per avere una visione più chiara del mesofase cubica che ora è pronto per l'uso nella raccolta cristallo.
4. L'apertura di un Bene con mesofase Cubic. Metodo 2
- Utilizzando il piano di taglio dell'utensile punteggio rette parallele nella coverglass ad un lato del bene e che si estendono nello stesso pozzo. Ciò consente un più facile accesso alle pinzette e rimozione del coprioggetto.
In questa dimostrazione particolare, il coprioggetto crepe a liberare il coprioggetto dalla superficie adesiva distanziale. Nel processo, il coverglass sposta in posizione e il precipitante separa dalla fase cubica. Quando il coverglass viene sollevato alcune del precipitante va con esso. Si sono lasciati con un b espostoOlus di mesofase senza precipitante circostante. Immediatamente, aggiungere 1 precipitante microlitri fresca sopra il bolo con una micropipetta per evitare mesofase si secchi e subendo un cambiamento di fase che può danneggiare i cristalli. Il bolo è pronto per essere utilizzato in cristallo raccolta.
5. L'apertura di un bene con la fase spugna. Senza successo
La fase di spugna è meno tollerante a lavorare a causa della sua capacità di flusso. Se che i risultati di flusso nella fase spugna contattando il perimetro della capillarità ben sguainerò mesofase ei cristalli verranno perse. Un esempio di questo si verifichi è mostrato in questo video.
- Zoom sulla fase spugna e passare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare i cristalli in fase di spugna.
- In preparazione per l'apertura del punteggio bene e tagliare il coprioggetto come descritto nella Sezione 3. Nel processo, il coprioggetto crepe. Nel tentativo dizione per aprire la ben precipitanti gli spostamenti in direzione della fessura e alla fine entra in contatto con il distanziatore. Con il precipitante va una parte della fase spugna e il suo carico di cristalli che sono persi.
In questa particolare sequenza, i polarizzatori sul microscopio non sono completamente attraversato ed i cristalli possono essere visti come oggetti luminosi al tempo stesso che il bene e suoi contenuti rimangono visibili.
6. L'apertura di un bene con la fase spugna. Con successo
- Zoom sulla fase spugna e individuare un cristallo, sia in condizioni normali e incrociati luce polarizzata.
- Punteggio, tagliare e rimuovere una sezione del coprioggetti che copre il bene, come al punto 4.1. Incompleto attraversato luce polarizzata viene utilizzato per tenere traccia del cristallo.
- Introdurre un pezzo di carta velina secco attraverso l'apertura nel coprioggetto e nel pozzo fino a sfiorare la soluzione precipitante. Wick via la soluzione attentamente fino a quando non è quasi tutto andato e quindi rimuovere il tessuto. Questo fa sì che il precipitante rimanente e la fase spugna, con il cristallo ancora al suo posto, per ritrarre sotto il coprioggetto.
- Punteggio, tagliare e rimuovere con una pinzetta il resto del coprioggetto, come al punto 4.1. In questo caso, la fase di spugna divide, alcuni rimane nel pozzo e alcuni bastoni al coprioggetto. Il cristallo è nel bolo sul coprioggetto. Perché c'è molto poco presente precipitante, la fase di spugna inizia a subire una transizione di fase probabilmente a causa di essiccazione. Questo può essere visto come un anello di birifrangenza che migra verso il centro del bolo. Immediatamente aggiungere precipitante al bolo per fermare la transizione. Il bolo è ora pronto per l'uso in cristallo raccolta.
7. Raccolta e Cryo-Cristalli di raffreddamento dalla fase cubica
- Andare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare cristalli nel bolo fase cubica nel pozzo aperto. In tla sequenza video fino a quattro cristalli birifrangenti può essere visto in bolo fase cubica incrociato con luce polarizzata.
- Utilizzare un montato crio-loop (Figura 5) per sondare mesofase appena esposto per cristalli, per ripescare cristalli e poi immergeteli, contenuta nella crio-loop, in azoto liquido nella Dewar immediatamente dopo la raccolta. Idealmente, la raccolta e lo snap-raffreddamento dovrebbe avvenire in un unico movimento continuo e rapido. Come mesofase poco aderente possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Nella nostra esperienza, crio-protettivo non è necessaria con in meso-cresciuti cristalli.
- Poiché non è possibile cercare il cristallo in crio-loop immediatamente dopo la raccolta ispezionare il bolo mesofase utilizzato per la raccolta di verificare che il cristallo non c'è più suggerendo che è stato raccolto con successo.
8. Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento dalla fase spugna
- Andare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare cristalli nel bolo spugna fase nel pozzo aperto. In questa sequenza video molti cristalli birifrangenti può essere visto nel bolo incrociate sotto luce polarizzata.
- Utilizzare un montato crio-loop (Figura 5) per ripescare cristalli dalla fase spugna e immergetele, contenuta nel o sul cryoloop, in azoto liquido nella Dewar immediatamente dopo la raccolta. Come per la raccolta dalla fase cubica, idealmente, la crio-raffreddamento di processo dovrebbe avvenire subito il cristallo viene raccolto con il minor tempo possibile, che intercorre tra l'evento di raccolta reale e immergersi in azoto liquido. In fase di spugna poco aderente possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Come già detto, crio-protettivo non è necessaria con in meso-cristalli coltivati.
9. Memorizzazione di cristalli in Dewars
- Dopo aver immerso il montato in loop in ni liquidotrogen porlo in uno degli slot di tenuta del disco di memorizzazione nella Dewar schiuma. Tutte le manipolazioni sono fatte con il ciclo, la parte superiore della bacchetta magnetica e il disco immerso in azoto liquido.
- Registrare la posizione e dettagli del raccolto e crio-raffreddato cristallo nel notebook e / o sul computer.
- Quando il disco nel Dewar schiuma è pieno o la raccolta per il giorno è completato il trasferimento del disco in un supporto puck archiviato in una memoria o un trasporto Dewar contenente azoto liquido. I cristalli possono essere spediti in Dewars trasporto verso l'impianto di sincrotrone per la raccolta dei dati di diffrazione.
10. Risultati rappresentativi
Gli obiettivi delle attività di raccolta e di crio-raffreddamento dimostrato qui ci sono di trasferire un cristallo dal mesofase ospita in crio-loop, per vetrificare il cristallo in loop e di collocarlo in conservazione in azoto liquido in un Dewar. La situazione ideale è dove la raccolta e la cryo-raffreddamento è fatto in modo tale che la qualità diffrazione del cristallo è conservato nel processo. Come mesofase meno possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Questo per rendere la localizzazione del cristallo e centrandola nel fascio di raggi X molto meno impegnativo, per velocizzare crio-raffreddamento al fine di vetrificazione, e di minimizzare interferire dispersione di fondo della mesofase durante la raccolta dei dati di diffrazione. Alcuni esempi di crio-raffreddati campioni in cui il cristallo può e non può essere visto sono mostrati in Figura 6. In cui il cristallo non può essere visto da occhio di solito è necessario ricorrere a rastering diffrazione per trovare il cristallo e per centrarlo nella trave di raccolta dati 27.
Figura 1. Rappresentazione schematica di una membrana biologica che mostra il doppio strato lipidico e su cui are trova una varietà di proteine.
Figura 2. A pieno carico e sigillato a 96 pozzetti a piastra di vetro cristallizzazione. Ogni pozzetto contiene 50 fase cubica nl e 1 ul di soluzione precipitante. Per chiarezza, la fase cubica è stato macchiato con il Sudan rosso e la soluzione precipitante include blu di metilene. Da riferimento 5.
Figura 3. Cristalli di proteine di membrana che crescono nel mesofase lipidico. A. La fase cubica con un cristallo di batteriorodopsina da H. halobium. B. La fase di spugna che contiene un cristallo del BtuB vitamina B12 recettore / trasportatore, da E. coli. Da riferimento 25. Le fasi cubi e la spugna sono contrastanti appearances come è evidente dal confronto pannelli A e B. La fase cubica in A è molto viscoso e mantiene la sua forma originale. Esso non scorre. Questo è particolarmente evidente ai bordi del bolo mesofase che hanno un aspetto irruvidita. Per contratto, la fase di spugna è molto meno viscoso e non scorre. Così, la fase di spugna riesce a mantenere la sua forma originale ed i suoi bordi sono caratteristicamente liscia. Precipitanti che includono jeffammine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiolo, pentaeritritolo propossilato, butandiolo, esandiolo e può risultare in una transizione dalla fase cubica a spugna 4,26.
Figura 4. L'organigramma riassume i passaggi necessari per la raccolta di produzione, e la crio-raffreddamento in cristalli membrana meso-coltivate proteina (A). Solo i passi immersi nel rosso tratteggiatolinea, e descritto in dettaglio in (B), sono trattati in questo articolo JoVE. Pannello A è da riferimento 3. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Un vuoto crio-loop montato su un perno che è tenuto in posizione su un magnete. Viste estese del perno (A) e micro-mount (B) di questo importante strumento per la raccolta e crio-raffreddamento vengono visualizzati. Il loop vuota alla fine del montaggio in micro-B è di 30 micron di diametro. Pur non avendo provato altri tipi di loop ampiamente, troviamo che il MiTeGen loop opera presentata bene con entrambe le fasi cubiche e spugna.
Cristalli di Figura 6. Raccolti e crio-raffreddato di proteine di membrana in crio-loop come si vede con un filtro in linea microscopio su una linea di luce di sincrotrone. A, B. Esempi di cristalli raccolte (citocromo ossidasi Caa3 34 (A), diacilglicerolo chinasi, DgkA (B)), dove i cristalli (freccia blu) sono visibili attraverso la crio-mesofase raffreddato su un crio-loop. C. Esempio di dove il cristallo raccolto non è visibile in crio-mesofase raffreddato su un crio-loop. La punta del ciclo viene identificato con una freccia rossa. L'adesione crio-raffreddato mesofase è identificato con una freccia blu.
Discussion
In questo articolo il video abbiamo dimostrato come i cristalli coltivati in un mesofase lipidico sono stati raccolti e crio-raffreddata in preparazione per l'uso nella raccolta dei dati di diffrazione e, infine, per la determinazione della struttura. Mesofase hosting può essere la fase viscoso e appiccicoso cubica o la fase spugna più fluido 4. Come le lastre di vetro a sandwich sono aperte e come i cristalli sono raccolti molto dipende dal tipo di mesofase. E 'importante quindi sapere quale dei due è quello che fare con anticipo. L'identità del lipide hosting e il precipitante utilizzati sono importanti in questo senso, e l'aspetto fisico del bolo mesofase nella cristallizzazione bene può essere usato per distinguerli (Figura 3). Raccolta da entrambi i tipi mesofase è stato illustrato in questo articolo.
Raccolta piccoli cristalli da un mesofase lipidica in superfici di vetro di vetro è un faticoso processo che richiede tempo, abilità, compeience, pazienza e una mano ferma. E 'importante mettere da parte una quantità di tempo adeguato per la raccolta e per impostare il laboratorio in modo che tutte le forniture e le attrezzature sono a portata di mano in anticipo. Una seconda persona con raccolta non è essenziale, ma è consigliabile. Quella persona può aiutare con la fornitura di pre-marcate le piastre per l'individuo a fare la raccolta e l'immissione anelli montati crio-raffreddati con cristalli raccolti nel disco di archiviazione. L'assistente può anche svolgere un ruolo importante di supporto nel documentare osservazioni sui cristalli effettuate durante la raccolta che potrebbe rivelarsi cruciale durante la raccolta dei dati di diffrazione. In assenza di un assistente, un comando vocale audio-dispositivo di registrazione può essere vantaggiosamente utilizzato per la documentazione.
Dopo il protocollo descritto in questo articolo vi aiuterà a ottenere il visualizzatore installato e funzionante con la raccolta di cristallo. Tuttavia, è importante sottolineare che il processo non è semplice e che practice è necessario prima di lanciarsi nella raccolta preziosi cristalli di proteine di membrana. Si raccomanda pertanto che le targhe di prova con cristalli di proteine che non rappresentano un particolare valore essere sperimentato prima. Ciò fornirà il neofita preziosa esperienza nel taglio del vetro, rimuovendo frammenti di vetro, sollevando il coprioggetto da oltre mesofase, utilizzando la funzione polarizzante sul microscopio per vedere cristalli e di rintracciarli durante la raccolta, movimentazione e infine i diversi tipi di mesofasi e la raccolta da loro. La trama del mesofase, e per estensione la facilità con cui i cristalli possono essere raccolti, cambia con il tempo durante la cristallizzazione. E 'importante quindi di praticare la raccolta con cristalli di minor valore, ma con quelli che sono cresciuti nelle stesse condizioni come quelle di maggior valore. È possibile far crescere cristalli di lisozima e taumatina dal meso o in lipidica metodo fase cubica 28 e questi dovrebbero essere consideEred a titolo di guadagnare familiarità con i materiali e il metodo. Si dovrebbe anche prendere in considerazione di lavoro con privo di proteine mesofase primo a conoscere dei suoi capricci.
Le procedure hanno dimostrato qui erano tutti fatto in un confortevole 20 ° C o giù di lì. È possibile far crescere cristalli dal metodo in meso a temperature inferiori. Così, monoolein come lipidi hosting in uno stato di fase metastabile può essere utilizzato a 4 ° C 1,2,29,30. Un'alternativa è quella di utilizzare il razionalmente 7,9 MAG per cristallizzazione a bassa temperatura 31. Facciamo crysallogenesis bassa temperatura di routine con gli obiettivi di alcune proteine di membrana. In questo caso, la crescita dei cristalli e la raccolta è fatta in un walk-in frigorifero a 4 ° C. Lavorare in queste condizioni ha le sue sfide non ultimo dei quali è la necessità di un abbigliamento caldo e confortevole.
Il passo successivo nel processo generale di determinazione della struttura con cristalli macromolecolaritallography è quello di raccogliere dati di diffrazione su cristalli raccolti e snap-raffreddato, come illustrato in questo articolo. Nel meso-grown cristalli sono solitamente di piccole dimensioni. Tuttavia, utile raccolta dati di diffrazione è stato possibile con cristalli aventi una dimensione massima di 20 micron 9. A questo scopo, micro-beam X-radiazione di sincrotrone viene utilizzata ed è al centro di un articolo separato JoVE in questa serie 32,33.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti, e soprattutto per Jingquan Tan e Joseph Lyons, estendiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e il 7PQ COST e azioni Marie Curie (CM0902 e Pief-GA-2009 -235.612).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
| Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
| Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
| Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
| Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
| Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
| Lab notebook | Various | NA | Tool |
| Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
| Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
| Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
| Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
| Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
| Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
| Purified water | Millipore | Reagent | |
| Safety goggles | Various | NA | Tool |
| Sample Pin Bases - Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
| Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
| Tissues | NA | NA | Disposable |
| Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |
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