Summary
本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質立方相とスポンジで栽培収穫とクライオクールな膜タンパク質の結晶に構造·機能研究グループCaffrey膜で実装されたプロシージャが記述されている。
Abstract
タンパク質は機械論的レベルでどのように機能するかを理解するための重要なルートでは、理想的には、原子レベルの分解能で、利用可能な標的タンパク質の構造を持つことである。現在、そこに内在性膜タンパク質（ 図1）、それらが形成する複合体に適用されるような情報をキャプチャするための唯一の方法であり、その方法は、高分子のX線結晶構造解析（MX）です。行うためにMX回折品質結晶は、膜タンパク質の場合には、容易に形成しないような、必要とされている。脂質メソフェーズ、特に立方とスポンジのフェーズ1-5の使用を含む膜タンパク質を結晶化させるための方法は、（それは、Gタンパク質共役型受容体のフィールド6-21できた成功に遅れにより、かなりの注目を集めているWWW 。mpdb.tcd.ie ）。しかし、今後メソ又は脂質立方相メソッドでと呼ばれる方法は、独自の技術が付属しています課題。これらは、しばしば微細結晶である結晶は、成長する脂質メソフェーズの一般に粘性と粘着性の性質のために、部分的に発生する。結晶を操作すると、22,23の収穫時に結果として難しいと特にそうなります。問題は24,25を 、収穫のために、その中に極低温冷却と最終的なXをメソフェーズボーラスを公開するために開設し、結晶されています（ 図2）の結晶が成長するガラスサンドイッチプレートのことを要求しており、収穫に先行段階であまりにも生じる線回折データを収集します。
結晶が収穫されている必要があり、そこから立方晶とスポンジメソフェーズ変異体（ 図3）は大いに異なるレオロジー4,26を持っています。立方相は、粘性と太い歯磨き粉に付箋似ています。これとは対照的に、スポンジ相は流れに明確な傾向がより流動的です。開口部結晶化のための井戸containiしたがって、異なるアプローチキュービックとスポンジの段階で成長ngの結晶は確かに別の方法が2メソフェーズタイプから結晶を収穫に必要であるように求められています。洗練され、実装メンブレン構造·機能生物学（MS＆FB）のグループで、このJoveの記事（ 図4）に詳細に記載されているされているだけで行うためのプロトコル。例としては、結晶が正常に収穫し、低温に冷却されている状況を説明しています。我々はまた、問題は結晶の取り返しのつかない損失にそのリードを生じる例の例を提供し、これらの問題を回避することができる方法を説明します。この記事ではビューアをガラスサンドイッチ結晶井戸を開くため、収穫のため、立方とスポンジの段階で成長している膜タンパク質の結晶クライオ冷却するためのステップバイステップの手順が設けられている。
Protocol
1。ラボセットアッププリ収穫
- 収穫の準備のために、液体窒素を用いて乾燥した泡デュワーを記入し、収穫が行われるかを顕微鏡の横に置きます。
- 水没ストレージパックは、泡デュワー内の液体窒素中で、一方の端を開くと、それは完全にクールなことができます。
- 磁気ワンド（ 図5）で収穫される結晶にマッチするサイズのマイクロマウントを固定します。一方でそれは1ボーラスからいくつかの結晶を収穫する必要がある状況に対応するために、マイクロマウントがプリロードスペア磁気ワンドの数を持つことが重要です。スペアワンドは常時利用可能であるべきです。
- マイクロピペット、ヒントや収穫顕微鏡の横に結晶成長のために使用された沈殿剤溶液を配置します。それは、メソフェーズをカバーするために、十分が開かれたときに乾燥を防ぐために必要な場合があります。
- ベンチでノートとペンが近く、及び/又はしているコンピュータが開く。これらは、彼らがクライオ冷却、収穫し、ストレージに配置されているような結晶の品質、外観、位置、ストレージパック番号などを、に関する観測を記録するために使用されます。
- アシスタントは、人が明らかに続きますプロトコル、様々なステップが行われる順序、およびプロセス全体における自らの役割を理解しておく必要がある収穫を助けるために利用可能である場合。
所定の位置に資機材のすべての私達の次の作業は、次のとおりです。
2。結晶を含有するプレートとウェルズを識別
- 収穫可能な結晶を見つけるための最も簡単で最も直接的な方法は、通常とと交差偏光の顕微鏡を使って手で井戸を検査することです。顕微鏡照明光の強度を調整することで、結晶を見つけるお手伝いをします。
- 代わりに、プレートをノーマルで自動的にスクリーニングし、分極交差しているイメージャD光は、結晶を探すために使用することができます。
- 目で評価してパソコンのモニターにデジタル画像を記録した。
- はっきりとノートまたはコンピュータで、メソフェーズ中の結晶の品質や位置、大きさで収穫し、レコードコメントのための結晶とそれらの井戸をマーク。
- イメージャから収穫の結晶を含むプレートを取り外します。
3。立方メソとよくを開く。方法1
結晶はメソ法での成長したプレートはガラスサンドイッチプレート（ 図2）です。メソフェーズおよびその中の結晶をアクセスするためには、井戸を開く必要があります。これはよくシールはその後削除されることができる上部のカバーガラスをカットするガラスの切削工具を使用して行われます。
よく結晶の上からカバーガラスをカットしたり削除したりするためのいくつかのアプローチがあります。使用するものは、O型によって決定される結晶が成長したものが含まれているfはメソフェーズ。これは非常に粘性とスティッキーキュービック相（ 図3A）またはその以上の流体バリアント、スポンジ相（ 図3B）にすることができます。このビデオの記事では、我々は井戸を開くために、これらのホスティング材料の両方から結晶を採取する方法を示しています。
- 光顕微鏡のステージ上のガラスサンドイッチ結晶化プレートを置きます。
- カバーガラスは、スペーサーの上に位置する2つの同心円で、ちょうど井戸の境界の外側に軽くガラス切削工具のスコアを使用しています。新しい切削工具を使用すると、スコアは最小限の印加圧力を必要とします。スコアに必要な圧力があってもほんの少し増加させる新しい工具と交換するが、これは一般的に10ウェルを開いた後に発生します。
- 内側のカバーガラスを解放するために、2つ獲得したサークルとの間の空間にガラスを破る。これは、ガラスの破片や埃がたくさん生成されます。湿らせたそれらを片付けるペーパータオル。
- 細い先端がピンセットでそれを掴んで、井戸から、オフすぐに傾けることによって解放されたカバーガラスを外します。このケースでは、立方晶相は立ち往生のままで、井戸のベースプレート上に代わるものであること。
- 今結晶収穫で使用するための準備ができている立方メソ相の明確なビューを取得するにはズームイン。
4。キュービックメソとよくを開く。方法2
- カバーガラスで平行な直線は井戸の片側にガラス切削工具スコアを使用して、それがうまく自体全体に拡張できます。これは簡単ピンセットへのアクセスとカバーガラスを除去することができる。
この特定のデモでは、カバーガラスは、スティッキースペーサ表面からカバーガラスを解放に亀裂。プロセスでは、カバーガラスの位置にシフトし、沈殿剤は、立方晶相から分離する。カバーグラスを持ち上げたとき沈殿剤のいくつかはそれになる。我々は、露出したbに残っている任意の周囲の沈殿せずメソフェーズのolus。すぐに、乾燥し、結晶を破損する恐れがあり、相変化を受けてからメソフェーズを防ぐためにマイクロピペットを用いてボーラスの上に1μlの新鮮沈殿剤を追加します。ボーラスは現在、結晶収穫で使用する準備ができました。
5。スポンジ相とよくを開く。失敗して
スポンジ·フェーズがあるため流れにその能力で動作するように寛容である。うまく毛細管現象の周囲に接触スポンジ相でのその流れの結果、中間相を引き出すなり、結晶が失われます。この出来事の例は、このビデオクリップに示されている。
- スポンジ相上でズームとスポンジ相で結晶を見つけるために、通常と交差偏光を切り替える。
- よくスコアを開くための準備では、セクション3で説明されているようにカバーガラスをカット。プロセスでは、カバーガラスのひび割れ。の試みで、よく亀裂の方向にシフト沈殿剤を開くためにING、最終的には、スペーサーに接触する。沈殿剤で失われるスポンジ相と結晶のその貨物の一部を行く。
この特定のシーケンスでは、顕微鏡に偏光板が完全に逆になっていないと結晶がよく、その内容が表示されたままになるのと同時に、明るいオブジェクトとして見ることができます。
6。スポンジ相とよくを開く。首尾よく
- スポンジ相上でズームと正常および交差偏光の結晶を識別します。
- スコアは、4.1節のように、うまくカバーするカバーガラスの部分をカットして取り外します。不完全交差偏光された光は水晶を追跡するために使用されます。
- それだけで沈殿剤溶液に接触するまで、カバーガラスの開口部を通って、十分に乾いたティッシュペーパーをご紹介します。慎重なソリューションを逃がすLYそれがほとんど全て消えて、その後組織を除去されるまで。これは、カバーガラスの下に撤回する、所定の位置にまだ結晶で、残りの沈殿剤とスポンジ相を引き起こします。
- スコアは、4.1節に示すように、カバーガラスの残りの部分をカットし、ピンセットで取り除く。このケースでは、スポンジ·フェーズは分割、一部はカバーガラスによく、いくつかの棒に残っています。結晶はカバーガラス上にボーラスになっています。ほんの少し沈殿剤存在があるので、スポンジ相は乾燥に起因する可能性相転移を受けることを開始します。これは、ボーラスの中心に向かって移動し、複屈折のリングとして見ることができます。ただちに移行を停止するボーラスに沈殿剤を追加します。ボーラスは現在、結晶の収穫に使用するための準備ができています。
7。立方晶相から収穫やクライオ冷却結晶
- オープンウェル中の立方相ボーラスの結晶を見つけるために、通常と交差偏光の間を行き来する。トンで最大4つの複屈折結晶への彼のビデオシーケンスは、交差偏光を持つ立方晶ボーラスで見ることができます。
- 収穫直後にデュワー内の液体窒素に、クライオループに含まれる、結晶のたてさらさ中間相を調べるために結晶を釣るため、それらを突き刺すように取り付けクライオループ（ 図5）を使用します。理想的には、収穫やスナップ冷却が1継続的かつ迅速な動きで起こるはずです。できるだけ少ない付着メソフェーズは、水晶を用いて回収する必要があります。我々の経験では、低温保護剤は、 メソ -成長結晶中では必要ありません。
- それはすぐに液晶が正常に収穫されたことを示唆して存在しなくなっていることを確認するために、収穫のために使用されるメソフェーズボーラスを検査収穫後クライオループ内で結晶を探す事が可能ではないので。
8。スポンジ相からの収穫とクライオ冷却結晶
- オープンウェル中のスポンジ相ボーラスの結晶を見つけるために、通常と交差偏光の間を行き来する。このビデオシーケンスでは、多くの複屈折結晶が交差偏光下でボーラスで見ることができます。
- 収穫直後にデュワー内の液体窒素に、cryoloopまたはセキュリティサーバ上に含まれている、スポンジ相から結晶を釣るため、それらを突き刺すように取り付けクライオループ（ 図5）を使用します。立方晶相から収穫と同様に、理想的には、極低温冷却プロセスは結晶が実際の収穫イベント間の経過と液体窒素に急落できるだけ少ない時間で収穫された直後に起こるはずです。できるだけ少ない付着スポンジ相が結晶を用いて回収する必要があります。前述のように、クライオ保護剤は、 メソ成長結晶中では必要ありません。
9。デュアーにクリスタルを格納
- 液体NIに取り付けられたループを沈めたtrogenは泡デュワー内のストレージ·パックの保持スロットのいずれかに配置します。すべての操作は、ループ、磁気ワンドの上部と液体窒素の中に沈めパックを使用して行われます。
- ノートブックおよび/またはコンピュータ上で収穫し、クライオ冷却結晶の場所と詳細情報を記録する。
- 泡デュワー内のパックは、完全または日の収穫のときに液体窒素を充填した保管や輸送デュワーで棚上げパックホルダーにパックを転送完了しました。結晶は回折データ収集のための放射光施設への輸送デュアーに出荷することができます。
10。代表的な結果
ここで示した収穫とクライオ冷却演習の目的は、ループ状の結晶をガラス化し、デュワーの液体窒素中で保管してくださいするには、クライオループにホスティング中間相から結晶を転送することです。収穫とcどこに理想的な状況であるたryo-冷却は結晶の回折品質は工程で保持されるような方法で行われます。できるだけ少ないメソフェーズは、水晶を用いて回収する必要があります。これは、結晶を配置し、ガラス化を視野にクライオ冷却を高速化するために、回折データ収集中メソフェーズから背景散乱を妨げにならないように、X線ビームは、そのはるかに少ない挑戦でそれを中心にすることである。結晶は見ることができないことができ、クライオ冷却サンプルのいくつかの例を図6に示します。結晶が肉眼で見ることができない場合、それはデータ収集のための27のビームで結晶を見つけて、中央揃えにするために、回折ラスタに頼ることが通常必要である。
図1に、その上に脂質二重層を示す生体膜の模式図AReは、種々のタンパク質に位置。
図2：完全にロードされ、密封された96ウェルガラスサンドイッチ結晶化プレート。各ウェルには、50 nlの立方相及び1μlの沈殿剤溶液を含んでいます。明確にするために、立方晶相はスーダンレッドで染色し、沈殿剤溶液は、メチレンブルーが含まれています。資料5から。
図3：脂質メソフェーズで成長した膜タンパク質の結晶。 Hからバクテリオロドプシンの結晶とキュービック相Eからhalobium。B.ビタミンB12受容体/トランスポーター、BtuBの結晶を含むスポンジ相、 大腸菌 。リファレンス25から。キュービックとスポンジ相はappeaを対比しているパネルAおよびBにおける立方晶相を比較することによって明らかなようにrancesは非常に粘性があると、元の形状を保持します。それは流れない。これは、粗面化された外観を持つメソボーラスの端で特に明らかである。契約により、スポンジフェーズはかなり低い粘性であり、流れない。このように、スポンジ相は元の形状を保持するために失敗し、そのエッジは特徴スムーズです。ジェファーミンを含む沈殿、PEG 400、2 -メチル-2,4 -ペンタンジオール、プロポキシブタンジオール、ヘキサンジオールペンタエリスリトールは、立方晶からスポンジフェーズ4,26への移行が発生することがあります。
図4は、フローチャートはメソ成長膜タンパク質結晶中の生産、収穫やクライオ冷却（）に必要な手順をまとめたものです。赤い点線で囲まれただけで、それらのステップ行、および（B）に詳細に説明したように、このJoveの記事でカバーされています。パネルには、参考資料3からのものです。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5は、空のクライオループは、磁気ワンド上の所定の位置に保持されているピンに取り付けられている。ピン（）収穫やクライオ冷却のためのこの重要なツールのマイクロマウント（B）の拡張された部分が表示されます。 Bのマイクロマウントの終わりの空のループの直径は30μmである。広く他のループの種類をテストしていませんしたが、我々は立方晶とスポンジ相の両方でうまく動作示さMiTeGenがループすることがわかります。
クライオループとして放射光ビームラインのインライン顕微鏡で見る。、Bの膜タンパク質の図6収穫し、クライオ冷却結晶。収穫結晶の例（caa3シトクロムオキシダーゼ34（a）、ジアシルグリセロールキナーゼ、DgkA （B））の結晶（青矢印）が収穫結晶がクライオループ上クライオ冷却メソフェーズに表示されていない場所のクライオループ℃の例の極低温冷却メソフェーズを通して見える場所。ループの先端が赤い矢印で識別されます。付着クライオ冷却メソフェーズは青い矢印で識別されます。
Discussion
このビデオの記事では、脂質メソフェーズに成長した結晶を採集し、回折データ収集で使用するための準備のために、最終的に構造決定のための極低温に冷却される方法を紹介しました。ホスティングメソフェーズは粘性及び粘着性の立方相以上の流体スポンジフェーズ4になることができます。ガラスサンドイッチプレートが開かれている方法と結晶は非常に収穫される方法と、メソフェーズタイプによって異なります。それは前もって扱っている2つのかを知ることが重要である。ホスティング脂質の身元と使用沈殿剤はこの点で重要であり、結晶化メソフェーズボーラスの物理的な外観は、よく（ 図3）それらを区別するために使用できます。両方メソフェーズタイプから収穫は、この資料で説明された。
ガラスサンドイッチプレート中脂質メソフェーズから小さな結晶を収穫するには、時間、スキル、experを必要とする骨の折れるプロセスです。ience、忍耐と着実に手。収穫のための適切な時間を確保しておくと、すべての物資や機器を事前に手になるように研究室を設置することが重要です。収穫を支援するために二人目は必須ではないが推奨されます。その人は、ストレージパックに収穫された結晶と低温冷却マウントループを置くだけでなく、収穫をして個々に事前にマーキングされたプレートの供給を支援することができます。アシスタントは、回折データ収集中に決定的な証明するかもしれない収穫中に行われた結晶の観測を文書で重要なサポートの役割を果たすことができます。アシスタントが存在しない場合には、音声起動、音声記録装置は、文書化のために有利に使用することができる。
この資料に記載されているプロトコルに従うことで、ビューアを立ち上げて結晶収穫で実行するのに役立ちます。しかし、プロセスは簡単ではありませんし、そのことを理解することが重要であるPRActiceは貴重な膜タンパク質の結晶を収穫に起動する前に必要とされる。それは特に貴重ではないタンパク質の結晶を使用してテストプレートは最初に実験されることをお薦めします。これは、ガラスを切断ガラスの破片を除去し、結晶を見て、収穫の間にそれらを追跡するために、顕微鏡に偏光機能を使用して、中間相の上からカバーガラスを持ち上げ、最後に中間相異なる種類の取扱いには貴重な経験を持つ新米を提供しますと、そこから収穫。メソフェーズの質感、ひいては結晶を収穫することができる容易さは、結晶中に時間の経過とともに変化します。それは価値が低い結晶でなく、より価値のあるものと同じ条件下で増殖させたものと、収穫を実践することが重要である。 メソ又は脂質立方相法28およびこれらで considすべきでリゾチームとタウマチンの結晶を成長させることが可能です材料および方法に精通していることを獲得する方法でパワード。一つは、その気まぐれを知るために第一の無タンパク質メソフェーズでの作業を考慮する必要があります。
ここで示す手順は、すべての快適な20℃またはその辺に行われた。より低い温度でのメソ法によって結晶を成長させることが可能です。したがって、準安定相状態のホスティング脂質としてモノオレインは4℃1,2,29,30で使用することができます。代替案は、低温結晶化のために合理的に設計された31 7.9 MAGを使用することです。我々は、特定の膜タンパク質のターゲットで日常的に低温crysallogenesisを行う。このケースでは、結晶成長と収穫はウォークイン4℃の冷蔵庫内で行われます。このような状況下で働くことは暖かく、快適な服装の必要性ではなく、少なくともそのうち独自の課題があります。
高分子CRYSを使用して構造決定する全体的なプロセスの次のステップtallographyは、結晶を回収し、この記事で説明するようにスナップを冷却で回折データを収集することである。 メソ成長結晶中の通常小さいです。しかし、有用な回折データ収集は20μm9の最大寸法を有する結晶では不可能であった。この目的のために、マイクロビームシンクロトロンX線を使用し、このシリーズ32,33の個別のJoveの記事の焦点である。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この仕事に貢献し、ほとんどがCaffrey膜から構造·機能研究グループ、過去と現在の両方のメンバーである多くの人々があります。すべてに、特にJingquanタンとヨセフライアンズへ、私達は私達の暖かい感謝と感謝の意を。この作品は、アイルランド科学財団（07/IN.1/B1836）、国立衛生研究所（GM75915、P50GM073210とU54GM094599）、およびFP7のコストとマリー·キュリー·アクション（CM0902とPIEF-GA-2009からの助成金によって部分的にサポートされていました-235612）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
| Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
| Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
| Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
| Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
| Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
| Lab notebook | Various | NA | Tool |
| Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
| Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
| Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
| Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
| Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
| Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
| Purified water | Millipore | Reagent | |
| Safety goggles | Various | NA | Tool |
| Sample Pin Bases - Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
| Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
| Tissues | NA | NA | Disposable |
| Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |
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