Summary
Heri beskrives procedurer, der gennemføres i Caffrey Membrane strukturelle og funktionelle Biologi Group til at høste og cryo-cool membran proteinkrystaller dyrket i lipidiske kubiske og svamp faser til brug i strukturbestemmelse hjælp makromolekylære røntgenkrystallografi.
Abstract
En vigtig rute til at forstå, hvordan proteiner fungerer på en mekanistisk niveau er at have strukturen af målproteinet til rådighed, helst med atomar opløsning. For tiden er der kun en måde at fange sådanne oplysninger i forbindelse med integrerede membranproteiner (figur 1), og de komplekser, de danner, og denne metode er makromolekylær røntgenkrystallografi (MX). At gøre MX diffraktion kvalitet krystaller er brug som, i tilfælde af membranproteiner, ikke danner let. En metode til krystallisering membranproteiner, der involverer brugen af lipidiske mesofaser, især de kubiske og svamp faser 1-5, har fået betydelig opmærksomhed for sent på grund af de gode resultater, den har haft i G-protein-koblede receptor felt 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Men den metode, herefter benævnt i meso eller lipid kubisk fase metode, kommer med sin egen tekniskeudfordringer. Disse opstår til dels på grund af den generelt viskos og klæbrig karakter af den lipide mesofase, hvori krystallerne, som ofte mikrokrystaller, vokse. Manipulering krystaller bliver svært som et resultat og især så under høst 22,23. Problemer opstår også ved det trin, der går forud for høst hvorefter glasset sandwich-plader, som krystallerne vokser (fig. 2) 24,25 åbnes for at blotlægge mesofase bolus, og krystallerne deri, for høst, cryo-køling og eventuelle X -ray diffraction dataindsamling.
De kubiske og svamp mesofase varianter (Figur 3), hvorfra krystaller skal høstes har dybt forskellige rheologier 4,26. Den kubiske fase er viskos og klæbrig beslægtet med en tyk tandpasta. I modsætning hertil er svampen fase mere væske med en udpræget tendens til at flyde. Følgelig forskellige tilgange til åbning krystallisation brønde containing krystaller vokser i den kubiske og svampen fase kaldes for hvilket også forskellige metoder kræves til høstning krystaller fra de to mesofase typer. Protokoller for at gøre netop det er blevet raffineret og gennemført i membranen strukturelle og funktionelle Biology (MS & FB) gruppe, og er beskrevet i detaljer i denne Jové artikel (figur 4). Der gives eksempler på situationer, hvor krystaller er med held høstet og kryo-afkølet. Vi leverer også eksempler på tilfælde, hvor der er problemer, som fører til den uigenkaldeligt tab af krystaller og beskrive, hvordan disse problemer kan undgås. I denne artikel Viewer er forsynet med trin-for-trin instruktioner til åbning glas sandwich krystallisering brønde, til høst og for cryo-køling krystaller af membranproteiner vokser i kubiske og i svamp faser.
Protocol
1. Laboratory Set-up Pre-høst
- Som forberedelse til høst, fylde tørre skum Dewar med flydende nitrogen og placere den ved siden af mikroskop, hvor høst skal finde sted.
- Nedsænkes oplagring pucken, åbne ender, i flydende nitrogen inden i skummet Dewar og lad det fuldt cool.
- Sikre en mikro-mount af en størrelse, der passer krystallen skal høstes på en magnetisk stav (figur 5). Det er vigtigt at have ved hånden en række ekstra magnetisk tryllestave præinstalleret med mikro-mounts at tage højde for situationer, hvor det er nødvendigt at høste flere krystaller fra den ene bolus. Spare wands bør være tilgængelige på alle tidspunkter.
- Placer en mikropipette, tips og udfældningssubstansen løsning, der blev anvendt til krystalvækst ved siden af høst mikroskop. Det kan være nødvendigt at dække mesofase og at forhindre udtørring når brønden er åben.
- Har en notesbog og pen på bænken tæt ved og / ellercomputeren åbnes. Disse vil blive anvendt til at registrere observationer med hensyn til kvalitet, udseende, placering, opbevaring puck nummer, etc., af krystaller, de høstes, cryo-afkølet og oplagres.
- Hvis en assistent er klar til at hjælpe med at høste den pågældende person skal forstå klart den protokol, der vil blive fulgt, i hvilken rækkefølge de forskellige trin vil finde sted, og deres rolle i den samlede proces.
Med alle de materialer og udstyr på plads vores næste opgave er at:
2. Identificer Plader og Wells, der indeholder Crystals
- Den enkleste og mest direkte fremgangsmåde til at finde høstes krystaller er at inspicere brønde hånden ved hjælp af et mikroskop med normal og med krydsede polariseret lys. Justering af lysende lysintensitet på mikroskopet kan hjælpe med at placere krystaller.
- Alternativt kan en billeddanner, hvor pladerne screenes automatisk med normalt og krydses polarisererd lys, kan benyttes til at lede efter krystaller.
- Vurdere ved øjet indspillet digitale billeder på en computerskærm.
- Klart markere de brønde med krystaller til høstning og optage kommentarer til størrelse, kvalitet og beliggenhed af krystallerne i mesofase i den bærbare computer eller på en computer.
- Fjern plade indeholdende krystaller til høstning fra imager.
3. Åbning af et godt med cubic mesofase. Metode 1
Pladerne, hvor krystallerne vokser ved i meso fremgangsmåden er glas sandwich-plader (figur 2). For at få adgang til mesofase og krystallerne deri, er det nødvendigt at åbne brønd. Dette gøres ved hjælp af en glas skæreværktøj at skære den øvre dækglas, der forsegler såvel som derefter kan fjernes.
Der er flere måder til at skære og fjerne dækglas fra over en krystallisation godt. Den ene til at bruge, er dikteret af typen of mesofase ved hvilken krystallen er fundet stigende. Dette kan være meget viskos og klæbrig kubisk fase (figur 3A) eller mere flydende variant, svampen fase (figur 3B). I denne video artikel vil vi vise, hvordan man åbner brønde og at høste krystaller fra begge disse hosting materialer.
- Placer glasset sandwich krystallisering plade på scenen af et lysmikroskop.
- Under anvendelse af en glas skæreværktøj score på dækglas let med to koncentriske cirkler placeret over afstandsstykket og lige uden for omkredsen af brønden. Med et nyt skæreværktøj, kræver scoring minimalt påførte tryk. Erstat værktøjet med en ny, når det tryk der kræves for at score stiger endnu fraktioneret, og dette sker typisk efter åbning 10 brønde.
- Opbryde glas i rummet mellem de to scoret cirkler for at frigive den indvendige dækglas. Dette genererer masser af glasskår og støv. Ryd dem væk med en fugtigkøkkenrulle.
- Fjern frigjorte dækglas ved at tage fat med et fint tippet pincet og vippe det væk fra og slukke for godt. I dette tilfælde forbliver den kubiske fase fast og på plads på bundpladen af brønden.
- Zoom ind for at få et bedre overblik over den kubiske mesofase som nu er klar til brug i krystal høst.
4. Åbning af et Kar med Cubic mesofase. Metode 2
- Brug af glasset skæreværktøj score lige parallelle linier i dækglas til den ene side af brønden og som strækker sig over brønden selv. Dette muliggør lettere pincet adgang til og fjernelse af dækglas.
I dette særlige demonstration, revner den dækglas i befri dækglas fra den klæbende spacer overflade. I processen forskyder dækglas i position og fældningsmidlet separeres fra den kubiske fase. Når dækglas løftes noget af fældningsmidlet følger med. Vi står tilbage med en eksponeret bolus af mesofase uden omgivende fældningsmiddel. Det samme, tilsættes 1 ul frisk fældningsmiddel på toppen af bolusen anvendelse af en mikropipette til at forhindre mesofase mod udtørring og undergår en faseændring, som kan beskadige krystaller. Bolusen er nu klar til anvendelse i krystal høst.
5. Åbning af et Kar med Sponge Phase. Uden held
Svampen fase er mindre overbærende at arbejde med på grund af dets evne til at flyde. Hvis at strømning resulterer i svampen fase i kontakt med omkredsen af brønden kapillaritet vil uddrage det mesofase og krystallerne mistes. Et eksempel på dette sker, er vist i denne video klip.
- Zoome ind på svampen fase og skifte frem og tilbage mellem normal og krydsede polariseret lys til at lokalisere krystaller i svampen fase.
- Som forberedelse til åbning af godt score og skære dækglas som beskrevet i afsnit 3. I den proces, revner dækglas. I forsøgING at åbne og udfældningssubstansen skift i retning af revnen og til sidst det kommer i kontakt med afstandsstykket. Med fældningsmiddel går nogle af svampen, og dets last af krystaller, som er gået tabt.
I denne særlige sekvens er polarisatorerne på mikroskopet ikke helt har passeret, og krystallerne kan ses som lyse objekter samtidig, at brønden og dens indhold forbliver synlige.
6. Åbning af et Kar med Sponge Phase. Succesfuld
- Zoom ind på svamp fase og at udpege en krystal både i normal og krydsede polariseret lys.
- Score, klippe og fjerne en del af dækglas dækker godt, som i afsnit 4,1. Ufuldstændigt krydsede polariseret lys anvendes til at holde styr på krystallen.
- Indføre et stykke tørt tissuepapir gennem åbningen i dækglas og ind i brønden, indtil den lige berører fældningsmiddel opløsning. Bortsuge opløsningen forsigtigly, indtil det er næsten alle gået og derefter fjerne vævet. Dette bevirker, at resterende fældningsmiddel og svamp fase med krystallen stadig på plads, til at trække under dækglas.
- Score, klippe og fjerne med en pincet resten af dækglas, som i afsnit 4,1. I dette tilfælde opdeler svamp fase, nogle forbliver i brønden og nogle klæber til dækglas. Krystallen er i bolus på dækglas. Fordi der er meget lidt fældningsmiddel stede, svampen fasen begynder at undergå en faseovergang sandsynligvis på grund af udtørring. Dette kan ses som en ring af dobbeltbrydning, der migrerer mod midten af bolusen. Umiddelbart tilføje fældningsmiddel til bolusen at standse overgangen. Bolusen er nu klar til anvendelse i krystal høst.
7. Høstning og Cryo-køling krystaller fra den kubiske fase
- Gå frem og tilbage mellem normal og krydsede polariseret lys til at lokalisere krystaller i den kubiske fase bolus i den åbne brønd. I thans videosekvens op til fire dobbeltbrydende krystaller kan ses i den kubiske fase bolus med krydsede polariseret lys.
- Brug en monteret cryo-loop (figur 5) til at undersøge frisk eksponeret mesofase for krystaller, til at fiske ud krystaller og derefter styrte dem, der er indeholdt i cryo-loop, i flydende kvælstof i Dewar straks efter høst. Ideelt set bør høst og snap-køling sker i en kontinuerlig og hurtig bevægelse. Så lidt vedhængende mesofase som muligt bør høstes med krystal. Det er vores erfaring, er cryo-beskyttelsesmiddel ikke nødvendigt med i meso-dyrket krystaller.
- Da det ikke er muligt at søge efter krystal i cryo-loop umiddelbart efter høst inspicere mesofase bolus, der anvendes til høst at kontrollere, at krystal er ikke længere der tyder på, at det blev høstet succes.
8. Høst og Cryo-køling Krystaller fra Sponge fase
- Gå frem og tilbage mellem normal og krydsede polariseret lys til at lokalisere krystaller i svampen fase bolus i den åbne brønd. I denne videosekvens mange dobbeltbrydende krystaller kan ses i bolusen under krydset polariseret lys.
- Brug en monteret cryo-sløjfe (fig. 5) til at fiske ud krystaller fra svampen fase og til at kaste dem, der er indeholdt i eller på cryoloop, i flydende nitrogen i Dewar umiddelbart efter høst. Som med høst fra den kubiske fase, ideelt set burde det cryo-køleprocessen ske straks krystal høstes med så lidt tid som muligt der er gået mellem den faktiske høst begivenhed og kaster ud i flydende nitrogen. Så lidt vedhængende svamp fase som muligt bør høstes med krystal. Som bemærket cryo-beskyttelsesmiddel ikke nødvendigt med i meso-dyrkede krystaller.
9. Lagring af krystaller i Dewars
- Efter at have kastet den monterede løkke i flydende nikvælstof placere den i en af de holder slots af lageret pucken i skum Dewar. Alle manipulationer er færdig med sløjfen, på toppen af den magnetiske stav og pucken nedsænket i flydende nitrogen.
- Optag placering og detaljer af den høstede og cryo-afkølede krystal i den bærbare computer og / eller på computeren.
- Når pucken i skummet Dewar er fuld eller høstes for dagen er afsluttet transfer pucken ind i et skrinlagt puck holder i et lager eller en transport Dewar fyldt med flydende nitrogen. Krystaller kan sendes i transport Dewars til synkrotron facilitet for diffraktion dataindsamling.
10. Repræsentative resultater
Målene af høst og cryo-køling øvelser demonstreret her er at overføre en krystal fra hosting mesofase i cryo-loops, at forglasse den loopes krystal og at placere den i opbevaring i flydende nitrogen i en Dewar. Den ideelle situation er, når høst og cRyo-køling er udført på en sådan måde, at diffraktion kvaliteten af krystallen bevares i processen. Så lidt mesofase som muligt bør høstes med krystal. Det er at placere krystal og centrere det på røntgenstrålen så meget mindre udfordrende, at fremskynde cryo-køling med henblik på forglasning, og for at minimere interfererende baggrund scatter fra mesofase under diffraktion dataindsamling. Nogle eksempler på cryo-kølede prøver, hvor krystallen kan og ikke kan ses, er vist i figur 6. Hvor krystallen kan ikke ses med det blotte øje er det sædvanligvis nødvendigt at ty til diffraktion rastering for at finde krystallet og at centrere den i strålen for dataindsamling 27.
Fig. 1. Skematisk fremstilling af en biologisk membran viser lipiddobbeltlaget i og hvor are ligger en række proteiner.
Figur 2. En fuldt lastet og forseglet 96-brønds glas sandwich krystallisation plade. Hver brønd indeholder 50 nl kubisk fase og 1 pi præcipitant opløsning. For klarheds skyld er den kubiske fase er farvet med Sudan Red og fældningsmiddel opløsningen omfatter methylenblåt. Fra reference 5.
Figur 3. Krystaller af membranproteiner vokser i den lipide mesofase. A. Den kubiske fase med en krystal af bacteriorhodopsin fra H. halobium. B. svamp fase indeholdende en krystal af vitamin B12 receptor / transportøren, BtuB, fra E. coli. Fra reference 25. De kubiske og svamp faser har kontrasterende retssag tilrances som er indlysende ved at sammenligne panelerne A og B. Den kubiske fase i A er ekstremt viskos og bevarer sin oprindelige form. Det ikke flyder. Dette er særligt tydeligt ved kanterne af de mesofase bolus, der har en ru udseende. Ved kontrakt, er det svamp fase betydeligt mindre viskos og gør flow. Således svampen fasen ikke bevare sin oprindelige form, og dens kanter er karakteristisk glat. Fældningsmidler, der omfatter Jeffamine, PEG 400, 2-methyl-2 ,4-pentandiol, pentaerythritol propoxylat, butandiol og hexandiol, kan medføre en overgang fra den kubiske til svampen fase 4,26.
Fig. 4. Rutediagrammet opsummerer trin i produktion, høst og cryo-køling af i meso-dyrket membranprotein krystaller (A). Kun de skridt, omgivet af den stiplede rødelinie, og beskrevet i detaljer i (B), der er dækket i denne Jové artikel. Panel A er fra Reference 3. Klik her for at se større figur .
Figur 5. En tom cryo-loop monteret på en tap, der holdes på plads på et magnetisk stav. Ekspanderede udsigt over tappen (A) og mikro-mount (B) af dette vigtige værktøj til høst og cryo-køling er vist. Den tomme løkke for enden af mikro-mount i B er 30 um i diameter. Selv om den ikke testet andre loop typer udførligt, finder vi, at MiTeGen sløjfer vist arbejde godt med både de kubiske og svamp faser.
Figur 6. Høstet og kryo-afkølede krystaller af membranproteiner i cryo-sløjfer, som det ses med en in-line mikroskop på en synkrotron beamline. A, B. Eksempler på høstede krystaller (Caa3 cytochromoxidase 34 (A), diacylglycerol kinase, DgkA (B)), hvor krystaller (blå pil) er synlige gennem den kryo-afkølede mesofase på en kryo-loop. C. Eksempel hvor de høstede krystal er ikke synlig i den kryo-afkølede mesofase på en kryo-loop. Spidsen af sløjfen er identificeret med en rød pil. Den vedhængende cryo-afkølede mesofase er identificeret med en blå pil.
Discussion
I denne video artikel viste vi, hvordan krystaller dyrket i en lipidisk mesofase høstes og cryo-afkølet som forberedelse til anvendelse ved diffraktion dataindsamling og i sidste ende til strukturbestemmelse. The hosting mesofase kan være viskos og klæbrig kubisk fase eller den mere flydende svamp fase 4. Hvordan glas sandwich plader er åbnet, og hvordan krystallerne høstes afhænger meget mesofase type. Det er derfor vigtigt at vide, hvilken af de to man har at gøre med i forvejen. Identiteten af den hosting lipid og den anvendte fældningsmiddel er vigtige i denne forbindelse, og den fysiske udseende af mesofase bolus i krystallisering godt kan bruges til at skelne dem fra hinanden (Figur 3). Høst fra begge mesofase typer blev illustreret i denne artikel.
Høst små krystaller fra en lipidisk mesofase i glas sandwich plader er en omhyggelig proces, der kræver tid, dygtighed, experience, tålmodighed og en rolig hånd. Det er vigtigt at afsætte en passende mængde tid til høst og til at oprette laboratoriet, så alle leverancer og udstyr er ved hånden i forvejen. En anden person til at hjælpe med høsten er ikke afgørende, men anbefales. Denne person kan hjælpe med at levere pre-mærkede plader til den enkelte at gøre høst samt at placere cryo-kølede monterede sløjfer med høstet krystaller i lageret pucken. Assistenten kan også spille en vigtig støtte rolle i at dokumentere observationer på de krystaller foretaget under høst, der kan vise sig afgørende i diffraktion dataindsamling. I mangel af en assistent, kunne en stemmeaktiveret audio-registreringsanordning med fordel anvendes til dokumentation.
Efter protokollen beskrevet i denne artikel vil hjælpe med at få Viewer op at køre med krystal høst. Det er imidlertid vigtigt at forstå, at processen ikke er ligetil og at PRActice er nødvendig, før lanceringen i høst værdifulde membran protein krystaller. Det anbefales derfor, at testplader med krystaller af proteiner, der ikke særlig værdifuld blive eksperimenteret med først. Dette vil give den neophyte med værdifuld erfaring i at skære glas, fjerne glasskår, løfter dækglas fra over mesofase ved hjælp af polariserende funktionen på mikroskop for at se krystaller og til at spore dem under høst, og endelig håndtering af de forskellige typer af mesofaser og høst fra dem. Teksturen af mesofase, og i forlængelse heraf den lethed, hvormed krystaller kan høstes, ændrer sig med tiden under krystallisation. Det er derfor vigtigt at øve høst med mindre værdifulde krystaller, men med dem, der er dyrket under de samme betingelser som de mere værdifulde. Det er muligt at dyrke krystaller af lysozym og thaumatin ved in meso eller lipid kubisk fase metode 28 og disse skal betragtestet af måde at få kendskab til de materialer og metode. Man bør også overveje at arbejde med protein-fri mesofase første til at lære af sine luner.
Procedurerne vist her blev alle udført i en behagelig 20 ° C eller deromkring. Det er muligt at dyrke krystaller med i meso metoden ved lavere temperaturer. Således kan monoolein som vært lipid i en metastabil fase tilstand anvendes ved 4 ° C 1,2,29,30. Et alternativ er at bruge rationelt designet 7,9 MAG for lav temperatur krystallisation 31. Vi gør lavtemperatur crysallogenesis rutinemæssigt med visse membran protein-targets. I dette tilfælde er krystalvækst og høstning gøres på en walk-in 4 ° C køleskab. Arbejde under sådanne forhold har sine egne udfordringer ikke mindst som er behovet for varm og komfortabel påklædning.
Det næste skridt i den overordnede proces for strukturbestemmelse hjælp makromolekylære krystaltallography er at indsamle diffraktionsdata om krystaller høstet og snap-afkølet som påvist i denne artikel. I meso-dyrket krystaller er normalt små. Imidlertid er nyttige diffraktion dataindsamling været muligt med krystaller med en maksimal dimension på 20 um 9. Til dette formål er mikro-beam synkrotron røntgenstråling anvendes og er genstand for et særskilt Jupiter artikel i denne serie 32,33.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Der er mange, der har bidraget til dette arbejde, og de fleste er fra Caffrey Membrane strukturelle og funktionelle Biology Group, både tidligere og nuværende medlemmer. Til alle, og især til Jingquan Tan og Joseph Lyons, vi udvide vores varmeste tak og påskønnelse. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 og U54GM094599), og FP7 COST og Marie Curie-aktioner (CM0902 og PIEF-GA-2009 -235.612).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
| Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
| Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
| Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
| Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
| Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
| Lab notebook | Various | NA | Tool |
| Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
| Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
| Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
| Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
| Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
| Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
| Purified water | Millipore | Reagent | |
| Safety goggles | Various | NA | Tool |
| Sample Pin Bases - Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
| Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
| Tissues | NA | NA | Disposable |
| Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes. Biochemistry. , Forthcoming (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist. Science. 330, 1091-1095 (2010).
- Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole. Nature. 485, 400-404 (2012).
- Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature. 482, 547-551 (2012).
- Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335, 851-855 (2012).
- Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist. Science. 322, 1211-1217 (2008).
- Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor. Nature. 482, 552-556 (2012).
- Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485, 321-326 (2012).
- Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469, 175-180 (2011).
- Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function. Science. 318, 1266-1273 (2007).
- Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex. Nature. 469, 236-240 (2011).
- Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature. 475, 65-70 (2011).
- Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature. 485, 395-399 (2012).
- Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic. Nature. 485, 327-332 (2012).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).
- Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization. Structure. 16, 1003-1009 (2008).
- Cherezov, V. Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron. 6, 587-597 (2009).
- Caffrey, M. A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).
- Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system. J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. Rational design of lipid for membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).
- Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. , e1712 (2010).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase. J. Vis. Exp. , e4000 (2012).
- Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase. Nature. 10, (2012).
