Summary
荧光
Abstract
病毒感染细胞引起正常细胞的功能，为病毒复制的能源和资源转移的具体变化。被征用病毒宿主细胞功能的许多方面，通常是由病毒基因产物的表达，招宿主细胞的蛋白质和机械。此外，病毒工程师具体膜细胞器或移动囊泡和马达蛋白标记的目标地区（ 从头感染期间，病毒增选的分子马达蛋白，针对核细胞后，病毒装配过程中，他们将劫持细胞在病毒组装的机器，将帮助）。据了解病毒如何，特别是那些RNA基因组，协调细胞内的蛋白质和RNA的组成部分贩运，以及他们如何实现在细胞的特定基因的传染性颗粒组装。 RNA的定位研究开始于早期的工作。发展中国家较低的真核生物EMbryos和神经细胞提供了重要的生物信息，同时还强调，在基因表达的级联编程的RNA本地化的重要性。在其他生物体和细胞系统的研究已经取得了类似的重要信息。病毒是寄生菌，必须利用宿主细胞进行复制。因此，关键是理解RNA病毒如何通过核孔的细胞核，细胞质和其最终目的地之一到子代病毒粒子1，直接从他们的RNA基因组。
鱼作为一个有用的工具，以确定病毒RNA的稳态本地化的变化。结合免疫荧光（IF）22分析，鱼/ IF共同分析将提供合作本地化的蛋白质与病毒RNA的信息3时。因此，这种分析提供了一个很好的起点，其他生化或生物物理测试RNA-蛋白质相互作用4,5测试以来共定位，本身是没有足够的证据是一定的交互。在研究病毒RNA的本地化，使用这样的方法，已获得丰富的信息，病毒和细胞的RNA贩运活动6。例如，HIV-1感染细胞的细胞核中产生的RNA，但只有翻译在细胞质中的RNA。当缺少一个关键病毒蛋白（修订版）7，病毒RNA的鱼已发现的病毒复制的块是由于保留的HIV-1病毒基因组RNA在细胞核8。
在这里，我们提出病毒基因组RNA 原位可视化分析方法。该方法使使用一个标记的RNA探针。这种探头的设计是相辅相成的病毒基因组RNA。在体外合成的反义RNA探针，与地高辛（DIG），修改核苷酸包括在体外 transcription反应。一旦探针杂交细胞中的靶mRNA，随后的抗体标记步骤（ 图1）将揭示本地化的mRNA以及蛋白质的利益时，鱼/ IF。
Protocol
1。探针的制备
- 精华1微克， 在体外转录载体，PKS（+），1小时9 POL 236nt Kpn1酶在37°C和运行上的线性DNA的琼脂糖凝胶产品。片段应该是约2500 bp的。
- 切成片段，凝胶净化使用罗氏微洗脱凝胶提取试剂盒（ 表1中列出的所有试剂使用）。执行最终在30μL洗脱缓冲液洗脱。运行5μL琼脂糖凝胶电泳验证净化产品。
- 混在体外转录反应使用罗氏辛RNA标记试剂盒和孵育2小时，在37°C（见下面的配方）。
在体外转录反应：
| 线性的DNA | 23μL |
| 1X辛RNA标记组合（罗氏） | 4μL |
| 1X茶nscription缓冲区 | 8μL |
| 20U RNase的输出 | 1μL |
| 80U的T7 RNA聚合酶 | 4μL |
| 总 | 40μL |
- 在37°C为15分钟，加入228的DNase I和孵育ü。
- 停止反应，加入EDTA的pH值8.0至20毫米的终浓度。
- 净化罗氏公司采用快速自旋列由生产厂家指定的反应。
- DEPC处理过的1/10体积的3M醋酸钠pH值5.2和2.5体积冰冷的95％乙醇沉淀净化探头。混合，并在-80°C孵育30分钟至过夜。
- 15分钟，在4°C离心15,000 xĞ探头。
- 去除上清，在冰冷的70％乙醇洗沉淀。 15,000 xĞ再次离心5分钟在4°C。
- 取出上清液，干燥沉淀。在50μL瓦特悬浮颗粒亚特（DNA酶/核糖核酸免费）含10üInvitrogen公司的核糖核酸酶输出。
- 估计分光光度法探头（在260 nm的措施RNA）的浓度，并稀释至5 ng /μl的浓度。商店在短期使用，或-80°C下长期贮存于-20°C等分。它建议执行间的分析比较，以便保护这等份。
2。细胞固定
- 它最初是重要的种子将未经处理的，无菌的盖玻片的贴壁细胞，所以最终汇合后收获约70-80％。对于非贴壁细胞，生长正常，并准备收集时，孵育1小时，已与0.01％W / V聚 - L-赖氨酸（Sigma-Aldrich公司，公司）治疗的盖玻片。对于一个典型的12孔聚苯乙烯组织培养板（3.8厘米），15细胞（如HeLa细胞）镀在转染前24小时。非贴壁细胞可以像往常一样感染或转染，并允许广告这里固定3前的玻璃盖玻片。
- 丢弃的媒体和双蒸馏水（DPBS）1分钟准备1X的磷酸盐缓冲液洗细胞。酸二乙酯（DEPC处理，Sigma-Aldrich公司，公司），1×PBS也可用于处理，但未经处理的PBS不能因为它可能含有核糖核酸酶。
- 倒掉PBS和添加4％多聚甲醛，足以完全覆盖细胞。孵育15-20分钟。
- 丢弃paraformaldeyhyde和用1X DPBS为1分钟的细胞。
- 丢弃的DPBS和添加0.1 M甘氨酸（在1X DPBS解散）。孵育10分钟。
- 丢弃的甘氨酸和用1X DPBS为1分钟，细胞。
- 丢弃DPBS和添加0.2％的Triton-X的（在1X DPBS解散）。孵育5-10分钟。如果核仁或核包膜蛋白染色，通透与海卫不超过5分钟或蛋白定位X-100的将成为弥漫。
- 丢弃的Triton X-100洗一次1X DPBS为1分钟。
- 对于长期储存，在4°C PBS取代了4个月，用70％乙醇和商店。另外，洗一次1X DPBS，并着手对鱼类。
3。 荧光原位杂交技术（FISH）
- 如果盖玻片存储乙醇，取代1X DPBS乙醇和使细胞水化30分钟。补液可以一蹴而就，如果盖玻片储存在4°C
- 1X 1分钟DPBS清洗盖玻片。
- 准备幻灯片孵育的盖玻片上，照顾他们清理和标签。
- 对于18毫米盖玻片，添加50μLDNA酶溶液（25单位/盖玻片，市售）的幻灯片。加盖玻片，请务必将它放在电池的侧面下来，并在室温下15分钟孵育。
- 1X 1分钟DPBS清洗盖玻片。
- 添加50μL杂交组合每盖玻片（见下文）配方到幻灯片和孵育16-18Ĥ盖玻片细胞的一面向下，在42°C。孵化应在含50％甲酰胺，2X SSPE的组合（12.5毫升去离子甲酰胺，2.5毫升20X SSPE的，10毫升水）的托盘。
杂交组合（一盖玻片，50μL）：
| 库存量 | 材料（终浓度） |
| 25μL | 甲酰胺，50％（去离子;任何源） |
| 5μL（10毫克/毫升） | tRNA的1毫克/毫升（Sigma-Aldrich公司，公司） |
| 5μL（20X） | SSPE的，2X |
| 5μL（50X） | denharts，5X |
| 0.125μL（5个） | 核糖核酸酶输出 |
| 5μL（5 ng /μl的25毫微克） | 探测器 |
| 5μL | H 2 O DEPC处理，作出最后的卷50μL |
- 孵育细胞盖玻片一侧，在50μL50％甲酰胺（在1X DPBS稀释）15分钟42°C。
- 洗2X SSPE的盖玻片两次孵化它们细胞的一面，每次5分钟，在50μL2X SSPE的（20X SSPE的在1X DPBS稀释）在42°C。
- 在1分钟1X DPBS冲洗盖玻片。
4。免疫荧光染色
- 阻止细胞放置在50μL1X罗氏封闭液（在1X DPBS稀释10X罗氏阻塞解决方案）朝下30分钟的盖玻片。
- 孵育1小时50μL主要抗体溶液中的盖玻片细胞面朝下，在37°C。应根据制造商的方向1X封闭液稀释的抗地高辛抗体。如果正在使用其他抗体染色的蛋白质，他们可能会在正确的浓度增加，所有使用的抗体是从不同的主机规格而得IES。
- 洗为10分钟1X DPBS盖玻片。
- 孵育1小时50μL二次抗体溶液中的盖玻片细胞面朝下，在37°C。的Alexa Fluor标记的抗体（Invitrogen公司）可以用来生成颜色的范围，并在1:500 1X阻塞的解决方案，1X DPBS。
- 洗盖玻片两次为1X DPBS各10分钟。
- 盖玻片细胞侧干滤纸纸。一定覆盖盖玻片，以避免暴露于光线和漂白。
- 一旦所有的液体蒸发，安装到使用8μLImmunoMount的Thermo Scientific的（公司）的新鲜幻灯片盖玻片。轻轻敲击盖玻片，以消除任何气泡。
- 应用指甲油盖玻片的边缘，以确保到位。
- 显微技术的RNA和蛋白质的可视化也是这一技术成功的关键。使用显微镜上的设置，可以帮助或阻碍的可视化，因此它是关键在显微镜上的设置正确设置和从一个样本到另一个在一个给定的实验是一致的。光学和抗体组合进行详细的显微镜设置，请参见参考资料1,10。
5。代表结果
病毒RNA染色的例子可以看出，在图2。 HIV-1病毒RNA被视为整个显示大部分弥漫的细胞质，细胞质punctae虽然小的情况并不少见。可以看出，通过比较阳性细胞周围的细胞不显示荧光的特异性。在介绍中提到，HIV-1，缺乏监管的Rev蛋白产生RNA，这是保留在细胞核：这可以是一个明亮的信号在细胞核中的可视化，缺乏在细胞质中的RNA荧光信号。细胞蛋白的过度表达也能转移的HIV-1病毒RNA的分布。在图2 （RILP）11或N-末期删除RILP（RILPN）的11，蛋白与动力蛋白运动功能的干扰[例如p50/dynamitin 1， 12]，干扰正常的稳定状态的病毒基因组RNA的定位，通过FISH分析确定RILP表达导致病毒基因组RNA的重新定位，以微管组织中心（选委）13。RILPN分散后期内涵体内细胞质由于无法绑定到动力蛋白复合运动14大亚基的动力蛋白马达和发布p50/dynamitin块胶合 P150后期内涵体，而且病毒基因组RNA和HIV-1结构蛋白的细胞外围1（ 图2）操纵的病毒基因组RNA的稳态本地化，感染力的一个关键因素病毒颗粒，将是最终发展疗法的关键。在我们手中，病毒RNA在细胞中出现，早在3小时后转染和感染10，并成为这12个小时的FISH技术很容易观察到。
图1。盖玻片上生长的鱼/ IF共同分析细胞的协议流程图 ，然后用甲醛固定。甘氨酸和Triton-X的治疗方法是进行细胞之前，无论是用于鱼/ IF或储存在70％的乙醇储存。细胞储存脱水水化1X DPBS（DEPC处理，PBS），然后再继续上鱼/ IF。细胞治疗用DNase我留下过夜杂交探针。一旦完成杂交，洗涤细胞与甲酰胺，以及与SSPE的，最终1X DPBS冲洗。阻断剂应用于细胞，其次是培养与主要抗体。洗涤后，二次抗体应用。两个1X DPBS最后清洗完成后盖玻片干燥和幻灯片上的成像的染色过程。
图2。代表鱼/ IF共同分析结果A）HIV-1转染HeLa细胞，并在某些情况下，结构，导致细胞蛋白表达（RILP，p50/DynamitinRILPΔN（氨基末端缺失突变体）） 。鱼/ IF共同分析：RNA被确定G3BP或LAMP1（红色）在绿色来区分。乙）的HIV-1的表达在HeLa，并在不同时间点收集。病毒RNA的表达被跟踪而绿色的细胞蛋白，核蛋白A1，在红染色。大小酒吧10微米。从参考文献1（一个选择面板数字; RILP，p50/Dynamitin，和RILP DELTAN）修改图像和17（B组）。
Discussion
鱼/ IF共同分析是一种可靠的方法，可视化现已提炼9,15,16细胞的病毒RNA。在过去的几年中，我们已经开发出一种RNA的染色成品的方法。这种技术可用于广泛的细胞类型的阵列探头是特定的靶RNA 17。通过与地高辛标记的探针，我们能够通过简单的染色可视化的RNA。当染色RNA和其他蛋白质相结合，共同分析鱼/ IF成为一个强大的工具来观察细胞结构和蛋白质/ RNA本地化。
特异性的RNA检测是相当高的。 图2说明了这一点。在一些原来的工作重点，对病毒基因组RNA的定位，建立鱼，缺乏牧师被困在细胞核内的病毒RNA 18。因为这，丰富的新病毒基因组RNA的本地化信息已获得使用的techniqu“é概述。由过度的细胞蛋白，并非所有的病毒RNA和人群定位的不同区域的细胞，可以强制。类似的表型的RILP表达，获得核蛋白A2的siRNA枯竭时在HIV-1表达13日 ，会导致RNA的明显积聚在选委。病毒基因组RNA可以减去高端马达蛋白，动力蛋白：p50/Dynamitin过度或击倒的动力蛋白重链1，释放病毒基因组RNA内域结果通过禁用蜂窝边缘推到细胞边缘（ 图2）。突变体的RILP，RILPΔN，不再结合的动力蛋白马达，分散内涵体进入细胞质（LAMP1标签），因为他们不再积极在juxtanuclear域本地化。这些结果指出，人口的HIV-1病毒基因组RNA，特别是塑料的概念，不同的HIV-1基因池RNA的识别作用在病毒复制周期有时存在。这些相同的概念已经确定了这个基因编码的蛋白质，加格19。
鱼/ IF合作与抗体选择和可用性分析的用途有局限性。小学和中学的抗体，其浓度的最佳组合优化需要时间来优化（ 见表1和2）。从杂交瘤细胞产生的抗体或由各大公司可以有不同任何地方，从1:2到1:2000，但一定要遵循的指导方针，以取得最佳效果的制造商提供的浓度。在其中的抗体产生的主机，还必须考虑下。由于跨物种识别（数据未显示），在高背景相结合的结果，也应避免在小学和中学的抗体混合绵羊与山羊抗体。对于网站的氟secondaRY抗体，可以用浓度为1:500几乎任何在一组的抗体。鱼/ IF共同分析，在本报告所述的其他缺点是它捕捉其在稳态位置的RNA，细胞已被固定后，使用多聚甲醛和洗衣粉（ 图1）和透。
然而，RNA在活细胞成像已经通过各种手段20-22，大多采用如GFP荧光蛋白标记的病毒RNA基因组的变化。然而，更多的手段来识别活细胞中的RNA本地化继续浮出水面。这些新方法涉及的标记RNA手段，菠菜23，24的SNAP或MTRIP 2。这些技术也遭受一些缺点，包括要求通透前增加基板，基必须设计标记的mRNA在显微镜检测的mRNA的细胞。事实上，主要ADVA在本报告所述的鱼类分析ntage在于在本地RNA导致生理上最相关的结果是不变的事实。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢概述的意见和艾伦·科克伦的实验室方法的发展作出贡献的过去和现在的成员。 LA是一个加拿大卫生研究所（CIHR）博士生奖学金和AJM研究院收件人，由弗雷泽，Monat和麦弗逊式事业奖的支持。支持这项工作是由一个从CIHR（赠款＃澳门-56974）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||
| 18mm coverslips | VWR international | 48380 046 | ||||||||||||||||||
| 16% paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 18814 | Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS | |||||||||||||||||
| Triton-X | OmniPur, EMD Millipore | 9400 | ||||||||||||||||||
| Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche Group | D6294-02 | ||||||||||||||||||
| DIG RNA Labelling Mix | Roche Group | 11277073910 | ||||||||||||||||||
| Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | ||||||||||||||||||
| Quick Spin Columns | Roche Group | 11814427001 | ||||||||||||||||||
| DNase I | Invitrogen | 18047-019 | ||||||||||||||||||
| 1X DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | ||||||||||||||||||
| Formamide | EMD Millipore | FX0420-8 | ||||||||||||||||||
| tRNA | Invitrogen | 15401-021 | ||||||||||||||||||
| RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | ||||||||||||||||||
| Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche Group | 1768506 | ||||||||||||||||||
| Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | ||||||||||||||||||
| Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | ||||||||||||||||||
| Microslides | VWR international | 48300-047 | ||||||||||||||||||
| Immunomount | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9990402 | ||||||||||||||||||
| Table 1. Identification of specific reagents and equipment | ||||||||||||||||||||
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| Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations | ||||||||||||||||||||
References
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