Summary
형광
Abstract
세포가 바이러스 복제에 에너지와 자원을 유용하기 위해 사용될 정상적인 세포 기능에 구체적인 변화를 이끌어내는 감염 바이러스. 숙주 세포 기능의 여러 측면은 일반적으로 바이러스성 유전자 제품의 표현으로, 바이러스에 의해 징발되어 채용 숙주 세포 단백질과 기계니다. 또한, 모바일 vesicles 및 모터 단백질에 대한 바이러스 엔지니어 구체적인 멤브레인 organelles 또는 태그가 셀 (드 노보 감염시 바이러스가 공동 제외 분자 모터 단백질 핵을 타겟의 지역을 타겟팅하는 데, 나중에, 바이러스 조립하는 동안, 그들은 세포 공중 납치됩니다 ) 바이러스의 조립에 도움이 될 것입니다 기계. 이하는 바이러스가 특히 RNA의 genomes있는 사람은 단백질과 RNA 구성 요소 모두의 세포내 밀매를 조정하고 그들이 세포의 특정 loci에서 전염성 입자의 조립을 달성하는 방법 방법에 대한 이해된다. RNA의 지방화의 연구는 이전 일을 시작했다. 낮은 진핵세포의 그들을 개발bryos와의 연결 세포가 중요한 생물 학적 정보를 제공하고, 또한 유전자 표현 폭포의 프로그래밍에서 RNA의 지방화의 중요성을 강조. 다른 생물과 세포 시스템의 연구는 유사한 중요한 정보를 굴복했다. 바이러스는 고맙게 여기게 기생충하고 복제하기 위해 호스트 세포를 활용해야합니다. 따라서 그것은 RNA 바이러스가 자손 바이러스 입자 하나에 세포질을 통해 대한 최종 목적지 중 하나와 핵 기공을 통해 핵,,,에서 자신의 RNA의 genomes 직접 방법을 이해하는 것이 중요합니다.
물고기는 바이러스 RNA의 정상 상태 지방화의 변화를 식별할 수있는 유용한 도구 역할을한다. 공동 분석은 바이러스성 RNA 3 단백질의 공동 지방화에 대한 정보를 제공할 경우 immunofluorescence (IF) 분석 22 물고기 / 결합합니다. 이 분석은 따라서 다른 생화 학적 또는 biophysical에 의해 RNA-단백질 상호 작용에 대해 테스트하는 좋은 시작 지점을 제공합니다자체적으로 공동 지방화 이후로 4,5 테스트, 상호 작용의 일부가 될 수있는 충분한 증거가되지 않습니다. 이와 같은 방법을 사용하여 바이러스 RNA의 지방화를 연구에서는 풍부한 정보는 바이러스와 세포의 RNA 밀매 이벤트 6 모두에서 얻고있다. 예를 들어, HIV-1 감염 세포의 핵에서 RNA를 생산하지만, RNA는 세포질로 번역된다. 키가 바이러스성 단백질이 없거나 (레브) 7, 바이러스 RNA의 물고기는 바이러스 복제에 블록이 핵 8 HIV-1 게놈 RNA의 기억력 덕분임을 밝혔다.
여기서는 원래의 장소에 바이러스 게놈 RNA의 시각적 분석 방법을 제시. 방법은 라벨이 RNA 프로브 이용한다. 이 프로브는 바이러스 게놈의 RNA에 대한 보완이 될 수 있도록 설계되었습니다. 동안 안티 센스 RNA 프로브, digoxigenin (잘해봐)로 수정됩니다 ribonucleotide의 체외 합성의가 체외 transcr에 포함되어 있습니다iption 반응. 탐사선이 세포의 표적 mRNA에 hybridized되면 물고기 / IF를 수행할 때, 후속 항체 라벨 단계 (그림 1)은 mRNA의 국산화뿐만 아니라 관심있는 단백질을 보여줄 것입니다.
Protocol
1. 프로브 준비
- 시험 관내 전사 벡터에의 다이제스트 1 μg은 1 시간을위한 PKS (+) POL 37 ° C에서 Kpn1 효소와 236nt 9는 아가로 오스 겔에 대한 선형 DNA의 제품을 실행합니다. 조각은 약 2,500 BP 있어야합니다.
- 겔의 조각을 도려하고 로슈 마이크로 Elute 젤 추출 키트 (사용되는 모든 시약은 표 1에 나와있는)을 사용하여 정화. 30 μl 용출 버퍼의 마지막 용출을 수행합니다. 정화를 확인할 수 아가로 오스 겔에 제품을 5 μl를 실행합니다.
- 12 시간 동안 37 ° C에서 로슈 쫄지마 RNA 라벨링 키트와 부화를 사용하여 시험 관내 전사 반응 (아래 제조법 참조)에서를 섞습니다.
시험 관내 전사 반응에서 :
| 선형의 DNA | 23 μl |
| 1X 쫄지마 RNA 라벨 믹스 (로슈) | 4 μl |
| 1X Transcription 버퍼 | 8 μl |
| 20U RNase OUT | 1 μl |
| 80U T7 RNA 중합 효소의 | 4 μl |
| 합계 | 40 μl |
- 15 분 동안 37 ° C에서 DNase I 및 품어의 228 U를 추가합니다.
- 20 mm의 최종 농도에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0을 추가하여 반응을 중지합니다.
- 제조 업체에서 지정한 로슈에서 빠른 회전 열을 사용하여 반응을 정화.
- 10분의 1 볼륨 DEPC-처리 3M NaOAc의 산도 5.2과 얼음처럼 차가운 95 % 에탄올 2.5 권으로 석출하여 프로브를 정화. 섞어서 하룻밤 ~ 30 분 -80 ° C에서 품어.
- 15,000 X g에서 4에 15 분 ° C에 대한 프로브를 원심 분리기.
- 표면에 뜨는를 제거하고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올에 펠렛을 씻는다. 15,000 X g에서 4에 5 분 ° C에 다시 원심 분리기.
- 뜨는을 제거한 후 펠렛을 건조. 50 μl w에 펠릿을 Resuspend10 U Invitrogen RNase 아웃 포함된 ater (DNase / RNase 무료).
- 분광 광도법에 의한 프로브의 농도 (260 nm의에서 측정 RNA)를 산정하고, μl / NG 5의 농도로 희석. ° C에서 장기 저장을위한 단기 사용하거나 -80 용 -20 ° C에서 aliquots의 상점. 그것은 너무 이것에 대한 나누어지는을 절약 상호 분석 비교를 수행하는 것이 좋습니다.
2. 세포 고정
- 수확시 최종 confluency 약 70~80% 수 있도록 그것은 치료, 살균 유리 coverslips쪽으로 씨앗 자기편 세포가 처음에는 중요합니다. 비 점착 성의 세포의 경우, 정상적으로 성장하고 언제 수집할 준비, 1 시간 동안 0.01 % W / V 폴리-L-라이신 (시그마 - 올드 리치 주식 회사)로 처리되었습니다 coverslips으로 그들을 품어. 전형적인 12도 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (3.8 cm 2)의 경우 150,000 세포 (예 : HELA) transfection 이전 24시간에 도금하고 있습니다. 비 점착 성의 세포가 감염 또는 transfected 정상적으로 및 광고에 사용할 수 있습니다여기에 고정 세 이전에 유리 커버 풀리지 않고 있습니다.
- 미디어를 취소하고 1 분 동안 두 번 증류수 (DPBS)에 준비 인산 버퍼 1X 식염수 세포를 씻는다. Diethylpyrocarbonate이 (DEPC, 시그마 - 올드 리치 주식 회사) 1X PBS도 사용할 수 있습니다 - 취급 그러나 치료 PBS 그것은 RNase의 효소가 포함될 수 없습니다로서.
- PBS를 버리고 완전히 세포를 충당 하고도 4 % paraformaldehyde를 추가합니다. 15-20 분 동안 품어.
- paraformaldeyhyde을 무시하고 1 분 1X DPBS로 세포를 씻어.
- DPBS을 무시하고 0.1 M 글리신을 (1X DPBS에 녹아있는) 추가합니다. 10 분 동안 품어.
- 글리신을 무시하고 1 분 1X DPBS로 세포를 씻어.
- DPBS을 취소하고 트리톤-X (1X DPBS에 녹아있는) 0.2 %를 추가합니다. 5-10 분 동안 품어. nucleolar 또는 핵 봉투 단백질에 대한 더럽히는 것 있으면 트리톤 더이상 5 달러는 분, 또는 단백질 지방화를위한 X-100은 확산이 될 것입 함께 permeabilize.
- 트리톤 X-100을 취소하고 한번에 씻어1 분 용 1X DPBS.
- 장기 보관의 경우 최대 4 개월 동안 4 ° C에서 70 % 에탄올 및 매장으로 PBS를 교체하십시오. 또는 1X DPBS으로 한 번 더 씻어과 생선을 참조하십시오.
3. 원위치 하이브리드화의 형광 (물고기)
- coverslips이 에탄올에 저장되어있다면, 1X DPBS로 에탄올을 대체하고 세포가 30 분 동안 rehydrate 수 있습니다. coverslips이 4 ° C.에 저장된 경우 Rehydration는 하룻밤 만에 할 수 있습니다
- 1 분 용 1X DPBS로 coverslips 씻으십시오.
- 청소하고 잘 레이블을 지정하기 위해 간병에 coverslips를 부화 슬라이드를 준비합니다.
- 18mm coverslip 내용은 슬라이드에 DNase 용액 (시판 25 단위 / coverslip) 50 μl를 추가합니다. 그것 세포 측을 아래로 배치하고, 실온에서 15 분 동안 그것을 품어해야되고, coverslip을 추가합니다.
- 1 분 용 1X DPBS로 coverslips 씻으십시오.
- coverslip 당 50 μl 하이브리드화 믹스 (아래 제조법 참조)에 추가42시 슬라이드와 16-18 H 위해 coverslip 셀 측면을 품어 ° C. 배양은 50 % 포름 아미드, 2X SSPE 믹스 (12.5 ML deionized 포름 아미드, 2.5 ML 20X SSPE, 10 ML 물)이 포함된 트레이에 수행되어야한다.
하이브 리다이 제이션 믹스 (한 coverslip, 50 μl의 경우) :
| 재고 금액 | 재료 (최종 농도에서) |
| 25 μl | 포름 아미드, 50 % (deionized; 모든 소스) |
| 5 μl (10 밀리그램 / ML 중) | tRNA, 1 밀리그램 / ML (시그마 - 올드 리치, INC) |
| 5 μl (20X의) | SSPE, 2X |
| 5 μl (50X의) | Denharts, 5 배 |
| 0.125 μl (5 단위) | RNase OUT |
| 5 μl (μl / 5 NG 25 NG) | 탐침 |
| 5 μl | 최종 만드는 H 2 O DEPC,부피 50 μl |
- 42시 15 분 50 μl 50 % 포름 아미드 (1X DPBS에 희석)에 품어 coverslips 전지 측면 다운 ° C.
- 42시 5 분마다 50 μl 2X SSPE (20X SSPE는 1X DPBS에 희석)에 그들에게 셀 측면을 잠복기 ° C를하여 2X SSPE에 두 coverslips 씻으십시오
- 1 분 용 1X DPBS에 coverslips 씻으십시오.
4. Immunofluorescence 염색법
- 30 분 50 μl 1X 로슈 차단 솔루션 (1X DPBS에 희석 10X 로슈 차단 솔루션)에 그들에게 셀 측을 아래로 배치하여 coverslips를 차단하십시오.
- 37에서 1 시간 동안 50 μl 일차 항체 용액에 coverslips 셀 측면을 품어 ° C. 안티 - 쫄지마 항체는 1X 차단 솔루션 제조 업체의 지시에 따라 희석되어야한다. 다른 항체가 단백질을 얼룩하는 데 사용되고있다면, 그들이 사용되는 모든 항체는 다른 호스트 사양에서 파생된 것을 제공하는 정확한 농도에 추가할 수 있습니다이거야.
- 1X DPBS에서 10 분 동안 coverslips 씻으십시오.
- 37에서 1 시간 동안 50 μl 이차 항체 용액에 coverslips 셀 측면을 품어 ° C. 알렉사 형석 - 복합 항체 (Invitrogen)은 색상의 범위를 생성하는데 사용될 수 있으며 1X 차단 솔루션, 1X DPBS에서 1:500에서 사용됩니다.
- 10 분 1X DPBS 각각에 대해 두 번 coverslips 씻으십시오.
- 워트 먼지 용지에 coverslips 셀 측면을 건조합니다. 빛과 표백에 대한 노출을 피하기 위해 coverslips를 충당해야합니다.
- 모든 액체가 증발되면, 8 μl ImmunoMount (써모 과학 주식 회사)를 사용하여 새 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. 부드럽게하는 기포를 제거하기 위해 coverslip을 누릅니다.
- 위치에 그것을 확보하기 coverslip의 가장자리 매니큐어가 손톱도 적용합니다.
- 현미경 기술에 의해 RNA와 단백질의 시각화는 또한이 기술의 성공에 중요합니다. 그것이 중요하므로 사용하는 현미경에 대한 설정 시각화 도움이나 방해 수현미경에 대한 설정이 올바르게 설정 한 예제에서 주어진 실험에서 다른 위치로 일치한다. 자세한 현미경 설정의 경우, 광학 및 항체 조합 레퍼런스에게 1,10 참조하십시오.
5. 대표 결과
바이러스성 RNA의 염색법의 예제는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 작은 세포질 punctae이 드문 아니지만 HIV-1 바이러스 RNA는 대부분 diffusely 표시 세포질에 걸쳐 볼 수있다. 특이성은 더 형광을 표시하지 주변 세포에 긍정적인 세포를 비교하여 볼 수 있습니다. 이것은 핵에 밝은 신호와 같은 시각 될 수 있으며, 세포질의 RNA 형광 신호의 부족 :로서 도입에 언급, 규제 레브 단백질이 부족 HIV-1은 핵에 유지됩니다 RNA를 생성합니다. 세포 단백질의 Overexpression는 또한 HIV-1 바이러스 RNA의 분포를 변화시킬 것입니다. 그림 2에 11 또는 N-말기 삭제 RILP (RILPN) 11 및 dynein 모터 기능 [예 p50/dynamitin 1을 방해하는 단백질, 12], 생선 분석에 의해 결정으로 바이러스 게놈의 RNA의 정상 정상 상태 지방화에 방해가 RILP 표현식은 미세 소관 기관 센터 (MTOC) 13 바이러스 게놈의 RNA의 다시 지방화에 이르게;. RILPN 늦게 분광 내에서 endosomes dynein 모터 복잡한 14 p50/dynamitin 블록 dynein 모터와 릴리즈의 큰 subunit의 접착 p150에 바인딩하는 무능력으로 인해 세포질 늦게 endosomes뿐만 아니라 세포 주변에 바이러스 게놈 RNA와 HIV-1 구조 단백질 1 (그림 2). 바이러스 게놈의 RNA의 정상 상태 지방화의 조작의 infectiousness에 핵심 기여자바이러스 입자는 치료제의 최종 개발에 열쇠가 될 것입니다. 우리 손에서 바이러스성 RNA는 초기 3시간 포스트 transfection과 감염 10 세포에 나타나고 12시간하여이 물고기 기법에 의해 쉽게 관찰할된다.
1 그림. 물고기 / 공동 분석합니다. 전지를위한 프로토콜의 흐름 차트는 coverslips에 성장 후 paraformaldehyde로 고정됩니다. 세포가 어느 물고기 / IF 사용 또는 스토리지에 70 % 에탄올에 저장되기 전에 글리신 그리고 Triton-X의 처리가 수행됩니다. 저장 건조 세포 물고기 / IF에 계속하기 전에 1X DPBS (DEPC-처리 PBS)에 rehydrated됩니다. 세포 DNase I으로 처리하고 프로브와 잡종을 위해 밤새 남아 있습니다. 일단 하이브리드화가 완료되면 전지뿐만 SSPE와 마찬가지로, 포름 아미드로 씻어, 그리고 최종 1X DPBS는 린스 있습니다. 차단 솔루션과 인큐베이션이어서, 세포에 적용됩니다일차 항체. 세척 후 이차 항체가 적용됩니다. 1X DPBS의 두 최종 세차장은 이미징을위한 coverslips에 따라 건조하고 슬라이드에 장착된 염색법 절차를 완료합니다.
그림 2. 대표 결과 생선 / 공동 분석 IF를 사용합니다.) HIV-1은 세포 단백질의 overexpression (RILP, p50/Dynamitin 및 RILPΔN (아미노 터미널 삭제 돌연변이)를 발생 구조와 HELA 세포로하며 어떤 경우 transfected 있습니다) . 물고기 / 공동 분석 IF이 수행되었습니다 : RNA는 차별 G3BP 또는 LAMP1 (빨간색) 중 하나와 함께 녹색으로 식별됩니다. B) HIV-1은 HELA로 표현하고 다른 시간 지점에 수집됩니다. 세포 단백질, hnRNP A1는, 빨간색으로 물들어있는 동안 바이러스성 RNA 발현은 녹색으로 추적됩니다. 크기 막대는 10 μm의 수 있습니다. 참고 문헌 1 (; RILP, p50/Dynamitin 및 RILP deltaN 패널에서 선택한 그림)에서 수정된 이미지17 (패널 B).
Discussion
물고기 / 공동 분석 IF 지금 9,15,16를 수정되어 세포에 바이러스 RNA를 시각화하는 안정적인 방법입니다. 수년에 걸쳐, 우리는 RNA에 대한 더럽히는 것의 세련된 방법을 개발했습니다. 이 기술은 프로브가 대상 RNA 17에만 제공되는 세포 유형의 다양한 배열에 사용할 수 있습니다. 쫄지마로 프로브를 레이블링함으로써 우리는 단순 염색법에 의해 RNA를 시각화 할 수 있습니다. RNA와 다른 단백질에 대한 더럽히는 것이 결합되면, 생선 / IF 공동 분석은 세포 구조와 단백질 / RNA 지방화를 관찰하는 강력한 도구가됩니다.
RNA 검출의 특이성은 아주 높습니다. 이것은 그림 2에 설명된됩니다. 레브의 부족이 핵 18에서 바이러스 RNA를 갇힌 것을 설립 바이러스성 게놈 RNA의 현지화, 생선에 초점을 맞춘 독창적인 작품의 일부입니다. 이 때문에, 바이러스성 게놈 RNA의 지방화에 대한 풍부한 새로운 정보 techniqu를 사용하여 얻은되었습니다전자 여기서 설명했다. overexpressing 세포 단백질함으로써, 특정 집단 - 아닌 바이러스성 RNA 모두의는 세포의 여러 지역에 집중하기 위해 강제로 할 수 있습니다. hnRNP A2가에서 siRNA에 의해 소진되면 표현형 유사한 RILP의 overexpression은 얻은 HIV-1-표현, 세포에게 열세 것은 RNA가 가시 MTOC에 축적됩니다. (세포 주변에 세포내 도메인에서 바이러스 게놈 RNA의 릴리스 dynein 중쇄 1 결과 중 p50/Dynamitin overexpression 또는 최저 : 바이러스성 게놈의 RNA는 마이너스 엔드 모터 단백질, dynein을 해제하여 셀 주변에 직면 수 그림 2). 그들은 더 이상 적극적으로 juxtanuclear 도메인에서 현지되기 때문에 더 이상 dynein 모터를 바인딩하지 RILP, RILPΔN의 돌연변이, 분광는 세포질에 (LAMP1로 태그가) endosomes. 이러한 결과는 HIV-1의 게놈 RNA의 특히 플라스틱 인구의 개념을 가리키는 HIV-1 게놈의 여러 수영장바이러스성 복제주기의 때때로 식별 역할과 존재를 알 엔. 이 같은 개념은 이미이 mRNA, 개그 19으로 인코딩된 단백질에 대한 확인되었습니다.
물고기 / 항체의 선택과 예약에 관련된 공동 분석 IF의 용도에 한계가 있습니다. 기본 및 보조 항체, 그들의 농도, 최고의 조합 최적화 (표 1 & 2 참조) 최적화하기 위해 시간이 소요됩니다. 주요 기업 hybridomas 만든이나 생산된 항체가 1시 2분에서 1:2000으로 어디서나 다양하지만, 최상의 결과를 위해 제조 업체에서 제공한 지침에 따라 반드시 농도를 가질 수 있습니다. 항체가 생산되는 호스트도 고려 하에서 촬영되어야합니다. 염소 항체와 혼합 양 또한 교차 종 인식 (데이터가 표시되지 않음)에 의한 높은 배경이 조합 결과로 기본 및 보조 항체에 피해야한다. 알렉사 - 형석 seconda위한공예의 항체는 농도가 집합의 거의 모든 항체에 대해 1:500에서 사용할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된대로 물고기 / 공동 분석한다면 다른 단점은 세포를 고정하고 paraformaldehyde와 세제 (그림 1)를 사용 permeabilized 후에 그것, 정상 상태에서 해당 위치에서 RNA를 캡처합니다.
그러나, 살아있는 세포에서 RNA 이미징은 주로 같은 GFP와 같은 형광 단백질에 의해 태그 바이러스성 RNA의 genomes의 변형을 사용하여 수단 20-22의 다양한 통해 달성되었습니다. 그러나 살아있는 세포에서 RNA의 지방화를 식별하기위한 추가적인 수단이 표면으로 진행합니다. 이 새로운 방법은 시금치 23, SNAP 24 수단, 또는 MTRIP 2로 태그 RNA를 포함. 이러한 기법은 또한 잔기가 현미경에 의해 mRNA를 검출 위해 mRNA에 태그를 추가할 수 있도록 설계되어야 기판을 추가하거나 이전에 세포를 permeabilize하는 요건을 포함하여 몇 가지 단점으로 고생. 실제로 주요 adva이 보고서에 제시된 생선 분석의 ntage는 원시 RNA가 가장 생리학 관련성이 높은 결과로 이어지는 변형이라는 사실에있다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 방법론의 발전에 공헌을위한 실험실의 과거와 현재 회원이 조언은 여기와 앨런 Cochrane에 대한 설명 감사합니다. 라는 프레 이저, Monat 및 MacPherson 경력 상가 지원하는 보건 연구 (CIHR) 박사 원정과 AJM의 캐나다 연구소의 수신자입니다. 이 작품은 CIHR (교부금 # 걸레-56974)에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||
| 18mm coverslips | VWR international | 48380 046 | ||||||||||||||||||
| 16% paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 18814 | Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS | |||||||||||||||||
| Triton-X | OmniPur, EMD Millipore | 9400 | ||||||||||||||||||
| Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche Group | D6294-02 | ||||||||||||||||||
| DIG RNA Labelling Mix | Roche Group | 11277073910 | ||||||||||||||||||
| Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | ||||||||||||||||||
| Quick Spin Columns | Roche Group | 11814427001 | ||||||||||||||||||
| DNase I | Invitrogen | 18047-019 | ||||||||||||||||||
| 1X DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | ||||||||||||||||||
| Formamide | EMD Millipore | FX0420-8 | ||||||||||||||||||
| tRNA | Invitrogen | 15401-021 | ||||||||||||||||||
| RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | ||||||||||||||||||
| Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche Group | 1768506 | ||||||||||||||||||
| Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | ||||||||||||||||||
| Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | ||||||||||||||||||
| Microslides | VWR international | 48300-047 | ||||||||||||||||||
| Immunomount | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9990402 | ||||||||||||||||||
| Table 1. Identification of specific reagents and equipment | ||||||||||||||||||||
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| Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations | ||||||||||||||||||||
References
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