Summary
Флуоресценции
Protocol
1. Подготовка зонда
- Дайджест 1 мкг в векторном транскрипции пробирке, ПКС (+) пол 236nt 9 с Kpn1 фермента при 37 ° С в течение 1 часа и запустить продукт линеаризованной ДНК в агарозном геле. Фрагмент должна быть около 2500 базисных пунктов.
- Вырезать фрагмент из геля и очищают использовании Roche Micro элюировать гель Добыча Kit (все реагенты, используемые перечислены в Таблице 1). Выполните окончательное элюирование в 30 мкл буфера для элюции. Выполните 5 мкл продукта на агарозном геле для проверки очистки.
- Смешайте в пробирке транскрипции реакции (см. рецепт ниже), используя Рош DIG РНК маркировке комплекта и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
В ответ транскрипции пробирке:
| Линеаризованной ДНК | 23 мкл |
| 1X DIG РНК маркировке смеси (Roche) | 4 мкл |
| 1X Траnscription буфер | 8 мкл |
| 20U РНКазы OUT | 1 мкл |
| 80У Т7 РНК-полимеразы | 4 мкл |
| Общий | 40 мкл |
- Добавить 228 U из ДНКазы I и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
- Остановить реакцию добавлением EDTA рН от 8,0 до конечной концентрации 20 мМ.
- Очисти реакции с помощью быстрого Столбцы Спин от Roche, указанных изготовителем.
- Очистите датчик от осадков с 1/10 объема DEPC обработанных 3М NaOAc рН 5,2 и 2,5 объемов ледяной 95% этанола. Смешать и инкубировать при температуре -80 ° C в течение 30 минут, чтобы за одну ночь.
- Центрифуга зонда в течение 15 мин при 4 ° С на 15000 х г.
- Удалить супернатант и промыть осадок в ледяной 70% этанола. Центрифуга в течение 5 мин при 4 ° C при 15000 х г.
- Удалить супернатант и высушите осадок. Ресуспендируют гранул в 50 мкл WВодный (ДНКазы / РНКазы бесплатно), содержащей 10 U Invitrogen РНКазы OUT.
- Оценка концентрации зонда спектрофотометрически (мера РНК при 260 нм), и разбавить до концентрации 5 нг / мкл. Хранить в аликвоты при -20 ° С для краткосрочного использования или -80 ° C для длительного хранения. Рекомендуется выполнять в том сравнений анализ так сохранения аликвоту для этого.
2. Сотовые фиксации
- Это изначально важно семена прилипшие клетки на необработанные, стерильные покровные стекла, так что окончательный слияния на сбор составляет примерно 70-80%. Для не прилипшие клетки растут как обычно, и когда будете готовы к сбору, инкубировать их покровные, которые были обработаны с 0,01% в / о поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, Inc) в течение 1 часа. Для типичного 12-и полистирол культуре ткани пластины (3,8 см 2), 150 000 клеток (например, HeLa) высевают на 24 часов до трансфекции. Номера прилипшие клетки могут быть инфицированы или трансфекции, как обычно, и позволила объявлениеЗдесь в стеклянной крышкой скользит перед фиксацией 3.
- Откажитесь от средств массовой информации и промыть клетки 1X фосфатном буферном растворе, подготовленный в дистиллированной воде (DPBS) в течение 1 мин. Диэтилпирокарбонатом (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc), обработанные 1X PBS также могут быть использованы, однако необработанные PBS не может, как она может содержать РНКазы ферментов.
- Откажитесь от PBS и добавить 4% параформальдегида, достаточно, чтобы покрыть клетки полностью. Выдержите в течение 15-20 мин.
- Откажитесь от paraformaldeyhyde и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин.
- Откажитесь от DPBS и добавить 0,1 М глицин (растворяется в 1X DPBS). Инкубировать 10 мин.
- Откажитесь от глицина и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин.
- Откажитесь от DPBS и добавить 0,2% Triton-X (1X, растворенных в DPBS). Выдержите в течение 5-10 мин. Если окрашивания ядрышек или ядерные белки оболочки, permeabilize с Тритон Х-100 не более чем на 5 минут или белка локализация станет расплывчатым.
- Отменить Тритон Х-100 и мыть один раз в1X DPBS в течение 1 мин.
- Для длительного хранения, заменить PBS с 70% этанола и хранят при температуре 4 ° C в течение четырех месяцев. Кроме того, еще раз промыть с 1X DPBS и перейти на рыбу.
3. Флуоресценции в гибридизация (FISH)
- Если покровные хранились в этанол, заменить этиловый спирт с 1X DPBS и позволяют клеткам увлажняет в течение 30 мин. Регидратации можно сделать на ночь, если покровные хранятся при температуре 4 ° C.
- Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин.
- Подготовка слайдов для инкубации на покровные, заботясь, чтобы очистить и маркировать их хорошо.
- Для 18мм покровное, добавить 50 мкл ДНКазы решение (25 ЕД / покровное, имеющиеся в продаже) на слайде. Добавить покровное, будучи уверенным, чтобы поместить его клетку вниз, и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин.
- Добавить 50 мкл смеси гибридизации (см. рецепт ниже) на покровное наслайдов и инкубировать стороны покровного ячейку вниз в течение 16-18 часов при температуре 42 ° C. Инкубационный должны быть выполнены в лоток, содержащий 50% формамида, 2X ГНПП смеси (12,5 мл деионизованной формамида, 2,5 мл 20х ГНПП, 10 мл воды).
Гибридизация Mix (для одного покровное, 50 мкл):
| Количество акций | Материал (в конечной концентрации) |
| 25 мкл | Формамид, 50% (деионизированной, любой источник) |
| 5 мкл (10 мг / мл) | тРНК, 1 мг / мл (Sigma-Aldrich, Inc) |
| 5 мкл (20х) | ГНПП, 2X |
| 5 мкл (в 50 раз) | Denharts, 5X |
| 0,125 мкл (5 единиц) | РНКазы OUT |
| 5 мкл (25 нг 5 нг / мкл) | Зонд |
| 5 мкл | H 2 O DEPC, чтобы сделать окончательныйОбъем 50 мкл |
- Инкубируйте покровные клетки вниз в 50 мкл 50% формамид (разводится в 1X DPBS) в течение 15 мин при 42 ° C.
- Вымойте покровные дважды в 2х ГНПП путем инкубации их клетки вниз в 50 мкл 2х ГНПП (20X ГНПП разводят в 1X DPBS) в течение 5 минут каждый при 42 ° C.
- Промойте в покровных 1X DPBS в течение 1 мин.
4. Окрашивание иммунофлуоресценции
- Блок покровные, размещая их клетки вниз в 50 мкл 1X Roche блокирование решения (10X Roche блокирующий раствор разводят в 1X DPBS) в течение 30 мин.
- Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл первичных антител решение в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Anti-DIG антител следует развести по направлению производителя в 1X блокирование решения. Если другие антитела, которые используются для окрашивания белков, они могут быть добавлены в правильной концентрации при условии, что все антитела, используемые, полученных из различных спецификации хостх годов.
- Вымойте покровные в течение 10 мин в 1X DPBS.
- Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл вторичных решение антител в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Alexa Fluor-конъюгированных антител (Invitrogen) могут быть использованы для создания цветовой гаммы и используются в 1:500 в блокирующем растворе 1X, 1X DPBS.
- Вымойте покровные два раза по 10 минут в каждом из 1X DPBS.
- Высушите стороны покровные клетки на ватмане. Будьте уверены, чтобы покрыть покровные, чтобы избежать воздействия света и отбеливания.
- Когда вся жидкость испарилась, смонтировать покровные на свежие слайды, используя 8 мкл ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Мягко нажмите вниз покровное для устранения пузырьков воздуха.
- Применение лака для ногтей по краям покровного стекла, чтобы закрепить его на месте.
- Визуализация РНК и белков микроскопии также решающее значение для успеха этого метода. Настройки на микроскоп использовали могут способствовать или препятствовать визуализации, так что ключ, которыйНастройки на микроскопе правильно установить и быть последовательными от образца к образцу в данном эксперименте. Подробную информацию о настройках микроскопа, оптики и антител комбинации см. ссылки 1,10.
5. Представитель Результаты
Например вирусной РНК окрашивания можно увидеть на рисунке 2. Вирусной РНК ВИЧ-1 видно по всей цитоплазме отображается диффузно по большей части, хотя и небольшой цитоплазматических punctae не являются редкостью. Специфика можно увидеть, сравнив положительных клеток в окружающие клетки, которые не проявляют флуоресценции. Как уже упоминалось во введении, ВИЧ-1, что не хватает регуляторный белок Rev производит РНК, которая сохраняется в ядре: это может быть представлен в виде ярких сигнала в ядре, а также отсутствие сигнала флуоресценции РНК в цитоплазме. Избыточная экспрессия клеточных белков также может смещения распределения ВИЧ-1 РНК вируса. На рисунке 2 11 или N-терминальной удален RILP (RILPN) 11, и белки, которые сталкиваются с функцией динеин двигателя [например p50/dynamitin 1 12], мешают нормальной стационарной локализации вирусной РНК генома, как это определено FISH анализ RILP выражение приводит к повторной локализации вирусной РНК геномная к организации микротрубочек центр (КТВМ) 13;. RILPN рассеивает поздние эндосомы в Цитоплазма в связи с невозможностью привязки к P150 Клееный из динеин автотранспортного комплекса 14 и p50/dynamitin блоков большой субъединицы динеин двигателя и выбросы поздние эндосомы, а также вирусные и геномной РНК ВИЧ-1, структурные белки периферии клетки 1 (рис. 2). манипуляции стационарного локализации вирусной РНК генома, основной вклад в заразностивирусных частиц, будет иметь решающее значение для последующего развития терапии. В наших руках, вирусная РНК появляется в клетке уже 3 часа после трансфекции и инфекции 10 и становится легко наблюдать на этой рыбы технику на 12 часов.
Рисунок 1. Блок-схема протокола FISH / IF совместного анализа. Клетки, выращенные на покровных и затем фиксировали параформальдегида. Лечение глицина и Triton-X осуществляется до клетки, либо используются для FISH / IF или хранятся в 70% этанола для хранения. Клетки для обезвоженной хранения регидратации в 1X DPBS (DEPC обработанных PBS), прежде чем перейти к FISH / IF. Клетки обрабатывали ДНКазы I и оставляют на ночь для гибридизации с зондом. После гибридизации завершения клетки промывают формамида, а также с ГНПП, а окончательное 1X DPBS полоскания. Блокирование решение применяется к клеткам, а затем инкубации спервичных антител. После мытья вторичных антител применяются. Два последних моет в 1X DPBS завершения процедуры окрашивания, где на покровные сушат и установлены на салазках для работы с изображениями.
Рисунок 2. Представитель результатов с помощью FISH / IF совместного анализа.) ВИЧ-1 трансфекции в клетки HeLa, а в некоторых случаях с конструкциями, которые вызывают гиперэкспрессии клеточных белков (RILP, p50/Dynamitin и RILPΔN (амино-терминал удаление мутант)) . FISH / IF совместного анализа была выполнена: РНК, выявленных в зеленой либо G3BP или LAMP1 (красный), чтобы отличить. Б) ВИЧ-1, выражается в HeLa и собранные в различные моменты времени. Вирусные РНК выражение отслеживается в зеленый, а клеточный белок, hnRNP A1, окрашивается в красный цвет. Размер баров 10 мкм. Изображения, измененные из ссылки 1 (выбрать данные из панелей; RILP, p50/Dynamitin и RILP deltaN)и 17 (группа В).
Discussion
FISH / IF совместного анализа является надежным методом для визуализации вирусной РНК в клетках, которая в настоящее время уточняется 9,15,16. В течение нескольких лет, мы разработали более совершенный метод окрашивания для РНК. Этот метод может быть использован на широкий спектр типов клеток при условии зонд специфичен для РНК-мишени 17. Называя зонд с DIG, мы способны визуализировать РНК простым окрашиванием. При окрашивании на РНК и белков в сочетании, FISH / IF совместного анализа стать мощным инструментом для наблюдения клеточных структур и белков / РНК локализации.
Специфика выявления РНК достаточно высок. Это показано на рисунке 2. В некоторых из оригинальных работ, которые направлены на вирусную РНК геномная локализация, FISH установлено, что отсутствие Rev ловушку вирусной РНК в ядре 18. Так как эта, обильная новая информация о вирусных локализации геномной РНК была получена использованием techniquэлектронной изложены здесь. По гиперэкспрессией белка клеточного, конкретных групп населения, и не все из вирусной РНК может быть принужден к локализации в различных регионах ячейки. RILP гиперэкспрессия, который похож на фенотип, полученные при hnRNP A2 исчерпывается миРНК ВИЧ-1-экспрессирующие клетки 13, приводит к тому, РНК заметно накапливаться в КТВМ. Геномной РНК вируса могут быть прижаты к периферии клетки, отключив минус-концу белка двигателя, динеин: p50/Dynamitin гиперэкспрессия или нокдаун динеин тяжелой цепи 1 приводит к освобождению вирусного генома РНК из внутриклеточных доменов сотовой периферии ( Рисунок 2). Мутант RILP, RILPΔN, которые уже не связывает динеин двигателя, рассеивается эндосомы (помечены LAMP1) в цитоплазму, потому что они больше не активно локализованы на juxtanuclear области. Эти результаты указывают на понятие пластикового населения РНК ВИЧ-1 генома и, в частности, что различные бассейны ВИЧ-1 геномаРНК существует с иногда идентифицировать роль в репликации вируса. Эти же понятия уже определены для белка, кодируемого этой мРНК, Gag 19.
Существуют ограничения на использование FISH / IF совместного анализа, связанные с выбором антител и доступность. Оптимизация лучшее сочетание первичных и вторичных антител и их концентрации, потребуется время, чтобы оптимизировать (см. Таблицу 1 и 2). Антитела из гибридом, или производятся крупными компаниями может иметь концентрациях, которые варьироваться от 1:2 до 1:2000, но обязательно следуйте указаниями производителя для достижения наилучших результатов. Хозяина, в котором антитела производятся также должны быть приняты в стадии рассмотрения. Смешивание овец с козьими антителами также следует избегать в начальной и средней антител, так как это сочетание приводит к высоким фоном из-за перекрестного признания видов (данные не представлены). Для Alexa Fluor-secondaры антител, концентрации могут быть использованы при 1:500 практически для любых антител в наборе. Другой недостаток FISH / IF совместного анализа, как описано в настоящем докладе, это отражает РНК в месте его нахождения в стационарном состоянии, после того, как клетки были зафиксированы и проницаемыми использованием параформальдегид и моющих средств (рис. 1).
Тем не менее, РНК изображений в живых клетках было достигнуто с помощью различных средств 20-22, в основном используя вариации вирусных геномов РНК, помеченные флуоресцентными белками, такими как GFP. Тем не менее, дополнительные средства для выявления РНК локализация в живых клетках продолжать поверхность. Эти новые методы включают пометки РНК с помощью шпината 23, SNAP 24, или MTRIP 2. Эти методы также страдает от нескольких недостатков, включая требования к permeabilize клетки перед добавлением субстратов или часть должна быть разработана, чтобы отметить мРНК в целях обнаружения мРНК с помощью микроскопа. Действительно, основные ADVAntage из FISH анализа, изложенные в этом докладе, заключается в том, что родной РНК неизменной, ведущие к наиболее физиологически релевантные результаты.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность прошлого и настоящего членов лаборатории за вклад в развитие методологии, изложенной здесь и Алан Кокрановского за советом. LA является получателем канадских институтов здравоохранения (CIHR) исследовательских стипендий и AJM поддерживается премии карьеры Фрейзер, Monat и Макферсона. Работа выполнена при поддержке гранта от CIHR (грант № СС-56974).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||
| 18mm coverslips | VWR international | 48380 046 | ||||||||||||||||||
| 16% paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 18814 | Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS | |||||||||||||||||
| Triton-X | OmniPur, EMD Millipore | 9400 | ||||||||||||||||||
| Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche Group | D6294-02 | ||||||||||||||||||
| DIG RNA Labelling Mix | Roche Group | 11277073910 | ||||||||||||||||||
| Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | ||||||||||||||||||
| Quick Spin Columns | Roche Group | 11814427001 | ||||||||||||||||||
| DNase I | Invitrogen | 18047-019 | ||||||||||||||||||
| 1X DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | ||||||||||||||||||
| Formamide | EMD Millipore | FX0420-8 | ||||||||||||||||||
| tRNA | Invitrogen | 15401-021 | ||||||||||||||||||
| RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | ||||||||||||||||||
| Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche Group | 1768506 | ||||||||||||||||||
| Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | ||||||||||||||||||
| Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | ||||||||||||||||||
| Microslides | VWR international | 48300-047 | ||||||||||||||||||
| Immunomount | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9990402 | ||||||||||||||||||
| Table 1. Identification of specific reagents and equipment | ||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||
| Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations | ||||||||||||||||||||
References
- Lehmann, M. Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning. J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).
- Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition. PLoS One. 6, e19727 (2011).
- Abrahamyan, L. G. Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA. J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).
- Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1. Retrovirology. 7, 41-41 (2010).
- Vercruysse, T. Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer. RNA Biol. 8, 316-324 (2011).
- Cullen, B. R. Nuclear mRNA export: insights from virology. Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).
- Cmarko, D. Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs. J Virol. 76, 10473-10484 (2002).
- Ajamian, L. Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation. RNA. 14, 914-927 (2008).
- Beriault, V. A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization. J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).
- Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. HIV-1 remodels the nuclear pore complex. J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).
- Jordens, I. The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).
- Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells. J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).
- Levesque, K. Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly. Traffic. 7, 1177-1193 (2006).
- Rocha, N. Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning. J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).
- Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles. J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).
- Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region. Genes Dev. 18, 23-34 (2004).
- Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression. J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).
- Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA. Nature. 338, 254-257 (1989).
- Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag. AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).
- Molle, D. Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress. J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses. J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333, 642-646 (2011).
- Eckhardt, M. A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions. PLoS One. 6, e22007 (2011).
