Summary
Une fluorescence
Abstract
Les virus qui infectent les cellules de susciter des modifications spécifiques à des fonctions cellulaires normales qui servent à détourner l'énergie et des ressources pour la réplication virale. De nombreux aspects de la fonction des cellules d'accueil sont réquisitionnés par des virus, habituellement par l'expression de produits de gènes viraux que les protéines de la cellule hôte et de recruter de machineries. En outre, les virus organites ingénieur membranaires spécifiques ou étiquette sur au vésicules mobiles et des protéines à moteur à cibler les régions de la cellule (cours de l'infection de novo, virus coopter protéines moteur moléculaires pour cibler le noyau; plus tard, pendant l'assemblage du virus, ils se détournent cellulaire mécanismes qui aideront à l'assemblage des virus). Moins on entend sur la façon dont les virus, en particulier ceux dont les génomes ARN, de coordonner le trafic intracellulaire de protéines et de composants d'ARN et de la façon dont ils obtenir l'assemblage des particules infectieuses à des loci spécifiques dans la cellule. L'étude de la localisation d'ARN a commencé dans les travaux antérieurs. Développer em eucaryotes inférieursbryos et les cellules neuronales fourni d'importantes informations biologiques, et a également souligné l'importance de la localisation d'ARN dans la programmation des cascades d'expression des gènes. L'étude dans d'autres organismes et des systèmes cellulaires a donné des informations importantes similaire. Les virus sont des parasites obligatoires et doivent utiliser leurs cellules hôtes pour se répliquer. Ainsi, il est essentiel de comprendre comment les virus à ARN diriger leurs génomes ARN du noyau, à travers le pore nucléaire, à travers le cytoplasme et sur l'un de ses destinations finales, dans les particules virales descendance 1.
POISSON sert comme un outil utile pour identifier les changements dans l'état d'équilibre de localisation de l'ARN viral. Lorsqu'il est combiné avec l'immunofluorescence (IF) analyse 22, FISH / SI co-analyses fourniront des renseignements sur la co-localisation des protéines avec l'ARN viral 3. Cette analyse fournit donc un bon point de départ pour tester les interactions ARN-protéine par des techniques biochimiques ou biophysiques d'autresessais 4,5, étant donné que la co-localisation par lui-même n'est pas assez de preuves pour être certain d'une interaction. En étudiant la localisation d'ARN viral en utilisant une méthode de ce genre, des informations abondantes a été acquise sur les deux événements viraux et cellulaires de trafic d'ARN 6. Par exemple, le VIH-1 produit des ARN dans le noyau des cellules infectées, mais l'ARN est seulement traduit dans le cytoplasme. Quand on protéine clé virale est manquant (Rev) 7, POISSON de l'ARN viral a révélé que le bloc à la réplication virale est due à la rétention des VIH-1 ARN génomique dans le noyau 8.
Ici, nous présentons la méthode pour l'analyse visuelle des ARN génomique viral in situ. La méthode permet l'utilisation d'une sonde marquée ARN. Cette sonde est conçue pour être complémentaire de l'ARN génomique viral. Au cours de la synthèse in vitro de la sonde ARN antisens, le ribonucléotide qui est modifié avec de la digoxigénine (DIG) est inclus dans un essai in vitro transcription réactionnel. Une fois la sonde s'est hybridée à l'ARNm cible dans les cellules, les étapes ultérieures de l'étiquetage d'anticorps (figure 1) permettra de connaître la localisation de l'ARNm ainsi que des protéines d'intérêt lors de l'exécution FISH / SI.
Protocol
1. Préparation de la sonde
- Digest 1 ug du vecteur dans la transcription in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 avec Kpn1 enzyme à 37 ° C pendant 1 heure et utiliser le produit ADN linéarisé sur un gel d'agarose. Le fragment doit être environ 2500 pb.
- Couper le fragment du gel et de purifier l'aide de la Roche Micro Eluer Gel Extraction Kit (tous les réactifs utilisés sont répertoriés dans le tableau 1). Effectuez l'élution finale dans 30 ul de tampon d'élution. Exécuter 5 ul du produit sur un gel d'agarose pour vérifier la purification.
- Mélanger une réaction de transcription in vitro (voir recette ci-dessous) en utilisant la Roche DIG RNA kit de marquage et incuber à 37 ° C pendant 2 heures.
En réaction de transcription in vitro:
| Linéarisé ADN | 23 pl |
| 1X DIG ARN étiquetage mélange (Roche) | 4 pl |
| 1X Tratampon nscription | 8 pl |
| 20U RNase OUT | 1 pl |
| 80U T7 RNA polymérase | 4 pl |
| Total | 40 pl |
- Ajouter 228 U de DNase I et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
- Arrêter la réaction par addition d'EDTA pH 8,0 à une concentration finale de 20 mM.
- Purifier la réaction en utilisant les colonnes de centrifugation rapide de Roche comme spécifié par le fabricant.
- Purifier la sonde par précipitation avec un pH traitée au DEPC 1/10 du volume 3M NaOAc 5,2 et 2,5 volumes d'éthanol glacé à 95%. Mélanger et incuber à 80 ° C pendant 30 min à une nuit.
- Centrifuger la sonde pendant 15 min à 4 ° C à 15.000 x g.
- Eliminer le surnageant et laver le culot dans glacée éthanol à 70%. Centrifuger de nouveau pendant 5 min à 4 ° C à 15.000 x g.
- Eliminer le surnageant et sécher le culot. Reprendre le culot dans 50 ul water (DNase / RNase) contenant 10 U Invitrogen RNase OUT.
- Estimer la concentration de la sonde par spectrophotométrie (ARN mesure à 260 nm), et diluer à une concentration de 5 ng / ul. Magasin en aliquots à -20 ° C pour usage à court terme, ou à -80 ° C pour stockage à long terme. Il est recommandé d'effectuer des comparaisons inter dosage afin de conserver une partie aliquote de cette.
2. La fixation de cellules
- Il est d'abord important de cellules adhérentes de semences non traitées, SUR DES lamelles de verre stériles de sorte que la confluence finale à la récolte est d'environ 70-80%. Pour les cellules non adhérentes, de grandir normalement et lorsqu'il est prêt à recueillir, les incuber avec des lamelles qui ont été traités avec 0,01% p / v de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, Inc) pendant 1 heure. Pour un type de 12 et plaque de culture tissulaire en polystyrène (3,8 cm 2), 150.000 cellules HeLa (par exemple) sont étalées à 24 heures avant la transfection. Les cellules non adhérentes peuvent être infectées ou transfectées comme d'habitude et autorisés à adici pour lamelles de verre avant de fixation 3.
- Jeter les médias et laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X préparée dans de l'eau bidistillée (DPBS) pendant 1 min. Diéthylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc)-traité 1X PBS peuvent également être utilisés, mais non traitée PBS ne peut pas car il peut contenir des enzymes de RNase.
- Jeter le PBS et ajouter du paraformaldéhyde à 4%, assez pour couvrir les cellules complètement. Incuber pendant 15-20 min.
- Jeter le paraformaldeyhyde et laver les cellules avec 1X DPBS pendant 1 min.
- Jeter les DPBS et ajouter 0,1 M de glycine (dissous dans 1X DPBS). Incuber pendant 10 min.
- Jeter la glycine et laver les cellules avec 1X DPBS pendant 1 min.
- Jeter les DPBS et ajouter 0,2% de Triton-X (dissous dans 1X DPBS). Incuber pendant 5-10 min. Si la coloration pour les protéines d'enveloppe nucléolaires ou nucléaire, perméabiliser avec du Triton X-100 pour pas plus de 5 min ou la localisation de la protéine deviendra diffus.
- Jeter Triton X-100 et laver une fois dans1X DPBS pendant 1 min.
- Pour stockage à long terme, remplacer PBS avec 70% d'éthanol et conserver à 4 ° C pour un maximum de quatre mois. Sinon, laver une fois de plus avec 1X DPBS et procéder à la FISH.
3. L'hybridation fluorescente in situ (FISH)
- Si les lamelles ont été stockées dans de l'éthanol, l'éthanol remplace avec 1X DPBS et permettre aux cellules de se réhydrater pendant 30 min. La réhydratation peut se faire du jour au lendemain si les lamelles sont conservés à 4 ° C.
- Laver les lamelles avec 1X DPBS pendant 1 min.
- Préparez des diapositives d'incuber les lamelles sur, en prenant soin de nettoyer et de les étiqueter ainsi.
- Pour une lamelle 18mm, ajouter 50 ul de solution de DNase (25 unités / lamelle, disponibles dans le commerce) à la diapositive. Ajouter la lamelle, en étant sûr de placer côte à cellule, il baisse, et il incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les lamelles avec 1X DPBS pendant 1 min.
- Ajouter 50 ul mélange d'hybridation (voir recette ci-dessous) par la lamelle surune diapositive et incuber le côté pile lamelle vers le bas pour 16-18 h à 42 ° C. L'incubation doit être effectuée dans un bac contenant un 50% de formamide, 2X SSPE mélange (12,5 ml de formamide désionisée, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml d'eau).
Mélange d'hybridation (pour une lamelle, 50 pl):
| Montant de stock | Matériel (à une concentration finale) |
| 25 pl | Le formamide, 50% (désionisée; n'importe quelle source) |
| 5 pl (de 10 mg / ml) | ARNt, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) |
| 5 pi (de 20X) | SSPE, 2X |
| 5 pi (de 50X) | Denharts, 5X |
| 0,125 pi (5 unités) | RNase OUT |
| 5 pi (25 ng de 5 ng / pl) | Sonde |
| 5 pl | H 2 O DEPC, pour la finalevolume de 50 ul |
- Côté Incuber cellule lamelles dans du formamide à 50 50% ul (dilué dans du DPBS 1X) pendant 15 min à 42 ° C.
- Laver les lamelles à deux reprises en 2X SSPE en incubant les cellules vers le bas côté dans 50 ul SSPE 2X (20X SSPE dilué dans 1X DPBS) pendant 5 min chacune à 42 ° C.
- Laver les lamelles en 1X DPBS pendant 1 min.
4. Marquage en immunofluorescence
- Bloquer les lamelles en les plaçant côte cellule vers le bas dans 50 1X solution ul Roche blocage (10X solution Roche blocage dilué dans 1X DPBS) pendant 30 min.
- Incuber le côté pile des lamelles vers le bas dans 50 ul de solution d'anticorps primaire pendant 1 heure à 37 ° C. Anticorps anti-DIG doit être dilué selon la direction du fabricant de 1X solution de blocage. Si d'autres anticorps sont utilisés pour colorer les protéines, ils peuvent être ajoutés à la bonne concentration pour autant que tous les anticorps utilisés sont tirés de spec hôte différents.
- Laver les lamelles pendant 10 min dans 1X DPBS.
- Incuber le côté pile des lamelles vers le bas dans 50 ul de solution d'anticorps secondaire pendant 1 heure à 37 ° C. Alexa Fluor-anticorps conjugués (Invitrogen) peut être utilisé pour générer une gamme de couleurs et sont utilisés à 1:500 dans une solution de blocage, les 1X 1X DPBS.
- Laver les lamelles à deux reprises pendant 10 minutes dans chacune des DPBS 1X.
- Sécher le côté pile des lamelles sur papier Whatman. Soyez sûr de couvrir les lamelles pour éviter l'exposition à la lumière et de blanchiment.
- Une fois tout le liquide est évaporé, monter les lamelles sur des lames de frais en utilisant 8 ImmunoMount ul (Thermo Scientific, Inc). Tapoter doucement le bas de la lamelle à éliminer les bulles d'air.
- Appliquer le vernis à ongles sur les bords de la lamelle pour le fixer en place.
- La visualisation de l'ARN et des protéines par des techniques de microscopie est également essentielle à la réussite de cette technique. Réglages sur le microscope utilisé peut aider ou entraver la visualisation de sorte qu'il est essentiel que leparamètres sur le microscope être réglé correctement et être cohérent d'un échantillon à l'autre dans une expérience donnée. Pour les réglages détaillés microscopie, optique et des combinaisons d'anticorps s'il vous plaît voir les références 1,10.
5. Les résultats représentatifs
Un exemple de l'ARN viral coloration peut être vu dans la figure 2. L'ARN viral pour le VIH-1 est vu à travers le cytoplasme affiché diffuse, pour la plupart, bien que petite punctae cytoplasmique ne sont pas rares. La spécificité peut être vu en comparant les cellules positives pour les cellules environnantes qui affichent aucune fluorescence. Comme mentionné dans l'introduction, le VIH-1 qui manque de la protéine régulatrice Rev produit un ARN qui est retenu dans le noyau: ce peut être visualisé comme un signal lumineux dans le noyau, et un manque d'ARN intensité du signal fluorescent dans le cytoplasme. Surexpression de protéines cellulaires est également capable de décaler la distribution de l'ARN du VIH-1 virales. Dans la figure 2 11 ou N-terminale supprimé RILP (RILPN) 11, et les protéines qui interfèrent avec la fonction motrice dynéine [par exemple p50/dynamitin 1, 12], interférer avec la normale l'état d'équilibre de localisation de l'ARN génomique viral tel que déterminé par des analyses FISH expression RILP conduit à re-localisation de l'ARN génomique viral à l'organisation des microtubules centre (MTOC) 13;. RILPN disperse les endosomes tardifs au sein de la cytoplasme en raison de l'incapacité de se lier à p150 collé du complexe dynéine moteur 14 et des blocs p50/dynamitin la sous-unité de la grande dynéine moteur et communiqués endosomes tardifs, mais aussi la génomique viral ARN-VIH-1 des protéines structurales de la périphérie de la cellule 1 (Figure 2). La manipulation de la localisation l'état d'équilibre de l'ARN génomique viral, un facteur clé de l'infectiosité desparticules virales, serait la clé de l'élaboration éventuelle d'agents thérapeutiques. Dans nos mains, l'ARN viral apparaît dans la cellule dès 3 heures post-transfection et l'infection devient 10 et facilement observable par cette technique FISH par 12 heures.
Figure 1. Diagramme du protocole de FISH / SI co-analyses. Les cellules sont cultivées sur des lamelles, puis fixées avec du paraformaldéhyde. Traitements de la glycine et de Triton-X sont effectuées avant que les cellules sont soit utilisés pour FISH / FI ou stockés dans l'éthanol à 70% pour le stockage. Les cellules déshydratées pour le stockage sont réhydratés dans du DPBS 1X (traitée au DEPC PBS) avant de continuer vers FISH / SI. Les cellules sont traitées avec de la DNase I et laissé une nuit à s'hybrider avec la sonde. Une fois terminée l'hybridation, les cellules sont lavées avec du formamide, ainsi qu'avec SSPE, et un 1X finales DPBS rinçage. Solution de blocage est appliqué à des cellules, suivie d'une incubation avecles anticorps primaires. Après lavage, les anticorps secondaires sont appliquées. Deux derniers lavages dans 1X DPBS compléter la procédure de coloration où sur les lamelles sont séchées et montées sur des lames pour l'imagerie.
Figure 2. Les résultats représentatifs en utilisant FISH / SI co-analyses. A) du VIH-1 est transfecté dans des cellules HeLa et dans certains cas, avec des constructions qui causent la surexpression de protéines cellulaires (RILP, p50/Dynamitin et RILPΔN (une délétion amino-terminale mutant)) . FISH / SI co-analyses ont été effectuées: l'ARN est identifié en vert avec soit G3BP ou LAMPE1 (rouge) de se différencier. B) le VIH-1 est exprimé dans des cellules HeLa, et recueillis à différents moments. Expression de l'ARN viral est suivi en vert tandis que la protéine cellulaire, hnRNP A1, est coloré en rouge. Taille barres sont 10 um. Images modifiées à partir de références (1 chiffres sélectionnez à partir du panneau A; RILP, p50/Dynamitin, et RILP DELTAN)et 17 (partie B).
Discussion
FISH / SI co-analyses est une méthode fiable de visualiser l'ARN viral dans les cellules qui a été affiné 9,15,16. Au cours de plusieurs années, nous avons développé une méthode raffinée de la coloration de l'ARN. Cette technique peut être utilisée sur un large éventail de types de cellules à condition que la sonde est spécifique à l'ARN cible 17. Par marquage de la sonde avec DIG, nous sommes capables de visualiser des ARN par coloration simple. Lorsque la coloration de l'ARN et des protéines d'autres sont combinés, FISH / SI co-analyses deviennent un outil puissant d'observer des structures cellulaires et protéine / ARN de localisation.
La spécificité de la détection de l'ARN est assez élevé. Ceci est illustré dans la figure 2. Dans certains de l'œuvre originale qui mettait l'accent sur la génomique de localisation d'ARN viral, POISSON établi que le manque de Rev piégé l'ARN viral dans le noyau 18. Depuis cela, abondante de nouvelles informations sur la localisation génomique virale ARN a été obtenu en utilisant la technique décrites ici. Par protéines cellulaires surexprimant, les populations-et spécifiques pas tous de l'ARN viral peut être forcé à se localiser au niveau de différentes régions de la cellule. Surexpression RILP, qui ressemble le phénotype obtenu lorsque hnRNP A2 est appauvri par des siRNA par le VIH-1-cellules exprimant 13, provoque l'ARN de manière visible s'accumulent à la MTOC. L'ARN viral génomique peut être poussé à la périphérie de la cellule en désactivant la protéine moteur moins-end, la dynéine: la surexpression p50/Dynamitin ou démontable des chaînes lourdes de dynéine 1 résultats dans la libération de l'ARN génomique viral à partir des domaines intracellulaires de la périphérie cellulaire ( Figure 2). Un mutant de RILP, RILPΔN, qui ne se lie plus le moteur dynéine, disperse les endosomes (marqués par LAMPE1) dans le cytoplasme, car ils ne sont plus activement localisés à des domaines juxtanucléaire. Ces résultats soulignent la notion d'une population en plastique du VIH-1 ARN génomique et en particulier, que les différents bassins du VIH-1 génomiqueARN existent avec des rôles parfois identifiables dans le cycle de réplication virale. Ces mêmes notions ont déjà été identifiés pour la protéine codée par cet ARNm, Gag 19.
Il ya des limites à l'utilisation de FISH / SI co-analyses qui sont relatifs au choix d'anticorps et de disponibilité. L'optimisation de la meilleure combinaison d'anticorps primaires et secondaires, et leurs concentrations, prendra du temps pour optimiser (voir le tableau 1 & 2). Anticorps faites à partir d'hybridomes ou produites par les grandes entreprises peuvent avoir des concentrations qui varient de 1:2 à n'importe 1:2000, mais assurez-vous de suivre les directives fournies par le fabricant pour obtenir les meilleurs résultats. L'hôte dans lequel l'anticorps est produit doivent également être pris en considération. Moutons de mélange avec des anticorps de chèvre doit également être évitée dans les anticorps primaires et secondaires, il en résulte combinaison en arrière-plan haute en raison de contre-reconnaissance des espèces (données non présentées). Pour Alexa Fluor-secondaanticorps ry, la concentration peut être utilisé à 1:500 pour presque tous les anticorps dans l'ensemble. L'autre inconvénient de FISH / SI co-analyses tel que décrit dans le présent rapport est-il capte les ARN à son emplacement à l'état stationnaire, après que les cellules ont été fixées et perméabilisées avec du paraformaldéhyde et de détergent (figure 1).
Toutefois, l'ARN dans les cellules vivantes d'imagerie a été obtenu grâce à une variété de moyens 20-22, la plupart du temps en utilisant des variations de génomes ARN viral qui sont marqués par des protéines fluorescentes comme la GFP. Cependant, des moyens supplémentaires afin d'identifier la localisation d'ARN dans les cellules vivantes continuent de faire surface. Ces nouvelles méthodes impliquent des ARN de marquage à l'aide d'épinards 23, 24, SNAP ou mTrip 2. Ces techniques souffrent également de quelques inconvénients, y compris l'obligation de perméabiliser les cellules avant d'ajouter que substrats ou un fragment doit être conçu pour marquer l'ARNm dans le but de détecter l'ARNm par microscopie. En effet, le progrès le grandntage des analyses FISH décrites dans le présent rapport réside dans le fait que le natif d'ARN n'est pas altérée conduisant à des résultats les plus pertinents physiologiquement.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents du laboratoire pour ses contributions à l'élaboration de la méthodologie exposée ici et à Alan Cochrane pour obtenir des conseils. Los Angeles est un bénéficiaire d'une Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC) Bourse de doctorat et de AJM est soutenu par une bourse de carrière du Fraser, Monat et MacPherson. Ce travail est soutenu par une subvention de l'IRSC (subvention n MOP-56974).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||
| 18mm coverslips | VWR international | 48380 046 | ||||||||||||||||||
| 16% paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 18814 | Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS | |||||||||||||||||
| Triton-X | OmniPur, EMD Millipore | 9400 | ||||||||||||||||||
| Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche Group | D6294-02 | ||||||||||||||||||
| DIG RNA Labelling Mix | Roche Group | 11277073910 | ||||||||||||||||||
| Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | ||||||||||||||||||
| Quick Spin Columns | Roche Group | 11814427001 | ||||||||||||||||||
| DNase I | Invitrogen | 18047-019 | ||||||||||||||||||
| 1X DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | ||||||||||||||||||
| Formamide | EMD Millipore | FX0420-8 | ||||||||||||||||||
| tRNA | Invitrogen | 15401-021 | ||||||||||||||||||
| RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | ||||||||||||||||||
| Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche Group | 1768506 | ||||||||||||||||||
| Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | ||||||||||||||||||
| Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | ||||||||||||||||||
| Microslides | VWR international | 48300-047 | ||||||||||||||||||
| Immunomount | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9990402 | ||||||||||||||||||
| Table 1. Identification of specific reagents and equipment | ||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||
| Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations | ||||||||||||||||||||
References
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