Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

doi: 10.3791/4003 Published: November 29, 2012

Summary

Generering induceret pluripotente stamceller (IPSC) linjer producerer linjer af forskellig udviklingspotentiale, selv når de passerer standardtests for pluripotency. Her beskriver vi en protokol til at producere mus der udelukkende kommer fra iPSCs, der definerer de IPSC linjer som besidder fuld pluripotency

Abstract

Produktionen af ​​induceret pluripotente stamceller (iPSCs) fra somatiske celler tilvejebringer et middel til at skabe værdifulde værktøjer til grundforskning og kan også producere en kilde til patient-matchede celler til regenerative terapier. iPSCs kan genereres ved hjælp af flere protokoller og afledt fra multiple cellekilder. Når først er dannet, er iPSCs testet ved anvendelse af en række assays, herunder immunfarvning for pluripotency markører, generering af tre kimlag i embryoide legemer og teratomer, sammenligninger af genekspression med embryonale stamceller (ESC) og produktion af kimære mus med eller uden kimcellelinje bidrag 2 . Vigtigere, IPSC linjer, der passerer disse tests stadig varierer i deres evne til at producere forskellige differentierede celletyper 2. Dette har gjort det vanskeligt at fastslå, hvilke IPSC afledning protokoller, donorcelle kilder eller udvælgelsesmetoder er mest anvendelige til forskellige formål.

Den strengeste testom en stamcellelinje har tilstrækkelig udviklingsmæssige potentiale til at generere alle væv, der er nødvendige for overlevelse af en organisme (betegnet fuld pluripotency) er tetraploid embryo komplementation (TEC) 3-5. Teknisk set TEC involverer elektrofusion af to-celle embryoer til at generere tetraploide (4n) one-celle embryoer, der kan dyrkes in vitro til blastocyst-stadiet 6. Diploide (2n) pluripotente stamceller (f.eks sektorråd eller iPSCs) bliver derefter sprøjtet ind i blastocoel hulrum i tetraploid blastocyst og overføres til en recipient hun for gestation (se figur 1). Den tetraploid komponent i suppleret embryo bidrager næsten helt til extraembryonic væv (placenta, blommesækken), mens de diploide celler udgør embryonet korrekt, hvilket resulterer i et foster der udelukkende kommer fra den injicerede stamcellelinje.

For nylig vi rapporteret afledningen af ​​IPSC linjer, der reproducerbart generere voksne musvia TEC 1. Disse IPSC linier giver anledning til levedygtige hvalpe med en effektivitet på 5-13%, der kan sammenlignes med ESC 3,4,7 og højere end den rapporteret for de fleste andre IPSC linier 8-12. Disse rapporter viser, at direkte omprogrammering kan producere fuldt pluripotente iPSCs der matcher økonomiske og sociale råd i deres udviklingsmuligheder og effektivitet til at generere unger i TEC tests. På nuværende tidspunkt er det ikke klart, hvad der skelner mellem fuldstændig pluripotente iPSCs og mindre potente linjer 13-15. Det er heller ikke klart, hvilken omprogrammering metoder vil producere disse linjer med den højeste effektivitet. Her beskriver vi en metode, der producerer fuldt pluripotente iPSCs og "all-IPSC" mus, som kan være brugbare for efterforskerne, der ønsker at sammenligne pluripotency af IPSC linjer eller fastslå ækvivalensen af ​​forskellige omprogrammering metoder.

Protocol

Denne metode blev anvendt i forskning rapporteret i Boland et al. Nature. 461, 91-96 (2009). En

1. Fremstilling af lentivirus

Denne protokol anvender doxycyclin-inducerbare lentivirale shuttlevektorer, som koder for Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc under kontrol af en tetO responselement. Transgener aktiveres af revers tetracyclin trans-aktiverende protein, rtTAM2.2 16, som inducerer omprogrammering faktor ekspression i nærvær af doxycyclin. Dette system tillader nøje kontrolleret, høj ekspression af omprogrammering faktorer. De lentivirale vektorer, der anvendes her, er selv-inaktiverende og kan således ikke replikere følgende genomisk integration. Dog kræves forsigtighed, når der arbejdes med lentivira og bør udføres i laboratorier i overensstemmelse med BSL2 (USA) og S2 (Europa) standarder.

  1. Optø HEK293T celler og passage mindst en gang før transfection. Cellerne skal holdes på subkonfluerende densitet i HEK medium ved 37 ° C, 5% CO2 i en befugtet miljø. Rutinemæssigt passage celler hver 2. dag med en split forhold på 1:06 til 1:10.
  2. Frø ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 med 25 ml HEK medium. Bruge en T150 for hver lentivirus præparat.
  3. Den følgende dag transficere HEK293T celler ved calciumphosphat-udfældning. (Bemærk: i vores hænder calciumphosphatpræcipitation rutinemæssigt resulterer i 80-90% transfektionseffektivitet, dog kan kationiske lipide transfektionsreagenser såsom Lipofectamine 2000 også anvendes). Forberede to 15 ml koniske rør for hver virus, som skal fremstilles. Mærk rørene "A" og "B". Tube A, 10 ug af hver af: de lentivirale shuttle-vektor koder omprogrammering faktorer (eller rtTAM2.2), de virale pakningsbestanddele vektorer og plasmid koder for det virale kappeprotein, VSVG. Tilføj 186 gl 2 M CaCl 2 til Tube A, og rumfanget bringes op på 1,5 ml med sterilt H 2 O. Tube B: 1,5 ml 2x HBS (præ-opvarmet til stuetemperatur).
  4. Pipetteres blandingen i Tube A, indtil det er en homogen opløsning. Læg opløsning A til opløsning B dråbevis, og lad stå ved stuetemperatur i 2-3 min.
  5. Aspirere vækstmedium af HEK293T celler og erstat med 22 ml forvarmet HEK medium uden penicillin og streptomycin.
  6. Pipette kombineret løsninger AB (calciumphosphatpræcipitat) direkte til HEK293T celler og distribuere jævnt ved forsigtig omrystning.
  7. 24 timer efter transfektion af HEK-293T celler med lentivirus, fjerne vækstmedium og erstatte det med 25 ml frisk, forvarmet HEK medium. Retur transficerede Heks til inkubatoren.
  8. 48 timer efter transfektion af HEK-293T celler med lentivirus, indsamle vækstmedier indeholdende lentivirale partikler fra de transficerede Heks. Fjerne partikelformigt debris fra den høstede viral opløsningen ved centrifugering ved 3.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
  9. Koncentreres virus ved ultracentrifugering through en 20% saccharosepude (2 ml sucrose/25 ml viral supernatant) i 2 timer ved 112.000 x g ved 4 ° C. Suspendere viral pellet i 0,4 ml MEF ved 4 ° C i 15-30 min under forsigtig vipning. Opbevares viruspartikler engangsbrug alikvoter (dvs. 50 ul) ved -80 ° C.

2. Fremstilling af muse embryonale fibroblaster (MEF) for Omprogrammering

Bemærk: protokollen beskrevet her relaterer til afledning af iPSCs fra E 13,5 muse embryonale fibroblaster til brug i TEC assays. Mens andre grupper har genereret helt IPSC mus fra voksne donorer cellekilder, har vi ikke testet denne metode på andre celletyper, og kan ikke være sikker på, at donor celletype ikke er en faktor.

  1. Opsæt muse tidsstyret parringer. På embryonal dag 13,5 (E13.5), aflive den gravide kvinde og dissekere embryoner fra de Uterushornene. Sted og gemme embryoner i 1x PBS (præ-afkølet til 4 ° C) på is.
  2. Fjern de extraembryonic væv (dvs.chorion, amnion og placenta). Halshugge embryonet og fjern halen (valgfrit - hvis det er nødvendigt for genotypebestemmelse) og lemmer. Øse ud de indre organer, ved hjælp af pincet eller en skovl formet spatel og mos den resterende slagtekroppen med bladet af en skalpel eller skarp saks.
  3. Vask det hakkede slagtekroppen i 5 ml forud afkølet 1x PBS. Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter.
  4. Aspirer supernatanten. Suspendere pellet i 5 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C under kraftig omrystning i 20-30 min.
  5. Der tilsættes 5 ml MEF medium (pre-opvarmet til 37 ° C), blandes og centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
  6. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i foropvarmede MEF medium.
  7. Plade dissocieret MEF'er i 2-3 brønde i en 6-brønds plade præcoatet med 0,1% gelatine. Dette anses passage 1.
  8. Passage MEF'er ved en fortynding på 1:04 til 1:05 hver 48 timer. MEF'er ved passage 3 er klar til lentiviral transduktion.

3. Udledning af IPSC Lines

  1. Dagen før lentiviral transduktion, frø ~ 3 x 10 5 primær MEF'er til en brønd i en 6-brønds plade præcoatet med 0,1% gelatine.
  2. Dag 1: Primær MEF'er bør være 80-90% sammenflydende for lentiviral transduktion. Tilføj lentivirale partikler direkte til MEF medier og inkuberes med MEF'er natten over ved 37 ° C, 5% CO2 i en befugtet miljø.
  3. Den følgende dag (dag 2) aspireres mediet og vaskes to gange med 3 ml 1 x PBS til fjernelse af virale partikler.
  4. Tilsæt 0,5 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 3-5 min med lejlighedsvis omrystning.
  5. Tritureres at opnå en enkelt-cellesuspension. Observere cellerne ved lysmikroskopi for at sikre en enkelt cellesuspension.
  6. Overførsel MEF'er til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml MEF medier. Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og forsigtigt Resuspender cellerne i MEF medium.
  7. Ligeligt fordelt cellesuspensionen mellem to brønde i en 6 brønds psen præcoatet med 0,1% gelatine.
  8. Vippe pladen frem og tilbage, side til side, og en gang i en cirkulær bevægelse for at opnå en jævn fordeling af celler i hele godt. Inkuber natten over ved 37 ° C, 5% CO2 i en befugtet miljø.
  9. Dag 3: Gentag trin 4-9 bortset opdele cellerne jævnt fra én brønd til 3 brønde i en 6 brønds plade præcoatet med 0,1% gelatine. Dette vil give 6 brønde af transducerede primære fibroblaster.
  10. Dag 4: Add doxycyclin (DOX) ved en koncentration på 10 ug / ml til 5/6 brønde. Én brønd bør forblive ubehandlede for at tjene som kontrol.
  11. Tilføj VPA på 1,9 mM til 3 af de 5 brønde behandlet med DOX. VPA reducerer spredning på MEF. Tætte kulturer af MEF'er tolerere langvarig eksponering for VPA henviser subkonfluente kulturer har en tendens til senesce inden for 2-5 dage. Derfor bør MEF'er være 100% konfluente, når VPA tilsættes. Bemærk: Vi bruger VPA i vores omprogrammering eksperimenter, fordi det er et kendt epigenetisk modifikator, og har været sheget at øge effektiviteten af IPSC generation 17 selv om virkningerne og mekanismer VPA handling med hensyn til at generere fuldt pluripotente IPSC linjer ikke er kendt.
  12. Dag 5: Aspirer mediet, vaske og Trypsinisér cellerne som før. Passage af celler behandlet med DOX / VPA til en 15 cm2 vævsdyrkningsskål præcoatet med 0,1% gelatine, og hver af de andre betingelser til præ-coatede 10 cm2 skåle i ES-celle medium suppleret med frisk DOX og VPA.
  13. Replenish celler hver dag med ESC-medium suppleret med frisk DOX og VPA. ESC-lignende kolonier bør begynde at dukke op efter ~ 7 dage i DOX / VPA behandling og efter ~ 10 dage i DOX alene behandling. Ingen kolonier skal vises i fravær af DOX behandling.
  14. Når kolonier har en lys refraktiv, veldefineret kant og indeholder 30-50 celler, manuelt isolere kolonier med en gel loading pipettespids og overføres til en U-bundede 96 brønds plade indeholdende 20 ul 00,25% trypsin-EDTA. Trypsinisér til enkelte celler og overfør til foderautomater i en fladbundet plade med 96 brønde i 150 ul ESC medium indeholdende DOX / VPA eller DOX alene.
  15. Fortsæt til klonalt udvide de isolerede IPSC linjer på foderautomater i ESC medium. Fjern DOX og VPA på dag 19 efter deres tilsætning (post-transduktion dag 23). Kassér IPSC linjer, der ikke opretholder selvfornyelse eller spredning takster svarende til ESC kontrol.

Det kan være nyttigt at karakterisere dine IPSC linjer i forhold til økonomiske og sociale råd, før du forsøger at udføre TEC. Vi har karakteriseret vores linjer ved 1) ekspression af endogene pluripotency markører (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) ved hjælp af immuncytokemi, 2) karyotype analyse af kromosom tælling og 3) embryoid krop dannelse. Man kan også udføre lentiviral-specifikke RT-qPCR at bekræfte, at de provirale transgener ikke udtrykkes i iPSCs. Imidlertid har vi identificeret fuldt pluripotente iPSCs ved kun at bruge morfologi, immunfarvning og karyotypIng. I vores eksperimenter, mens valg af IPSC linjer baseret på ESC-lignende morfologi og vækstkarakteristika resulterer i de fleste af de linjer, der udtrykker pluripotency markører vi typisk identificere flere linier med potentielt unormale karyotyper.

4. Fremstilling af iPSCs for blastocystinjektion

Passage antal af en PSC linie har vist sig at påvirke dets pluripotency 18 selvom dette kan være line afhængige 19. Vi har brugt iPSCs på fra passager 8-14 for at producere voksne all-IPSC mus.

  1. Optø iPSCs og plade på foderautomater i ESC medium. Passage cellerne mindst én gang om foderautomater før brug til injektion.
  2. En brønd i en 6-brønds plade indeholdende 70-80% konfluente iPSCs vil give mere end et tilstrækkeligt antal celler til injektion. Aspirere vækstmedium og vask cellerne med ~ 3 ml 1 x PBS (uden Ca2 + / Mg2 +).
  3. Tilsæt 0,5 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA atcellerne og inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter med lejlighedsvis omrystning.
  4. Tritureres at opnå en enkelt-cellesuspension. Observere cellerne ved lysmikroskopi for at sikre en enkelt cellesuspension. De iPSCs skal være i enkelt cellesuspension som kolonier / celleaggregater vil tilstoppe injektionen pipette.
  5. Når en enkelt cellesuspension har ben opnået, tilsættes 1,0 ml ESC medier til brønden og returnere pladen til 37 ° C inkubator. Inkuber i ~ 15 min, eller indtil størstedelen af ​​føderne er begyndt at adhærere.
  6. Fjern forsigtigt medium indeholdende iPSCs pas på ikke at fjerne de svagt adhærerende foderautomater.
  7. Placere iPSCs i et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml ESC medium. Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og fjerne resten af ​​ES-celle medium med en mikropipette. Trykke røret for at fjerne pelleten og forsigtigt Resuspender cellerne i 0,2 til 0,5 ml præ-kølet FHM medium. Store celler på is, indtil og under injektion i tetraploid blastocysts.

5. Generering af tetraploide blastocyster

Procedurer udføres i dette afsnit er blevet beskrevet detaljeret andetsteds 5,6,20. Her skitserer vi vores teknik, optimeret til BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001.

  1. Opsæt embryo donormus ved priming 23-28 dage gamle hunmus (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) med PMS og hCG. Anvend 5 IE PMS ved 14:00 og 5 IU HCG 47 timer senere. Efter HCG injektion, der er nedsat hunmus med C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 stud hanner. Kontroller følgende dag for vaginale propper.
  2. Aflive sat hunmus og indsamle æggeledere. Saml 1-celle embryoer ved at placere æggeledere i FHM med hyaluronidase og forsigtigt rive ampulae. Tillad cumulus masserne til at sidde i FHM / Hyaluronidase for 5-7 min.
  3. Saml 1-celle embryoer ved hjælp af en mund pipette og vask gennem dråber FHM medier, før de bringes i KSOM-AA kultur. Kultur ved 37 ° C, 5% CO2 under mineralolie natten over og vælge 2-celle embryoer dagen for elektrofusion, kasseres alle andre embryoner.
  4. Placere en BTX Microslide i en 10 cm petriskål. Hæld nok rumtemperatur elektrofusion medier at oversvømme den dias i opløsning, men ikke så meget, at polerne af elektroden er helt nedsænket.
  5. Tænd ECM 2001 og BTX Enhancer 400. Slut ECM har kabler til microslide s elektrode og fastsætte kablerne til side af petriskålen for at forhindre utilsigtet bevægelse af slæden.
  6. Kør en manuel puls for at få en visning på BTX enhancer og bemærk spænding AC / DC strømme anvendes under. AC strøm vil styre den hastighed, hvormed embryonerne vil tilpasse mellem elektroderne, vil jævnstrøm fusionere blastomeres, og pulstid vil indstille længden af ​​DC puls. Et godt udgangspunkt er AC 3V, DC 100V, og tiden 0,05 msek. Den optimale DC varierer i området fra 90 til 150 volt. Ved hjælp af en mund pipette, omkring 30-40 to-celle embryoer tage fra KSOM-AA kultur og vaske dem gennem flere dråber elektrofusion medium. Trækker frisk elektrofusion medier fra microslide skålen i munden pipette og tage embryoner fra vaskevæsken. Læg dem i 1 mm gab mellem elektroderne på microslide. Passe på, at de er rettet ind på midten af ​​mellemrummet, og at de ikke er i kontakt med hinanden.
  7. Påfør AC strøm ved at trykke på manuel puls knappen. Embryonerne vil rotere i vekselstrømsfelt, indtil planet for blastomer kontakt er parallelt med elektroderne. Hvis embryoner, der ikke er justeret i et par sekunder, øge AC indstilling.
  8. Efter embryoner har justeret, skal du trykke på manuel puls knappen igen for at anvende DC puls.
  9. Med elektrosvejsning medium i pipetten, indsamle embryoner fra microslide. Vask embryoner gennem flere dråber KSOM-AA og placere dem i KSOM-AA kultur ved 37 ° C, 5% CO 2. Den blastomer fusion shoUld være afsluttet i mindre end 30 min i kultur.
  10. Gentag trin 7-11 for resterende 2-celle embryoer. Efter efterfølgende fusion grupper, overvåge og vælg embryoner med sammensmeltede blastomeres. Succesfuld fusionerede embryoner vil synes at være i 1-celle stadie. Kassér lyserede og 2-celle embryoer efter 30 min i kultur. Hvis fusion sats er under 80%, øge spændingen og / eller tid i trin på 5V og 0,01 msek. Hvis lysis er over 20%, fald DC spænding og / eller tid i overensstemmelse hermed. De optimale indstillinger i vores forsøg var AC 4V, DC 146V, og 0,07 msek. Disse indstillinger konsekvent gav 90% eller højere fusion satser med ringe eller ingen lysis.
  11. Fortsat kultur kondenserede embryoner i mikrodråber i KSOM-AA under mineralolie ved 37 ° C, 5% CO2. Man kan forvente 85-95% af fusionerede embryoner til dannelse af tetraploide (4n) blastocyster efter 48 timers inkubation.

6. Mikroinjektion af iPSCs i tetraploide blastocyster

Vi bruger en Nikon TE-2000Uinverteret mikroskop udstyret med DIC optik og Narishige mikromanipulatorer for blastocystinjektion. Hver tetraploid blastocyst injiceres med 10-12 iPSCs ved hjælp af en standardprotokol for ESC injektion i mus blastocyster, der er blevet påvist i en tidligere Jupiter publikation 5,20,21

  1. Placer en 20 pi dråbe FHM i midten af ​​en konkav objektglas og dække det med 150 ul mineralolie.
  2. Sænk bedrift pipette og mikroinjektion kanylen ind i FHM drop. Tillad 2-3 min for begge nåle til delvist at fylde med FHM.
  3. Vask 20-30 tetraploide blastocyster gennem dråber FHM og overførsel til FHM dråbe på objektglasset.
  4. Mouth pipette IPSC blandingen i dråben. Det kan være nødvendigt at fortynde celleblandingen i en dråbe FHM forhånd, hvis celler er for koncentreret eller aggregeres.
  5. Saml 100-200 celler med kanylen.
  6. Hold blastocyst med den indre cellemasse i 09:00 postulereion. Injicere celler ind i blastocoel ved at trænge zona pellucida og trofoblast ved klokken 3 position. Injicere 16-18 celler pr blastocyst.
  7. Retur IPSC suppleres blastocyster til KSOM-AA kultur.

7. Overførsel af suppleret tetraploide blastocyster i livmoderens Horns of recipientmus

Suppleret tetraploide blastocyster kirurgisk overført til de Uterushornene af kvindelige recipientmus i henhold til retningslinjerne for forskerens institut, bruger standard teknik 20, som vi kort opsummere. Vælg kvindelige CD-1 mus på den pro-estrus scenen og satte dem op til parring med vasectomized hanner. Check for vaginale propper den næste morgen. Hunnerne er klar til uterin embryo transfer to dage efter stikket blev opdaget (2,5 DPC).

En dag før modtagende hundyr parres med vasectomized hanner, oprette yderligere CD-1 hunner med ikke-vasectomized mændtil anvendelse som pleje mødre for alle-IPSC mus hentes af kejsersnit.

8. Kejsersnit og fremme af IPSC-afledte Pups

Overdragelsen af ​​TC embryoner typisk resulterer i flere resorptioner efter implantation, selv om IPSC eller ESC linje har en høj udviklingspotentiale. Som et resultat, kan man forvente ikke mere end 4 levedygtige unger (normalt 1-2) pr modtager. Disse små kuld er normalt overset af modtagerne. For at øge niveauet af neonatal pleje og overlevelsesraten, vi udfører C-sektioner og skabe efter standarden protokoller 20. For at udføre kejsersnit, aflive recipientmus 16 dage efter ægoplægningen i 7-08:00 (modtager 18,5 DPC) og dissekere hvalpe fra de Uterushornene. Foster levedygtige hvalpe til CD-1 mødre, som leverede kuld samme dag.

Discussion

Generering af mus fra IPSC linjer ved hjælp TEC assays giver en stringent funktionel test for pluripotency af en IPSC linje. Denne test kan være nyttigt at vurdere den relative effektivitet af forskellige omprogrammering metoder eller til at identificere IPSC linier, der kan være mest nyttig til frembringelse af visse celletyper in vitro. Mus genereret fra iPSCs kan anvendes til nøje teste langtidsstabilitet og tumorigenicitet af IPSC-afledte væv. Denne protokol vil være nyttigt at efterforskerne ønsker at generere fuldt pluripotente IPSC linjer eller IPSC mus eller at sammenligne den relative nytte af forskellige omprogrammering metoder.

De mekanismer, der styrer generation og identifikation af fuldt pluripotente iPSCs forbliver dårligt forstået, og det er muligt, at nogle IPSC linjer i denne metode vil ikke passere TEC test. Mange faktorer kan variere mellem forsøg herunder genetiske baggrunde, lentiviral titer, mønstre for lentiviral insertion, celle cyklus parametre donor befolkningen, inter-laboratorier forskelle i forskellige trin i TEC procedure og variable tilbøjeligheder iPSCs havnen genetiske eller epigenetiske aberrationer. For bedst at sikre succes, vi sørge for at etablere passende niveauer af lentiviral genekspression i IPSC afledning eksperimenter ved at teste virale fortyndinger for kontrol MEF'er at sikre, at hver virus er koncentreret nok til at producere påviselig genekspression mindst 80% og ideelt 100% af MEF'er. Dette giver os mulighed for at identificere linier med flere kopier af forskellige lentivira samtidig begrænse toksicitet til MEF'er og producere kolonier uden overbelægning brøndene. Det skal bemærkes, at mange andre protokoller er blevet vist at producere iPSCs med fuld udviklingspotentiale, brug af flere metoder og donorcelle kilder antyder, at flere stier til fuld pluripotency kan eksistere 1,8-13,15. På nuværende tidspunkt IPSC imidlertid nogen endelig biomarkør for fuldt pluripotenteer blevet identificeret, og derfor TEC analysen fortsat guldstandarden test af, om en IPSC linje kan generere alle cellelinier i en organisme.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Støtte til KKB blev MJB, JLH og KLN fra California Institute for regenerativ medicin, den Pew Charitable Trusts Biomedical Scholars Program, Esther B. O'Keeffe Family Foundation og Shapiro Family Foundation. KKB er en Donald E. og Delia B. Baxter Foundation Fakultet Scholar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (high glucose) Invitrogen 11965-092
ES cell qualified FBS Invitrogen 104392-024
FBS Invitrogen 16140-071
Glutamax Invitrogen 35050-061
β-Mercapt–thanol Sigma Sigma M7522
0.1% Gelatin Millipore ES006-B
MEM Non-Essential Amino Acids Invitrogen 11140
Medium 199 Invitrogen 11150-059
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
ESGRO (murine LIF) Millipore ESG1106
Valproic Acid Sigma P4543
DMSO Fisher BP231-100
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200
PBS Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14040-133
PBS Ca2+/Mg2+ free Invitrogen 14190-144
Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU Harbor-UCLA Research Institute n/a
Chorionic gonadotropin, human Sigma C1063
FHM medium with Hyaluronidase Millipore MR-056-F
KSOM-1/2 AA medium Millipore MR-106-D
FHM Millipore MR-024-D
Water, for embryo transfer, embryo tested Sigma W1503
Mineral oil, embryo tested Sigma M5310
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4 Sigma M2773
D-Mannitol Sigma M4125
Bovine serum albumin (BSA), embryo tested Sigma A3311
Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated Millipore PMEF-CFL

Media and buffers used in this protocol

HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 °C for up to 1 month.

2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4·7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 °C.

Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 °C for up to 1 month.

ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM β-mercapt–thanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 °C for up to three weeks.

Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 °C for up to 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boland, M. J., et al. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature. 461, 91-94 (2009).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
  4. Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).
  5. Eggan, K., Jaenisch, R. Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation. Springer. (2006).
  6. McLaughlin, K. J. Production of tetraploid embryos by electrofusion. Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).
  7. Humpherys, D., et al. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science. 293, 95-97 (2001).
  8. Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell. 5, (09), 135-138 (2009).
  9. Zhao, X. Y., et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature. 461, 86-90 (2009).
  10. Kang, L., et al. Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation. Cell Res. 21, 546-549 (2011).
  11. Zhao, X. -Y., et al. Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).
  12. Han, J., et al. Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells. Nature. 463, 1096-1100 (2010).
  13. Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).
  14. Stadtfeld, M., et al. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Nature. 465, 175-181 (2010).
  15. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
  16. Go, W. Y., Ho, S. N. Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems. The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).
  17. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nature. 26, 795-797 (2008).
  18. Li, X. -y, et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).
  19. George, S. H. L., et al. Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).
  20. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
  21. Kirak, O., et al. Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT. J. Vis. Exp. (43), e2168 (2010).
Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boland, M. J., Hazen, J. L., Nazor, K. L., Rodriguez, A. R., Martin, G., Kupriyanov, S., Baldwin, K. K. Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (69), e4003, doi:10.3791/4003 (2012).More

Boland, M. J., Hazen, J. L., Nazor, K. L., Rodriguez, A. R., Martin, G., Kupriyanov, S., Baldwin, K. K. Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (69), e4003, doi:10.3791/4003 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter