Summary
Wij beschrijven een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen hoge concentratie van fluorescerende en calcium-gevoelige kleurstoffen in neuronen of neuronale kanaal met een polyethyleen zuig pipet.
Abstract
Retrograde etikettering van neuronen is een standaard anatomische methode 1,2 die ook is gebruikt om calcium-en voltage-sensitieve kleurstoffen te laden in neuronen 3-6. Over het algemeen worden de kleurstoffen toegepast als vaste kristallen, of door lokale druk injectie met glazen pipetten. Dit kan echter leiden tot een verdunning van de kleurstof en een verminderde intensiteit van de etikettering, in het bijzonder wanneer meerdere uren nodig zijn voor kleurstofdiffusie. Hier tonen een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen fluorescentie en ion-gevoelige kleurstoffen in neuronen met een polyethyleen zuig pipet gevuld met de kleurstofoplossing. Deze methode biedt een betrouwbare wijze voor handhaving van een hoge concentratie van de kleurstof in contact met axons gedurende het laden.
Protocol
Fluorescerende dextranen zijn gebruikt als anatomische gereedschappen en voor het afbeelden van neuronale activiteit 1-4. Velden et al.., (2009) 4 publiceerde een protocol voor het toepassen van ionen-en voltage-sensitieve kleurstoffen om axonale stukken met een focus op het ruggenmerg als modelsysteem. Hier beschrijven we een meer gedetailleerde procedure voor de toepassing van TL-en / of ion-gevoelige kleurstof om de snede ventrale wortels, dorsale wortels of een neuronale kanaal van het ruggenmerg voor in-vitro optophysiological en morfologische studies.
1. Type-I en type-II pipetten
Begin met het trekken van twee korte delen van polyethyleen buis (PE90, Clay Adams Brand) boven de vlam van een alcohol lamp 7 tot en met pipetten te produceren met taps toelopende tips. Een pipet (Type-I) moet kort (3-7 mm) met een kleine tip die goed kan houden het doel root of darmkanaal (Outer Diameter: 0,2-0,4 mm; Inner Diameter: 0,1-0,3 mm). Trek vervolgens een tweede pipet (Type-II) met een langere (8-12 cm) dunner, as en een zeer fijne punt (buitendiameter: 0,2-0,3 mm, binnendiameter: 0,1-0,2 mm) kan worden ingebracht in de type-I pipetteren zover haar tip. De tweede dunnere pipet wordt gebruikt om te zuigen respectievelijk invoeren kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) en kleurstof oplossing uit de Type-I pipet.
2. Positionering van Type-I Pipetteer
Ontleden en te isoleren het ruggenmerg 8,9 en plaats deze in een bad, superfused met gekoeld aCSF (~ 16 ° C) gedurende het laadproces. Plaats de type-I pipet op een elektrode houder (H1/12 elektrode houder Narishige) zodat de rug openingen kunnen gemakkelijk worden aangesloten op een injectiespuit (1 ml U-100 insulinespuit, Becton Dickenson of vergelijkbare) via een flexibele slang (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Afb.1A-B).
3. Dye toepassing
- Met behulp van de injectiespuit in de eerste tekenenaCSF in de type-I pipet (fig.1b; 2A) gevolgd door de axonale-darmkanaal of root in te vullen (fig. 2B). De flexibele slang moet dan uit de achterkant opening. De type-II pipet wordt aan een injectiespuit en opgenomen in de type-I pipetteren die het axonale tractus of wortels. Met behulp van de spuit aan de type II-pipet, zuig aCSF zodat de resterende aCSF alleen de axonale-darmkanaal (fig.1c; 2C-D) bedekt. Dan trekt de type II-pipet uit het type-I pipet. Controleer de aCSF niveau voor een paar minuten om een goede afdichting te controleren op de axonale-darmkanaal of de zenuwen (zie hoofdstuk 3 in Problemen oplossen voor "goede afsluiting").
- Los de kleurstof in aCSF of 0,2% Triton X-100 in dubbel gedistilleerd water en trek het in de type-II-pipet met aandacht niet om luchtbellen te nemen. Plaats de type-II pipet met de kleurstof in de type-I pipet in de residuale aCSF oplossing (Fig. 2E). Langzaam vrijde kleurstof in de aCSF met zachte overdruk (fig. 2F). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in te voeren of verplaatsing van het te onderzoeken weefsel van binnen de tip veroorzaken. Trek de type II-pipet na voldoende hoeveelheid kleurstof is vrijgegeven (3-5 ul van kleurstof oplossing).
4. Incubatie
Incubeer het weefsel in het donker van 6 tot 20 uur, afhankelijk van het type experiment. Zodra voldoende tijd is gegeven voor het vullen trek weg elektrode van het weefsel waarbij de weefsel gereed voor beeldvorming of histologie.
Problemen oplossen
- Wanneer het doel weefsel niet gemakkelijk gaan de punt van het type I pipet of los binnen komt dan de tip diameter de verkeerde maat. Als dit gebeurt, trekken en een andere pipet.
- Voor het toevoegen van de kleurstof aan de aCSF in het type-I pipet, zorg ervoor dat er genoeg aCSF zo blijft dat het kan worden bereikt met deType-II pipetpunt (fig. 2D). Anders een luchtspleet aanwezig als de kleurstof toegevoegd. Als dit gebeurt, niet voeg de kleurstof en verwijder de axonale-darmkanaal van de pipet en plaats deze terug in met voldoende aCSF te bereiken door de Type-II-pipet.
- Als de aCSF niveau in de type-I pipet neemt toe nadat het werd opgezogen met de type-II-pipet, betekent dit dat de afdichting met het weefsel niet goed is. Gebruik een andere elektrode, anders wordt de kleurstof worden verdund tijdens de benoemingsprocedure.
- Als er een luchtbel wordt in de type-I pipet, terwijl het injecteren van de kleurstof, weglopen de bel door het bevorderen van de type-II-pipetpunt in de buurt van de bel en voorzichtig aanbrengen van een zwakke negatieve druk met behulp van de bijgevoegde spuit.
5. Representatieve resultaten
Als u een toepassing van de methode te illustreren, hebben we tegelijkertijd geladen motoneuronen, sensorische afferenten en spinale interneuronen met drie verschillende DEXTrende-geconjugeerd fluorescerende kleurstoffen (Fig. 3A). Zoals getoond in Fig. 3B, drie klassen van het neuron zijn gelabeld; sensorische afferenten (rood), interneuronen projecteren in het ventrale funiculus (groen) en motoneuronen (blauw).
Figuur 1. Schematische weergave Pipetteer Type-I en Type-II-montage. (A) Type-I pipet (lichtblauw) wordt geplaatst op een elektrodehouder zodat rug openingen kunnen gemakkelijk worden verbonden met de flexibele elastomeer buis (B) en waarin een type-II pipet kan ingevoegd (C) worden.
Figuur 2. Schematische weergave het laadproces van motorneuronen met fluorescerende kleurstoffen. (A) Een type-I pipet wordt geplaatst in de buurt van de ventrale wortel in te vullen. (B) zuignap wordt toegevoerd aan de pipet aCSF trekken in de pipet gevolgd door de wortel. (C-D) Ontkoppel de flexibele elastomeer slang van de backend van Type-I pipet en vermindering van de hoeveelheid aCSF door te zuigen aan de Type-II-pipet. (E) Steek de punt van de type-II-pipet met de opgeloste kleurstof in de resterende aCSF in de type-I pipet. (EF) Langzaam vullen de type-I pipet met de kleurstof en verwijder dan de Type-II-pipet.
Figuur 3. Toepassing van het vullen van de geïsoleerde muis ruggenmerg. (A) met hierin de drie type-I pipetten gebruikt om verschillende neuronale klassen te vullen in het ruggenmerg. Motoneuronen (blauw; Cascade Blue dextran) en sacrale sensorische afferenten (rood, Texas-Rood dextran) werden opgevuld door de ventrale en dorsale wortels, respectievelijk. Fluoresceïne dextran werd gebruikt om de spinale interneuronen (groen), waarvan de axonen stijgen door de ventrale funiculus (VF) te laden. 1 mg per dextran kleurstof (10.000 MW, Molecular Probes)werd opgelost in 6 ul gedistilleerd water dat 0,2% Triton X-100 (B). Confocaal beeld van een gedeelte van het koord sacrale een ruggenmerg waarbij de neuronen werden back-gelabeld zoals beschreven in A. Merk op dat de gelabelde sensorische afferente hoofdzakelijk ipsilaterale met enkele contralaterale uitsteeksels. De gelabelde motoneuronen zijn ipsilaterale de gevulde ventrale wortel dat de gelabelde interneuronen contralateraal aan de zijkant van de vulling (pijlpunt). Kalibratie bar 200 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
