Summary
Nous décrivons une technique simple et peu coûteuse pour l'introduction de la concentration élevée de colorants fluorescents et sensible au calcium dans les neurones ou de tout appareil neuronal aide d'une pipette d'aspiration en polyéthylène.
Abstract
Marquage rétrograde de neurones est une méthode standard de 1,2 anatomique qui a également été utilisé pour charger de calcium et de la tension des colorants sensibles dans les neurones 3-6. En général, les colorants sont appliqués sous forme de cristaux solides ou par injection sous pression locale en utilisant des pipettes en verre. Toutefois, cela peut entraîner une dilution de l'intensité de marquage colorant et réduite, en particulier lorsque plusieurs heures sont nécessaires pour la diffusion de colorant. Ici, nous démontrons une technique simple et à faible coût pour l'introduction de colorants fluorescents et sensible aux ions dans les neurones à l'aide d'une pipette d'aspiration en polyéthylène rempli de la solution de colorant. Cette méthode offre un moyen fiable pour le maintien d'une forte concentration du colorant en contact avec les axones à travers la procédure de chargement.
Protocol
Dextranes fluorescents ont été utilisés comme outils pour l'imagerie anatomique et l'activité neuronale 1-4. Fields et al. (2009) 4 a publié un protocole pour l'application d'ions et de tension des colorants sensibles à de vastes axonales avec un accent sur la moelle épinière comme un système modèle. Nous décrivons ici une procédure plus détaillée pour l'application de colorant fluorescent et / ou sensible aux ions de couper les racines et ventrales, dorsales racines ou tout appareil neuronal de la moelle épinière pour les études in vitro optophysiological et morphologiques.
1. Type I et type II Pipettes
Commencez par tirer deux courtes sections de tuyaux en polyéthylène (PE90, Clay Adams marque) sur la flamme d'une lampe à alcool pour produire 7 pipettes avec des conseils coniques. Une pipette (type I) doit être court (3-7 mm) avec une petite astuce qui peut bien tenir la racine cible ou les voies (Diamètre extérieur: 0,2-0,4 mm; Diamètre intérieur: 0.1-0.3 mm). Ensuite, tirez une pipette seconde (type-II) avec un plus (8-12 cm) plus mince, l'arbre et une pointe très fine (Diamètre extérieur: 0,2-0,3 mm; diamètre intérieur: 0,1-0,2 mm) qui peut être inséré dans le type I dans la mesure du pipeter sa pointe. La pipette seconde mince sera utilisé pour aspirer et introduire du liquide céphalorachidien artificielle (LCRa) et une solution de colorant, respectivement de la pipette du type I.
2. Le positionnement de type I Introduire à la pipette
Disséquer et d'isoler la moelle épinière 8,9 et le placer dans un bain, superfusées avec réfrigérés aCSF (~ 16 ° C) tout au long du processus de chargement. Placez le type I de la pipette sur un porte-électrode (H1/12 porte-électrode, Narishige) de sorte que son ouverture à l'arrière peuvent être facilement relié à une seringue (1 ml U-100 seringue à insuline, Becton Dickenson ou comparable) via un tuyau flexible (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002; 10 cm) (Fig. 1A-B).
3. Application de la teinture
- Aide de la seringue, dessinez d'abordLCRa dans la pipette du type I (Fig. 1B; 2A) suivie par le tube ou la racine axonale à pourvoir (fig. 2B). Le tuyau flexible doit alors être retiré de l'ouverture arrière. La pipette du type II est fixé à l'autre et insérées dans la seringue du type I pipette de maintien du tube ou de la racine axonale. Aide de la seringue attachée à la pipette de type II, aspiration aCSF de sorte que le aCSF résiduelle couvre tout juste les voies axonales (Fig.1C; 2C-D). Puis retirer la pipette de type II de la pipette de type-I. Surveillez le niveau de aCSF pendant quelques minutes afin de vérifier une bonne étanchéité sur le tube axonale ou des nerfs (voir la section 3 à la section Dépannage pour "bonne étanchéité").
- Dissoudre le colorant dans aCSF ou 0,2% de triton X-100 dans l'eau bidistillée et l'attirer dans la pipette de type II, tout en accordant une attention de ne pas inclure les bulles d'air. Insérer la pipette de type II contenant le colorant dans la pipette de type I et dans la solution résiduelle aCSF (Fig. 2E). Relâchez lentementdu colorant dans la aCSF utilisant une légère pression positive (Fig. 2F). Veillez à ne pas introduire de bulles d'air ou de provoquer des déplacements du tissu cible à l'intérieur de la pointe. Retirer la pipette de type II après quantité suffisante de colorant a été libéré (3-5 pi de solution de colorant).
4. Incubation
Incuber le tissu dans l'obscurité entre 6 à 20 heures, selon le type d'expérience. Une fois que suffisamment de temps a été autorisé pour le remplissage, tirez doucement sur l'écart de l'électrode à partir du tissu en laissant le tissu prêt à l'imagerie ou l'histologie.
Dépannage
- Si le tissu cible n'entre pas facilement dans la pointe de la pipette de type I ou est lâche fois à l'intérieur, alors le diamètre de l'extrémité est de la bonne taille. Si cela se produit, tirer et utiliser une pipette différente.
- Avant d'ajouter le colorant à la aCSF dans la pipette de type I, assurez-vous que aCSF reste suffisamment pour qu'il puisse être conclu avec leType-II pointe de pipette (Fig. 2D). Sinon, un espace d'air sera exister une fois le colorant est ajouté. Si cela se produit, ne pas ajouter le colorant et retirer le tube axonale à partir de la pipette, puis reculer avec aCSF suffisante pour être atteint par la pipette de type II.
- Si le niveau aCSF dans les augmentations de pipettes de type I après avoir été aspiré avec la pipette de type II, cela signifie que le joint d'étanchéité avec le tissu n'est pas bon. Utiliser une électrode différente, sinon le colorant sera diluée au cours de la procédure de labellisation.
- Si une bulle d'air est introduit dans la pipette du type I, tout en injectant le colorant, la bulle s'écouler en faisant avancer le fermer de type-II pointe de pipette à la bulle et lentement à appliquer une pression négative faible utilisation de la seringue joint.
5. Les résultats représentatifs
Motoneurones Pour illustrer un application de la méthode, nous avons simultanément chargés, afférences sensorielles et des interneurones spinaux avec trois dext différenteran-conjugués colorants fluorescents (fig. 3A). Comme illustré à la figure. 3B, trois classes de neurones sont étiquetés; afférences sensorielles (rouge), des interneurones en saillie dans le funicule ventrale (vert) et les motoneurones (bleu).
Figure 1. Schéma montrant la pipette de type I et type II assemblage. (A) Un type I de pipette (bleu) est placé sur un porte-électrode de telle sorte que son dos ouverture peut être facilement reliée à la tubulure souple en élastomère (B) et dans lequel une pipette du type II peut être inséré (C).
Figure 2. Schéma montrant le processus de chargement des motoneurones avec des colorants fluorescents. (A) une pipette du type I est placé près de la racine ventrale à pourvoir. (B) d'aspiration est appliquée à la pipette d'établir LCRa dans la pipette suivie par la racine. (C-D) Débranchez le tuyau souple en élastomère de la backend de type I pipette et réduire la quantité de aCSF en appliquant une aspiration à la pipette de type II. (E) Insérer la pointe de la pipette de type II contenant le colorant dissous dans le aCSF restant dans la pipette de type-I. (EF) Remplir lentement la pipette de type I avec le colorant, puis retirer la pipette de type II.
Figure 3. Application de la procédure de remplissage de la moelle épinière souris isolée. (A) Schéma montrant les trois pipettes de type I utilisée pour remplir les différentes classes de neurones dans la moelle épinière. Motoneurones (bleu; Cascade Bleu dextran) et sacrés afférences sensorielles (en rouge; Texas Red dextran) ont été remblayés par les racines ventrales et dorsales, respectivement. Fluorescéine dextrane a été utilisé pour charger les interneurones spinaux (vert) dont les axones monter à travers la face ventrale du funicule (VF). 1 mg de chaque colorant dextrane (10.000 MW; Molecular Probes)a été dissous dans 6 pi d'eau distillée contenant 0,2% de Triton X-100 (B). Image confocale d'une section de la moelle sacrée de la moelle épinière, dans lequel les neurones étaient de retour marqué comme décrit à la note A. que les afférences sensorielles sont principalement étiquetés ipsilatérale avec quelques projections controlatérales. Les motoneurones sont marquées ipsilatéral à la racine ventrale remplie alors que les interneurones marqués sont controlatéral au côté du remblai (tête de flèche). Barre de calibrage 200 um.
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Discussion
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Acknowledgments
References
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