Summary
हम एक सरल और कम लागत न्यूरॉन्स या किसी भी neuronal एक polyethylene चूषण विंदुक का उपयोग पथ में फ्लोरोसेंट और कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों के उच्च एकाग्रता को शुरू करने के लिए तकनीक का वर्णन करता है.
Abstract
न्यूरॉन्स की प्रतिगामी लेबलिंग एक मानक शारीरिक विधि 1,2 कि 3-6 न्यूरॉन्स में कैल्शियम और वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों लोड इस्तेमाल किया गया है. आम तौर पर, रंग ठोस क्रिस्टल के रूप में या स्थानीय दबाव गिलास pipettes का उपयोग इंजेक्शन द्वारा लागू कर रहे हैं. हालांकि, इस डाई और कम लेबलिंग तीव्रता के कमजोर पड़ने में परिणाम है, खासकर जब कई घंटे डाई प्रसार के लिए आवश्यक हैं कर सकते हैं. यहाँ हम एक polyethylene चूषण डाई समाधान के साथ भरा विंदुक का उपयोग न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट और आयन के प्रति संवेदनशील रंगों को शुरू करने के लिए एक सरल और कम लागत वाली तकनीक का प्रदर्शन. इस विधि लोड हो रहा है प्रक्रिया के दौरान axons के साथ संपर्क में डाई की एक उच्च एकाग्रता बनाए रखने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है.
Protocol
प्रतिदीप्त dextrans संरचनात्मक उपकरण के रूप में और इमेजिंग neuronal गतिविधि 1-4 के लिए इस्तेमाल किया गया है. एट अल फील्ड्स,. (2009) 4 axonal इलाकों के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में रीढ़ की हड्डी पर एक ध्यान के साथ आयन और वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रकाशित. यहाँ हम कट उदर जड़ों, पृष्ठीय जड़ों या रीढ़ की हड्डी के किसी भी neuronal पथ में इन विट्रो optophysiological और रूपात्मक अध्ययन के लिए फ्लोरोसेंट और / या आयन के प्रति संवेदनशील डाई लागू करने के लिए एक अधिक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन.
1. प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय Pipettes
पतला सुझावों के साथ pipettes उत्पादन के लिए एक शराब 7 दीपक की लौ पर polyethylene टयूबिंग दो छोटे वर्गों (PE90, क्ले एडम्स ब्रांड) खींच द्वारा शुरू करो. एक विंदुक (प्रकार मैं) कम (3-7 मिमी) के साथ एक छोटी सी टिप है कि कसकर लक्ष्य जड़ या पथ (:; भीतरी व्यास 0.2-0.4 मिमी: 0.1-0.3 मिमी की बाहरी व्यास) पकड़ कर सकते हैं होना चाहिए. फिर एक दूसरा विंदुक खींच (प्रकार) द्वितीय एक लंबे समय तक (8-12 सेमी) पतली शाफ्ट, और एक बहुत ही सुन्दर (आउटर व्यास टिप: 0.2-0.3 मिमी, भीतरी व्यास के साथ: 0.1-0.2 मिमी) में डाला जा सकता है प्रकार मैं के रूप में दूर विंदुक इसकी टिप. 2 पतली विंदुक के लिए महाप्राण (व्यंजन) और विंदुक प्रकार मैं से कृत्रिम मस्तिष्कमेरु (aCSF) के तरल पदार्थ और डाई समाधान शुरू क्रमशः के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
2. मैं विंदुक प्रकार की पोजिशनिंग
काटना और रीढ़ की हड्डी 8,9 अलग है और यह एक स्नान लोडिंग प्रक्रिया के दौरान के ठंडा aCSF (~ 16 डिग्री सेल्सियस) के साथ superfused में जगह है. प्रकार मैं एक इलेक्ट्रोड धारक (H1/12 इलेक्ट्रोड धारक, Narishige की) पर विंदुक इतना है कि अपनी पीठ खोलने एक लचीला टयूबिंग के माध्यम से आसानी से किया जा सकता है एक सिरिंज (1ml यू 100 इंसुलिन सिरिंज, Becton Dickenson या तुलनीय) कनेक्ट (फार्म्ड प्लेस बीपीटी, कोल परमार, AY242002 #; 10 सेमी) (Fig.1A बी).
3. डाई आवेदन
- सिरिंज का उपयोग कर, 1 आकर्षितप्रकार मैं विंदुक (Fig.1B, 2A) में aCSF axonal पथ या (छवि 2B) भरा होना जड़ के द्वारा पीछा किया. लचीला टयूबिंग तो वापस उद्घाटन से हटाया जाना चाहिए. प्रकार द्वितीय विंदुक एक और सिरिंज से जुड़ा हुआ है और प्रकार मैं axonal पथ या जड़ पकड़ पिपेट में सम्मिलित होती है. प्रकार द्वितीय पिपेट, महाप्राण (व्यंजन) aCSF इतना है कि अवशिष्ट aCSF axonal पथ (; 2C डी Fig.1C) को शामिल किया गया संलग्न सिरिंज का उपयोग करना. तो विंदुक प्रकार मैं प्रकार द्वितीय विंदुक वापस ले लें. मॉनिटर में axonal पथ या नसों पर एक अच्छा सील को सत्यापित करने के लिए कुछ मिनट के लिए aCSF स्तर ("अच्छा मुहर के लिए समस्या निवारण में धारा 3 देखें).
- भंग aCSF में डाई या 0.2% नरमीन दोहरा आसुत जल में X-100 और प्रकार द्वितीय पिपेट में आकर्षित हवाई बुलबुले शामिल नहीं है जबकि ध्यान दे. प्रकार द्वितीय प्रकार मैं पिपेट में और अवशिष्ट aCSF समाधान (छवि 2 ई) में डाई युक्त विंदुक सम्मिलित करें. धीरे धीरे जारीकोमल सकारात्मक दबाव (छवि 2 एफ) का उपयोग aCSF में डाई. किसी भी हवाई बुलबुले नहीं परिचय या टिप अंदर से लक्ष्य ऊतक के विस्थापन के कारण सावधान रहो. डाई के लिए पर्याप्त है (डाई समाधान के 3-5 μL) जारी कर दी गई राशि के बाद प्रकार द्वितीय विंदुक वापस ले लें.
4. ऊष्मायन
प्रयोग के प्रकार के आधार पर 6 से 20 घंटे के बीच अंधेरे में ऊतक सेते हैं. एक बार भरने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी गई है, धीरे दूर ऊतक इमेजिंग या ऊतक विज्ञान के लिए तैयार छोड़ने के ऊतकों से इलेक्ट्रोड खींच.
समस्या निवारण
- यदि लक्ष्य ऊतक प्रकार मैं पिपेट की टिप में आसानी से प्रवेश नहीं करता है या ढीले एक बार अंदर है, तो टिप व्यास गलत आकार है. यदि ऐसा होता है खींच, और एक अलग विंदुक का उपयोग करें.
- विंदुक प्रकार मैं में aCSF डाई जोड़ने से पहले, सुनिश्चित करें कि पर्याप्त aCSF इतना रहता है कि यह साथ पहुँचा जा सकताप्रकार द्वितीय विंदुक टिप (छवि 2 डी). अन्यथा, एक हवा खाई बार डाई जोड़ा है मौजूद होगा. यदि ऐसा होता है, डाई नहीं जोड़ सकते हैं और विंदुक से axonal पथ को हटाने और फिर इसे वापस आकर्षित करने के लिए पर्याप्त प्रकार द्वितीय विंदुक के द्वारा पहुँचा जा aCSF साथ में.
- यदि प्रकार मैं पिपेट में बढ़ aCSF स्तर के बाद प्रकार द्वितीय विंदुक के साथ aspirated था, इसका मतलब है कि ऊतक के साथ सील अच्छा नहीं है. एक अलग इलेक्ट्रोड का उपयोग करें, अन्यथा डाई लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान पतला हो जाएगा.
- यदि एक हवाई बुलबुले विंदुक प्रकार मैं में शुरू की है जबकि डाई इंजेक्शन, बाहर बुलबुला प्रकार द्वितीय विंदुक टिप करीब अग्रिम और धीरे से एक कमजोर संलग्न सिरिंज का उपयोग करते हुए नकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा बुलबुला नाली.
5. प्रतिनिधि परिणाम
विधि का एक आवेदन का वर्णन करने के लिए, हम एक साथ भरी हुई motoneurons, संवेदी afferents को और तीन अलग dext के साथ रीढ़ की हड्डी interneuronsफ्लोरोसेंट रंजक (छवि 3A) संयुग्मित भाग गया. के रूप में छवि में सचित्र. 3B, न्यूरॉन के तीन वर्गों में चिह्नित कर रहे हैं, संवेदी (लाल) afferents के के, उदर (हरा) रज्जु अथवा रज्जु के सामन रचना और motoneurons (नीला) में पेश interneurons.
आकृति 1. योजनाबद्ध पिपेट दिखाने प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय विधानसभा (ए) एक प्रकार मैं विंदुक (हल्का नीला) एक इलेक्ट्रोड धारक पर रखा गया है, इतना है कि यह वापस आ गया है खोलने आसानी से लचीला इलास्टोमेर टयूबिंग (बी) के लिए कनेक्ट किया जा सकता है और जो में एक प्रकार द्वितीय विंदुक (सी) डाला जा सकता है.
चित्रा 2. योजनाबद्ध फ्लोरोसेंट रंजक के साथ motoneurons की लोडिंग प्रक्रिया को दर्शाता है. (ए) एक विंदुक प्रकार उदर भरा होना रूट के पास रखा गया है. (बी) सक्शन में पिपेट जड़ के बाद विंदुक में aCSF आकर्षित करने के लिए लागू किया जाता है. (सीडी) मैं - विंदुक प्रकार की बैकेंड से लचीला इलास्टोमेर टयूबिंग डिस्कनेक्ट और प्रकार द्वितीय विंदुक के लिए चूषण लागू करने द्वारा aCSF की राशि कम है. (ई) टाइप II विंदुक प्रकार मैं में शेष aCSF के में भंग डाई युक्त विंदुक टिप डालें. (एफई) रंग के साथ धीरे धीरे विंदुक प्रकार मैं भर और फिर टाइप II विंदुक हटाने के.
चित्रा 3. आवेदन भरने की प्रक्रिया के अलग माउस रीढ़ की हड्डी. (ए) योजनाबद्ध तीन प्रकार मैं pipettes रीढ़ की हड्डी में अलग neuronal वर्गों को भरने के लिए इस्तेमाल किया. दिखा (नीले, झरना ब्लू dextran) motoneurons और त्रिक संवेदी afferents के के (लाल, लाल dextran टेक्सास) उदर और पृष्ठीय जड़ों के माध्यम से क्रमशः backfilled गया. Fluorescein dextran रीढ़ की हड्डी (हरा) interneurons axons जिसका उदर रज्जु अथवा रज्जु के सामन रचना (VF) के माध्यम से चढ़ना लोड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रत्येक dextran डाई के 1 मिलीग्राम (10,000 मेगावाट, आण्विक जांच)6 μL आसुत पानी 0.2% युक्त में भंग किया गया था Triton एक्स 100 (बी). एक रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स वापस लेबल थे के रूप में ए नोट में वर्णित है कि लेबल संवेदी afferents कुछ contralateral अनुमानों के साथ मुख्य रूप से ipsilateral त्रिक हड्डी से एक अनुभाग के confocal छवि. लेबल motoneurons भर उदर जड़ ipsilateral हैं जबकि लेबल interneurons भरण की ओर तीर सिर contralateral. अंशांकन 200 माइक्रोन बार.
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Discussion
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Acknowledgments
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