Summary
Se describe una técnica sencilla y de bajo costo para la introducción de alta concentración de colorantes fluorescentes y sensible de calcio en las neuronas o cualquier aparato neuronal con una pipeta de succión de polietileno.
Abstract
Etiquetado retrógrada de las neuronas es un 1,2 anatómica método estándar que se ha utilizado también para cargar calcio y tintes sensibles al voltaje en neuronas 3-6. En general, los colorantes se aplican en forma de cristales sólidos o por inyección a presión local utilizando pipetas de vidrio. Sin embargo, esto puede resultar en la dilución de la intensidad colorante y etiquetado reducida, particularmente cuando se requieren varias horas para la difusión del colorante. Aquí se demuestra una técnica sencilla y de bajo costo para la introducción de colorantes fluorescentes y de iones sensibles a las neuronas con una pipeta de succión de polietileno llena de la solución de colorante. Este método ofrece una forma fiable para mantener una alta concentración del colorante en contacto con los axones en todo el procedimiento de carga.
Protocol
Dextranos fluorescentes se han utilizado como herramientas anatómicas y para la actividad neuronal imagen 1-4. Campos et al, (2009) 4 publicó un protocolo para la aplicación de iones y sensibles al voltaje tintes de vías axonales con un enfoque en la médula espinal como un sistema modelo. Aquí se describe un procedimiento más detallado para la aplicación de tinte fluorescente y / o de iones sensibles a las raíces cortadas ventrales, raíces dorsales o cualquier tracto neuronal de la médula espinal para los estudios in vitro optophysiological y morfológicas.
1. Tipo I y Tipo II Pipetas
Para empezar, tirando de dos tramos cortos de tubo de polietileno (PE90, Clay Adams Marca) sobre la llama de una lámpara de alcohol 7 para producir pipetas con puntas afiladas. Una pipeta (Tipo I) debe ser corto (3-7 mm) con un pequeño consejo que bien puede contener la raíz de destino o en el tracto (Diámetro exterior: 0.2-0.4 mm; Diámetro interior: 0,1-0,3 mm). A continuación, tire de una pipeta segundo (Tipo-II) con un tiempo (8-12 cm) más delgada, el eje y una punta muy fina (diámetro exterior: 0.2-0.3 mm, diámetro interior: 0.1-0.2 mm) que se puede insertar en el Tipo I pipetear la medida de lo la punta. La pipeta segundo diluyente será utilizada para aspirar e introducir fluido cerebroespinal artificial (aCSF) y la solución colorante, respectivamente, de la pipeta Tipo-I.
2. Posicionamiento de tipo I Pipetear
Disecar y aislar a la médula espinal 8,9 y colocarlo en un baño, con frío superfused aCSF (~ 16 ° C) durante todo el proceso de carga. Coloque el tipo I de la pipeta en un soporte de electrodo (H1/12 porta-electrodos, Narishige) de manera que su apertura posterior puede ser fácilmente conectado a una jeringa (1 ml jeringa U-100 a la insulina, Becton Dickenson o similar) a través de un tubo flexible (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002; 10 cm) (Fig. 1A-B).
3. Dye aplicación
- Con la jeringa, primero trazaaCSF en la pipeta Tipo-I (Fig. 1B; 2A), seguido por el tracto axonal o raíz para ser llenado (Fig. 2B). El tubo flexible debe entonces ser retirado de la abertura trasera. La pipeta de tipo II se une a otra jeringuilla y se inserta en el Tipo I pipeta de sujeción del tracto axonal o raíz. Uso de la jeringa con la pipeta de tipo II, aspirado aCSF para que el aCSF residuales sólo cubre el tracto axonal (Fig. 1c; 2C-D). Luego retirar la pipeta de tipo II a partir de la pipeta de tipo I. Controlar el nivel de aCSF durante unos minutos para verificar un buen sello en el tracto axonal o los nervios (ver Sección 3 Solución de problemas de "buen cierre").
- Disolver el colorante en aCSF o el 0,2% Triton X-100 en agua destilada dos veces y dibujarlo en la pipeta de tipo II, mientras que prestar atención de no incluir burbujas de aire. Insertar la pipeta de tipo II que contiene el colorante en la pipeta Tipo-I y en la solución residual aCSF (Fig. 2E). Suelte lentamenteel medio de contraste en el uso de una presión suave aCSF positivo (Fig. 2F). Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire o para provocar el desplazamiento del tejido diana desde el interior de la punta. Retirar la pipeta de tipo II, después de una cantidad suficiente de medio de contraste ha sido liberado (3-5 l de solución de tinte).
4. Incubación
Incubar el tejido en la oscuridad entre 6 a 20 horas, dependiendo del tipo de experimento. Una vez que el tiempo suficiente se ha permitido para el llenado, tire suavemente lejos del electrodo del tejido dejando el tejido listo para formación de imágenes o histología.
Solución de problemas
- Si el tejido diana no entra fácilmente en la punta de la pipeta Tipo-I o está suelto una vez dentro, entonces el diámetro de la punta es el tamaño incorrecto. Si esto ocurre, tirar y usar una pipeta diferente.
- Antes de añadir el colorante a la aCSF en la pipeta de tipo I, asegurarse de que aCSF queda suficiente para que pueda ser alcanzado con elTipo II punta de la pipeta (Fig. 2D). De lo contrario, un espacio de aire existirá una vez que el colorante se añade. Si esto sucede, no agregue el colorante y eliminar el tracto axonal de la pipeta y luego dibujarla de nuevo con aCSF suficiente para ser alcanzado por la pipeta de tipo II.
- Si el nivel de aCSF en los aumentos de pipeta I Tipo-después de que se aspiró con la pipeta de tipo II, significa que el sello con el tejido no es buena. Utilizar un electrodo diferente, de lo contrario el colorante se diluyen durante el procedimiento de etiquetado.
- Si una burbuja de aire se introduce en la pipeta de tipo I, mientras que la inyección del colorante, drenar la burbuja por el avance del cierre de tipo II punta de pipeta a la burbuja y suavemente aplicando una presión negativa débil con la jeringa adjunta.
5. Los resultados representativos
Motoneuronas Para ilustrar una aplicación del método, al mismo tiempo cargadas, las fibras aferentes sensoriales y interneuronas de la médula con tres diferentes DEXTcorrió y conjugado con los tintes fluorescentes (Fig. 3). Como se ilustra en la figura. 3B, tres clases de neuronas han sido etiquetados, las fibras aferentes sensoriales (color rojo), las interneuronas se proyectan en el ventral, funículo (verde) y las neuronas motoras (azul).
Figura 1. Esquema que muestra con una pipeta de tipo I y tipo II Asamblea. (A) Un tipo I pipeta (luz azul) se coloca en un soporte de electrodo de modo que la espalda de apertura puede ser fácilmente conectado a la tubería de elastómero flexible (B) y en el que una pipeta de tipo II se puede insertar (C).
Figura 2. Esquema que muestra el proceso de carga de las motoneuronas con los tintes fluorescentes. (A) Una pipeta de tipo I se coloca cerca de la raíz ventral a ser llenado. (B) de succión se aplica a la pipeta para dibujar aCSF en la pipeta seguido por la raíz. (C-D) Desconectar el tubo de elastómero flexible desde el servidor de tipo I pipeta y reducir la cantidad de aCSF mediante la aplicación de succión a la pipeta de tipo II. (E) Introducir la punta de la pipeta de tipo II que contiene el colorante disuelto en el aCSF restante en la pipeta Tipo-I. (EF) Poco a poco llenar la pipeta de tipo I con el tinte y luego extraiga la pipeta de tipo II.
Figura 3. La aplicación del procedimiento de llenado de la médula espinal de ratón aislado. (A) Esquema que muestra los tres de tipo I pipetas usadas para llenar diferentes clases de neuronas en la médula espinal. Motoneuronas (azul, Blue Cascade dextrano) y sacros aferentes sensoriales (color rojo; de Texas-Red dextrano) se rellenaron a través de las raíces ventral y dorsal, respectivamente. Fluoresceína dextrano se utiliza para cargar las interneuronas espinales (verde) cuyos axones ascienden a través del funículo ventral (FV). 1 mg de cada tinte dextrano (10.000 MW, Molecular Probes)se disolvió en 6 l de agua destilada que contenía 0,2% de Triton X-100 (B). La imagen confocal de una sección de la médula sacra de la médula espinal en la que las neuronas estaban de vuelta marcado, como se describe en la Nota A. que los aferentes sensoriales son etiquetados principalmente ipsilateral con una proyección contralateral pocos. Las motoneuronas son etiquetados ipsilateral a la raíz ventral llena mientras que las interneuronas etiquetados son contralateral al lado del relleno (cabeza de flecha). Calibración de barra de 200 m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
