Summary
Ovariectomie en daaropvolgende vervanging van 17β-oestradiol door silastic capsules en perorale Nutella worden aangetoond bij ratten en muizen.
Abstract
Oestrogenen zijn een familie van vrouwelijke geslachtshormonen met een uitzonderlijk breed spectrum van effecten. Als ratten en muizen gebruikt oestrogeen onderzoek wordt dikwijls ovariectomie om de snel delende hormoonproductie ablatie, vervangen 17β-oestradiol exogeen. Er is echter geen consensus over hoe het hormoon te worden toegediend om fysiologische serumconcentraties verkrijgen. Dit is cruciaal omdat de 17β-estradiol niveau / administratie methode diep van invloed op de experimentele resultaten 1-3. We hebben in een reeks van studies kenmerkend was voor de verschillende vormen van 17β-estradiol administratie, het vinden van die onderhuidse silastic capsules en per-orale moer-ijs Nutella zijn superieur aan de handel verkrijgbaar slow-release pellets (geproduceerd door het bedrijf Innovatief Onderzoek van Amerika) en dagelijkse injecties op het gebied van het produceren van fysiologisch serum concentraties van 17β-estradiol 4-6. Onder de advantages van de moer-ijs-methode, die eerder is gebruikt voor buprenorfine bestuur 7, is dat wanneer gebruikt voor het oestrogeen administratie het lijkt op perorale hormoonvervangende therapie en is niet-invasief. De subcutane silastic capsules zijn handig en produceren de meest stabiele serumconcentraties. Deze video artikel bevat stap-voor-stap demonstraties van ovariëctomie en 17β-estradiol hormoon vervanging door silastic capsules en perorale Nutella bij ratten en muizen, gevolgd door een bespreking van belangrijke aspecten van de administratieve procedures.
Protocol
1. Ovariëctomie via de Dorsale Route
- Verdoven dier, bijvoorbeeld met 1,5% isofluraan (4% inductie) in een zuurstof / lachgas 30% / 70% mengsel. Plaats het dier in buikligging op een verwarmingsplaat verbonden met een rectale thermometer. Het is belangrijk om een dunne laag isolatie tussen de dieren en de plaat en dat de thermometer terugmeldingssysteem houdt de lichaamstemperatuur binnen 37 ± 0,5 ° C. Breng gel voor oogbescherming en beheren van 5 mg Rimadyl / kg lichaamsgewicht verdund in een zoutoplossing subcutaan aan de laterale aspect van de nek van het dier voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Cephally Shave een 4 * 4 cm (3 * 3 cm voor muizen) gebied van het bekken. Grondig het geschoren gebied met bijvoorbeeld Jodopax voordat die het dier met een 4 * 4 cm opening operatie vel.
- Maak een 2-3 cm middellijn incisie en bot ontleden de huid van de onderliggende fascia. Een cm lateraal van de middellijn, maak een andere incisie through de fascia. Botweg zijdelings ontleden onder deze fascia zo oppervlakkig als mogelijk tot het bereiken van de buikholte.
- Behulp van een pincet, pak het vetweefsel, dat de eierstok schouwen in de buikholte en trek het voorzichtig uit. Identificeer de eierstok en ligeren de baarmoeder horens en schepen 0.5-1 cm proximaal van deze structuur. Snijd de eierstok en geligeerde vetweefsel en zet de resterende weefsel terug in de buikholte. Maak nog een incisie in de contralaterale fascia en herhaal de procedure.
- Sluit de wonden, bij voorkeur met behulp van een monofilament hechtdraad, en wakker laten we het dier van anesthesie. Plaats het dier in een verwarmde kooi (25-27 ° C) gedurende tenminste 2 uren na de operatie. De dieren moeten afzonderlijk worden de eerste dagen na de operatie gehuisvest. Het is cruciaal dat de kooi regelmatig wordt gereinigd / vervangen tijdens de fase van herstel. Vierentwintig uur na de operatie, subcutaan injecteren de dieren met een andere 5 mg Rimadyl / kg lichaamsgewicht verdund inzoutoplossing.
2. Subcutane toediening van 17β-estradiol door Silastic Capsules
- Meng de gewenste hoeveelheid 17β-oestradiol in sesamolie. Voor de fysiologische concentraties bij ratten en muizen, raden wij aan 180 pg / ml en 18-36 ng / ml. Placebo capsules zijn gevuld met pure sesamolie.
- Knip 3 cm (2 cm voor muizen) een lengte van silastic buizen en 5 mm (3 mm voor muizen) lengtes van houten stokken applicator voor het aansluiten. Met behulp van een tang, knijp een houten plug in de silastic capsule voor het injecteren van de 17β-estradiol/sesame olie oplossing voor de gehele lengte te vullen. Voorzichtig de dop op de silastic capsule in het open einde met een andere houten plug (de stekkers worden verondersteld om permanent te verblijven in de capsule). Incubeer de capsules in de resterende 17β-estradiol-oplossing 's nachts voor implantatie.
- Implantatie van de capsule kan worden uitgevoerd tijdens de anesthesie gebruikt bij ovariëctomie bij ratten. Voor mice wordt echter een 14-daags herstelperiode na ovariectomie raden om het risico van de capsule ketel door het fragiele huid te voorkomen.
- Na chirurgische preparaten in 1,1 of na het sluiten van de ovariectomie insnijding scheren en wassen een 2 * 2 cm oppervlakte op de dorsale zijde van de hals van het dier. Maak een 1 cm incisie en botweg caudolaterally ontleden een subcutane pocket, met veel ruimte voor de capsule. Veeg de silastic capsule (dat tot nu-punt is geïncubeerd 17β-oestradiol oplossing) en voorzichtig te installeren door de snede, die vervolgens wordt gesloten door een hechtdraad. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de capsule stammen huid zo min mogelijk, met name in de directe omgeving van de wond. Van productie van capsules de implantatie, is het belangrijk dat besmetting wordt voorkomen.
3. Perorale toediening van 17β-estradiol via de Nut-ijs Nutella
- Grondig te ontbinden 17β-estradiol in sesamolie, en dan meng de sesamolie met de Nutella. We raden aan elke dagelijkse portie 28 ug 17β-estradiol, 5 ui sesamolie en 1 g Nutella per kilogram lichaamsgewicht voor ratten en 1,12 microgram 17β-estradiol, 0,312 ul sesamolie en 60 mg Nutella voor elke 30-g muis bevat. Placebo moer-ijs is op dezelfde manier bereid maar dan zonder de 17β-estradiol.
- Train de dieren om hormoon-vrije moer-ijs te eten vijf dagen voorafgaand aan het experiment. De eerste drie dagen van de opleiding, moeten de ratten optimaal worden getraind in groepen (ongeveer 0,5 g Nutella tot 2-5 dieren), in hun eigen kooien. Op de vierde en vijfde dag van de opleiding, worden de dieren in aparte kooien voor het ontvangen van de dagelijkse portie van de experimentele situatie lijken.
- Tijdens het experiment worden de dieren in afzonderlijke kooien om voeding gelegenheid, waarna de Nutella gedeelte wordt gevoerd op kleine keramische tegels. Indien training is uitgevoerd als hierboven our ervaring is dat meer dan 95% van de ratten en muizen de moer-ijs te accepteren, en een keer volledig gewend, de meeste van de dieren eten het binnen enkele seconden.
4. Representatieve resultaten
Fysiologisch serum 17β-estradiol concentraties, die de huidige methoden richten zich voort te planten, zijn ongeveer 5 tot 140 pg / ml voor ratten en 5-35 pg / ml voor muizen 4,6. De subcutane silastic capsules volgens de instructies hierboven bij toediening aan 300 g vrouwelijke Sprague-Dawley ratten, produceren langzaam afneemt 17β-oestradiol serum van ongeveer 40 pg / ml dag 2 tot 10 pg / ml dag 35. Echter, direct na de toediening, kan een serumconcentratie piek rond de 1000 pg / ml worden verwacht, vallen op de fysiologische bereik binnen 8 uur (Figuur 1A) 4,5. De silastic capsules voor muizen hierboven beschreven met 36 ug 17β-estradiol/mL, indien toegediend aan 25 g vrouwelijke C57BL / 6 muizen, maken serum concentrations die langzaam afnemen van ongeveer 90 pg / ml dag 2 tot 25 pg / ml dag 35. Dit wordt waarschijnlijk voorafgegaan door een vergelijkbare piek zoals in de ratten, hoewel dit niet onderzocht (figuur 1B) 6.
De perorale Nutella methode met de doseringen hierboven beschreven toegediend aan 300 g vrouwelijke Sprague-Dawley ratten, maakt fysiologische niveaus van 17β-oestradiol met dagelijkse fluctuaties van 10-70 pg / ml (Figuur 2A) 4. Voor muizen met de bovenstaande dosering dagelijkse schommelen tussen ongeveer 20 en 120 pg / ml (Figuur 2B) 6.
iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
Figuur 2 presenteert gestileerde grafieken 17β-oestradiol concentraties in ratten (A, n = 15). 4 en muizen (B, n = 10) 6 als gevolg van dagelijkse toediening hormoon in Nutella. De perorale Nutella-methode maakt de dagelijkse pieken, maar lang niet zo hoog als die door subcutane of intraveneuze methoden. Dit simuleert de farmacokinetiek van menselijke hormoon en de perorale behandeling kan doorgaan zolang als nodig, zelfs indien het voorbeeld slechts een eerste 96 uur presenteren. De gearceerde gebieden komen overeen met fysiologische 17β-estradiol serum concentraties in intacte vrouwelijke ratten en muizen respectievelijk. Hoewel visueel niet aangetoond in de grafieken is er inter-individuele variabiliteit in de 17β-estradiol concentraties, waardoor variatiecoëfficiënten 40 tot 132% bij ratten en van 13 tot 219% in muizen met de Nutella-methode (zeer lage gemiddelde concentraties genereren vaak hogeVariatiecoëfficiënten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De administratie modi hierboven gepresenteerd hebben in eerdere studies bleek superieur aan commerciële slow-release tabletten en injecties op het gebied van het produceren van fysiologisch serum concentraties van 17β-estradiol. Terwijl de slow-release pellets te produceren zeer hoog en langdurig serumconcentratie pieken, de injecties veroorzaken extreme, dagelijks hormoonschommelingen en vereisen herhaalde stressvolle omgang met de dieren 4-6. Het belang van het kiezen van een adequate administratie modi wordt onderstreept door de recente studies waaruit blijkt dat, terwijl een lage dosis 17β-estradiol administratie regimes (zoals de technieken die in dit artikel) te beschermen tegen cerebrale ischemie 8-10, de 17β-estradiol concentraties geproduceerd door de commerciële slow-release pellets kan eigenlijk verhoging van de cerebrale schade 1,2,11-14. Drinkwater administratie en orale sondevoeding zijn twee andere, minder vaak, de methoden die zijn getest. Het beheer van de hormoon via het drinkwater heeft zijn grootste voordeel in het zijn extreem niet-invasieve, omdat bijna geen dieren omgaan helemaal nodig is. Echter, 17β-oestradiol niet oplosbaar is in water zonder emulgator, de individuele wateropname is moeilijk te controleren en als het doel is van het verbruik van een pil ander nadeel is dat de muizen water drinken tijdens de gehele 24 uur . Orale sondevoeding heeft de grootste nadeel dat het stress van het dier en kan slokdarm letsel die eetgedrag kunnen beïnvloeden.
De hier beschreven methoden - silastic capsules en perorale Nutella - zijn beide geschikt voor korte termijn oestrogeen toediening en voor een langere periode van maximaal 5-6 weken. Indien hogere doses worden toegediend dan hierboven beschreven, ongeacht het type van toediening medium kan lange oestrogeentoediening ernstige bijwerkingen zoals urethrale occlusie door mucosale proliferatie 15.
"> De hier beschreven werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast over dosering capsule lengte etc. Bijvoorbeeld kan het gerechtvaardigd om zowel de 17β-oestradiol doses zowel capsules en Nutella in de muis regimes meer geleidelijk te bereiken fysiologisch serum 6 te verlagen. Indien wijzigingen worden aangebracht, of indien de technieken worden gebruikt in andere stammen van dieren dan reeds onderzocht, is het belangrijk om opnieuw bevestigen de methoden meten 17β-oestradiol in serum monsters. Deze serummonsters worden verkregen op verschillende tijdstippen -wijst op de gehele dosis-respons relatie / curve, en niet slechts een korte blik. baarmoeder gewichten weerspiegelen zijn gebruikt door sommige auteurs in plaats van serum 17β-estradiol concentraties als een maat voor de biologische effecten van 17β-estradiol. echter duidelijk baarmoeder gewichten weerspiegelen de specifieke effecten van oestrogenen op het endometrium en komen niet noodzakelijk overeen de effecten van oestrogenen op andere systemen. Furthaar, wordt de baarmoeder gewicht slechts zwak gecorreleerd aan serumoestrogeenspiegels 4,6.Dagelijkse consumptie van grote hoeveelheden energie-rijke Nutella zou kunnen leiden tot gewichtstoename. Echter, de kleine bedragen hierboven beschreven alleen komen overeen met minder dan 5% van de dieren de dagelijkse energie-inname en excessieve gewichtstoename is niet waargenomen in onze studies met behulp van Nutella.
Het cruciale verschil in het werken met ratten en muizen verdient speciale aandacht. Ook al strenge hygiëne cruciaal is, ongeacht van diersoorten, muizen gevoeligheid voor infecties pleit voor controle op nog hoger niveau dan bij het werken met ratten. Zo moet een zorgvuldige desinfectie van de huid voorafgaand aan de incisie, frequente verandering van medische handschoenen en het gebruik van steriele chirurgische instrumenten niet in gevaar worden gebracht. Implantaten zijn altijd broeinesten voor infecties. De dieren moeten daarom regelmatig worden onderzocht op tekenen van infectie na capsule implantatie. Als een abces is gevormd rondhet implantaat, raden wij aan dat het dier ingeslapen is of dat de capsule is verwijderd, de wond zorgvuldig gereinigd, en een andere capsule weer door middel van een nieuwe incisie. Verder is de huid van muizen rug is veel kwetsbaarder dan bij ratten, rechtvaardigt twee weken van herstel na ovariëctomie voordat capsule administratie.
De methoden hierboven besproken kunnen ook worden gebruikt voor andere stoffen dan 17β-oestradiol. Het is echter belangrijk dat de farmacokinetiek en dosis van elk stelsel nauwkeurig wordt gekenmerkt, bij voorkeur door opeenvolgende serum metingen van de toegediende stof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd gefinancierd door de Universiteit van Linköping en de County Council van Östergötland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy. |
| Lubrithal eye gel | Leo Laboratories | Eye protection during surgery. | |
| Jodopax vet | Pharmaxim | Surgery disinfection. | |
| Vicryl 4-0 suture | Johnson & Johnson | Wound suture and ovary ligation. | |
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-1G | In sesame oil for silastic capsules and Nutella. |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol. |
| Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm | Dow Corning | 508-008 | Production of silastic capsules. |
| Wooden applicator stick | Selefatrade | 12-0783 | Capping of silastic capsules. |
| Nutella | Ferrero | Medium for peroral 17β-estradiol. |
References
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
- Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
- Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
- Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
- Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
- Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
- Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
- Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
- Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
- Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).
