Summary
Ovariectomia e subsequente substituição do 17β-estradiol, por meio de cápsulas de silastic e Nutella perorai são demonstrados em ratos e ratinhos.
Abstract
Estrogens são uma família de hormonas sexuais femininos com um espectro excepcionalmente ampla de efeitos. Quando os ratos e ratinhos são utilizados na investigação estrogénio são vulgarmente ovariectomizados, a fim de ablação a produção da hormona rapidamente bicicleta, substituindo o exogenamente 17β-estradiol. Há, no entanto, a falta de consenso em relação a como a hormona deve ser administrada para se obter as concentrações séricas fisiológicas. Isto é crucial uma vez que o 17β-estradiol método nível / administração influencia profundamente os resultados experimentais 1-3. Temos em uma série de estudos caracterizados os diferentes modos de administração 17β-estradiol, encontrando que as cápsulas subcutâneas silastic e por-oral Nutella porca creme-são superiores aos disponíveis comercialmente peletes de libertação lenta (produzido pela empresa Research Innovative da América) e injecções diárias, em termos de produção de fisiológicas concentrações séricas de 17β-estradiol 4-6. Entre os advantages do método porca creme, que anteriormente foi utilizado para a administração da buprenorfina 7, é que, quando utilizada para a administração estrogénio que se assemelha a terapia de substituição hormonal perorai e é não-invasivo. As cápsulas subcutâneas silastic são convenientes e produzir as concentrações mais estáveis no soro. Este artigo contém vídeo passo-a-passo demonstrações de ovariectomia e 17β-estradiol reposição hormonal por cápsulas de silastic e Nutella via oral em ratos e camundongos, seguido por uma discussão de aspectos importantes dos procedimentos administrativos.
Protocol
1. Ovariectomia pela Rota Dorsal
- Anestesiar o animal, por exemplo, utilizando 1,5% de isoflurano (4% para a indução) em um óxido de oxigénio / nitroso 30% de mistura / 70%. Colocar o animal na posição de bruços em uma placa de aquecimento ligada a um termómetro rectal. É importante ter uma fina camada de isolamento entre o animal e da placa, e que o sistema de termómetro feed-back mantém a temperatura do corpo dentro de 37 ± 0,5 ° C. Aplicar gel de protecção dos olhos e administrar 5 mg de peso corporal Rimadyl / kg diluído em solução salina por via subcutânea no aspecto lateral do pescoço do animal para o alívio da dor pós-operatória.
- Shave área de 4 * 4 cm (3 * 3 cm para ratos) cephally da crista ilíaca. Lave cuidadosamente a área raspada com por exemplo Jodopax antes de cobrir o animal com uma folha de 4 4 cm * cirurgia de abertura.
- Faça uma incisão de 2-3 cm da linha média e sem rodeios dissecar a pele da fáscia subjacente. Um cm lateral da linha média, fazer uma outra incisão through a fáscia. Bluntly dissecar lateralmente no âmbito do presente fáscia como superficialmente quanto possível, até atingir a cavidade abdominal.
- Com uma pinça, pegue o tecido adiposo que rodeia o ovário na cavidade abdominal e puxe-o para fora. Identificar o ovário e ligadura dos cornos uterinos e vasos 0,5-1 cm proximal desta estrutura. Cortar o ovário e tecido adiposo ligados e voltar a colocar a tecido remanescente para dentro da cavidade abdominal. Fazer outra incisão na fáscia contralateral e repita o procedimento.
- Fechar as feridas, de preferência usando uma sutura de monofilamento, e deixar o animal acordado da anestesia. Colocar o animal numa gaiola aquecida (25-27 ° C) durante pelo menos 2 horas após a cirurgia. Os animais devem ser alojados separadamente os primeiros dias pós-operatório. É fundamental que a gaiola é frequentemente limpas / substituídas durante a fase de recuperação. Vinte e quatro horas após a cirurgia, os animais injectar por via subcutânea com outro 5 mg de peso corporal Rimadyl / kg diluído emsolução salina.
2. A administração subcutânea de 17β-estradiol através Cápsulas Silastic
- Misturar bem a quantidade desejada de 17β-estradiol em óleo de sésamo. Para concentrações fisiológicas em ratos e ratinhos, recomendamos 180 mcg / mL e 18-36 mcg / mL, respectivamente. As cápsulas de placebo são preenchidos com óleo de sésamo puro.
- Corte 3 cm (2 cm para ratos) comprimentos de tubos de silastic e 5 mm (3 mm para camundongos) comprimentos de varas aplicador de madeira para ligar. Usando uma pinça, espremer uma tomada de madeira no interior da cápsula de silastic antes de injectar a solução de óleo 17β-estradiol/sesame para encher todo o comprimento. Suavemente tampar a cápsula de silastic na extremidade aberta com uma outra tomada de madeira (os tampões devem permanecer permanentemente na cápsula). Incubar as cápsulas na solução 17β-estradiol remanescente durante a noite antes do implante.
- Implante da cápsula pode ser realizada durante a anestesia utilizada em ovariectomia em ratos. Para mice, no entanto, um período de recuperação de 14-dias após a ovariectomia é fortemente recomendada para minimizar o risco da cápsula saliente através da pele frágil.
- Após as preparações cirúrgicas como na 1.1, ou após o fechamento da incisão ovariectomia, fazer a barba e lavar a 2 * A área de 2 cm no dorso do pescoço do animal. Faça uma incisão de 1 cm e sem rodeios dissecar uma bolsa subcutânea caudolaterally, com amplo espaço para a cápsula. Seque a cápsula de silastic (que, até este ponto do tempo foi incubado na solução de 17β-estradiol) e suavemente instalar-lo através da incisão, a qual é subsequentemente fechado por uma sutura. É essencial para se certificar de que as estirpes de cápsula pele a tão pouco quanto possível, particularmente na área próxima da ferida. Desde a produção de cápsulas para a implantação, é importante que a contaminação é evitada.
3. Administração perorai de 17β-estradiol através da Nutella Nut creme-
- A dissolução completa 17β-estradiol em óleo de gergelim, e em seguida, misture o óleo de gergelim com a Nutella. Sugerimos que cada porção diária contém 28 ug 17β-estradiol, 5 uL de óleo de sésamo e 1 Nutella g por quilograma de peso corporal para os ratos e 1,12 ug 17β-estradiol, 0,312 óleo de sésamo e 60 uL Nutella mg por cada rato 30-g. Placebo porca creme-se preparado de forma idêntica excepto sem a 17β-estradiol.
- Treinar os animais para comer sem hormônios porca creme para cinco dias anteriores ao experimento. Os três primeiros dias de treinamento, os ratos devem ser otimamente treinados em grupos (aproximadamente 0,5 g de Nutella 2-5 animais), em gaiolas de origem. Nos quarto e quinto dias de treinamento, os animais são colocados em gaiolas separadas antes de receber a porção diária para assemelhar-se a situação experimental.
- Durante a experiência, os animais são colocados em gaiolas separadas para cada ocasião de alimentação, após o que a porção Nutella é servido em pequenas azulejos de cerâmica. Se a formação foi realizada como acima, oexperiência ur é que mais de 95% dos ratos e ratinhos aceitar a porca de creme, e uma vez totalmente habituado, a maioria dos animais consomem-lo dentro de segundos.
4. Os resultados representativos
Soro fisiológico 17β-estradiol concentrações, que os métodos actuais destinados a reproduzir, são aproximadamente 5-140 pg / mL para ratos e 5-35 pg / mL para ratinhos 4,6. As cápsulas subcutâneas silastic de acordo com as instruções acima, quando administrado a 300 g fêmeas Sprague-Dawley, produzir diminuição lenta 17β-estradiol concentrações de soro de cerca de 40 pg / mL dia 2 ao 10 dia pg / mL 35. No entanto, imediatamente após a administração, um pico de concentração no soro de cerca de 1000 pg / mL pode ser esperado, caindo para a gama fisiológica dentro de 8 horas (Figura 1A) 4,5. As cápsulas de silastic para ratinhos descritos acima, com 36 ug 17β-estradiol/mL, quando administrada a 25 g fêmea C57BL / 6, tornam conc soroentrations que diminuem lentamente a partir de aproximadamente 90 pg / mL dia 2-25 pg / mL dia 35. Isto é provavelmente precedido por um pico semelhante como foi encontrado nos ratos, embora isso não tem sido investigada (Figura 1B) 6.
O método Nutella perorai com as dosagens acima descrito, quando administrado a 300 g fêmeas Sprague-Dawley, torna níveis fisiológicos de 17β-estradiol com flutuações diárias entre 10-70 pg / mL (Figura 2A) 4. Para ratinhos usando a dosagem acima, os níveis diários flutuar entre aproximadamente 20 e 120 pg / mL (Figura 2B) 6.
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A Figura 2 gráficos que apresentam estilizados 17β-estradiol concentrações em ratos (A, n = 15). 4 e ratinhos (B, n = 10) 6 como uma consequência da administração hormona diariamente em Nutella. O método processa Nutella perorai picos diários, no entanto, de longe, não tão elevada como produzido por via subcutânea ou métodos intravenosas. Este imita a farmacocinética da terapia de substituição hormonal humano, eo tratamento perorai pode prosseguir durante o tempo que for necessário, mesmo se o exemplo acima apresentar apenas um período inicial de 96 horas. As áreas sombreadas correspondem a fisiológicas 17β-estradiol concentrações no soro em ratos fêmeas intactos e ratinhos, respectivamente. Mesmo embora não visualmente demonstrado nos gráficos, há variabilidade inter-individual nas concentrações 17β-estradiol, tornando os coeficientes de variação de 40-132%, em ratos e de 13 a 219% em ratos com o método Nutella (muito baixas concentrações médias muitas vezes geram altacoeficientes de variação).
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Discussion
As formas de administração apresentadas acima têm em estudos anteriores mostraram-se superiores a comerciais de libertação lenta e as injecções de peletes em termos de produção de fisiológicas concentrações séricas de 17β-estradiol. Enquanto pelotas liberação lenta produzir muito altas e prolongadas picos de concentração de soro, as injeções causam extremos, as flutuações hormonais diárias e exigem manuseio repetido estressante dos 4-6 animais. A importância da escolha de modos de administração adequada é realçada por estudos recentes indicam que, embora de baixa dose regimes 17β-estradiol administração (tais como as técnicas apresentadas no artigo de corrente) proteger contra 8-10 isquemia cerebral, as concentrações 17β-estradiol produzido pela comerciais de liberação lenta pelotas pode realmente aumentar o dano cerebral 1,2,11-14. Administração de água potável e gavagem oral são outros dois, menos freqüentes, os métodos que foram testados. Administrando o hormona através da água de beber tem a sua maior benefício em sendo extremamente não-invasivo, uma vez que manipulação dos animais quase não em todos é necessária. No entanto, 17β-estradiol não é solúvel em água, sem um agente emulsionante, a ingestão de água individual é difícil de controlar, e se o objectivo é de modo a reflectir o consumo de uma pílula, uma outra desvantagem é que os ratinhos beber a água durante os 24 horas . Gavagem oral tem a sua maior desvantagem na medida em que é estressante para o animal e pode causar lesões do esôfago, que podem afetar o comportamento de alimentação.
Os métodos descritos aqui - cápsulas de silastic e Nutella perorai - são ambos adequada para administração a curto prazo estrogénio e por longos períodos de até 5-6 semanas. Se usadas doses mais altas do que o descrito acima, independentemente do tipo de meio de administração, a longo prazo da administração do estrogénio pode causar graves efeitos secundários, tais como a oclusão uretral devido a proliferação da mucosa 15.
"> Os métodos aqui apresentados podem ser facilmente modificados em relação de dosagem, etc comprimento cápsula Por exemplo, pode ser útil para reduzir tanto as doses 17β-estradiol, em ambos os cápsulas e Nutella nos regimes de rato para mais firmemente alcançar fisiológicas concentrações séricas 6. No entanto, se todas as modificações são feitas, ou se as técnicas são utilizados em outras estirpes de animais do que já investigados, é crucial para validar os métodos de novo através da medição 17β-estradiol concentrações em amostras de soro. Estas amostras de soro devem ser obtidos em tempo de vários pontos para reflectir os inteiros de dose-resposta relativamente / curva, e não apenas vislumbre um curto. pesos uterinos têm sido utilizados por alguns autores em vez de soro 17β-estradiol concentrações como uma medida dos efeitos biológicos de 17β-estradiol. No entanto, evidentemente peso do útero refletir os efeitos específicos dos estrogênios sobre o endométrio e não necessariamente refletem os efeitos dos estrogênios em outros sistemas. Furtela, peso do útero é apenas fracamente correlacionada com os níveis de estrógeno sérico 4,6.O consumo diário de grandes quantidades de energia rico Nutella poderia causar ganho de peso. No entanto, as pequenas quantidades acima descritas apenas correspondem a menos de 5% da ingestão dos animais diária de energia e ganho de peso excessivo não foi observado nos nossos estudos usando Nutella.
A diferença crucial em trabalhar com ratos e camundongos merece ênfase especial. Apesar de higiene rigorosa é essencial, independentemente de espécies animais, os ratos sensibilidade a infecções chama para o escrutínio a nível ainda maior do que quando se trabalha com ratos. Por exemplo, a desinfecção cuidadosa da pele antes da mudança da incisão, frequente de luvas médicas e à utilização de instrumentos cirúrgicos estéreis não deve ser comprometida. Os implantes são sempre focos de infecções. Os animais devem ser examinados regularmente para detectar sinais de infecção após implante de cápsula. Se um abcesso é formado em tornoo implante, é recomendável que o animal é sacrificado ou que a cápsula é removido, a ferida meticulosamente limpos, e outra cápsula reintegrado através de uma incisão novo. Além disso, a pele do dorso ratinhos é muito mais frágeis do que em ratos, garantindo duas semanas de convalescença após ovariectomia antes da administração da cápsula.
Os métodos apresentados acima podem também ser utilizados para outras substâncias que não 17β-estradiol. No entanto, é importante que a farmacocinética e dosagens de cada regime é cuidadosamente caracterizado, de preferência por consecutivos medições séricos da substância administrada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O estudo foi financiado pela Universidade de Linköping e do Conselho Municipal de Östergötland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy. |
| Lubrithal eye gel | Leo Laboratories | Eye protection during surgery. | |
| Jodopax vet | Pharmaxim | Surgery disinfection. | |
| Vicryl 4-0 suture | Johnson & Johnson | Wound suture and ovary ligation. | |
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-1G | In sesame oil for silastic capsules and Nutella. |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol. |
| Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm | Dow Corning | 508-008 | Production of silastic capsules. |
| Wooden applicator stick | Selefatrade | 12-0783 | Capping of silastic capsules. |
| Nutella | Ferrero | Medium for peroral 17β-estradiol. |
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