Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ovariektomi og 17β-østradiol erstatning i rotter og mus: A Visual demonstrasjon

doi: 10.3791/4013 Published: June 7, 2012

Summary

Ovariektomi og påfølgende utskifting av 17β-østradiol ved hjelp av silastic kapsler og peroral Nutella er demonstrert i rotter og mus.

Abstract

Østrogen er en familie av kvinnelige kjønnshormoner med en eksepsjonelt bredt spekter av effekter. Når rotter og mus brukes i østrogen forskning de er ofte ovariectomized for å ablate raskt sykling hormon produksjon, erstatter 17β-østradiol eksogent. Det er imidlertid mangel på enighet om hvordan hormonet bør gis for å oppnå fysiologiske serumkonsentrasjoner. Dette er avgjørende fordi den 17β-østradiol nivå / administrasjon metode dypt påvirker de eksperimentelle resultatene 1-3. Vi har i en rekke studier som karakteriseres de ulike 17β-østradiol administrasjon, finne at subkutane silastic kapsler og per-oral nut-krem Nutella er overlegen kommersielt tilgjengelige slow-release pellets (produsert av selskapet nyskapende forskning of America) og daglige injeksjoner i form av produksjon av fysiologiske serumkonsentrasjoner av 17β-østradiol 4-6. Blant advantages av nut-krem metode, som tidligere har vært brukt til buprenorfin administrasjon 7, er at når det brukes for østrogen administrasjon den ligner peroral østrogenbehandling og er ikke-invasiv. De subkutane silastic Kapslene er praktisk og produsere de mest stabile serumkonsentrasjoner. Denne videoen artikkelen inneholder trinn-for-steg demonstrasjoner av ovariektomi og 17β-østradiol hormon erstatning etter silastic kapsler og peroral Nutella i rotter og mus, etterfulgt av en diskusjon av viktige sider av forvaltningen prosedyrer.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ovariektomi via Dorsal Route

  1. Anesthetize dyret, for eksempel med 1,5% isofluran (4% for induksjon) i en oksygen / dinitrogenoksid 30% / 70% blanding. Plasser dyret i liggende stilling på en varmeplate koblet til en rektal termometer. Det er viktig å ha et tynt lag med isolasjon mellom dyret og plate, og at termometeret feed-back system holder kroppstemperaturen innenfor 37 ± 0,5 ° C. Påfør gel for øyebeskyttelse og administrere 5 mg Rimadyl / kg kroppsvekt fortynnet i saltvann subkutant på den laterale aspekt av dyrets nakke for postoperativ smertelindring.
  2. Shave en 4 * 4 cm (3 * 3 cm for mus) område cephally fra hoftekam. Vask det barberte området med for eksempel Jodopax før tildekking dyret med en 4 * 4 cm blenderåpning kirurgi ark.
  3. Lag en 2-3 cm midtlinjen snitt og uten omsvøp dissekere huden fra den underliggende fascia. En cm sideveis av midtlinjen, lage en ny snitt through instrumentpanelet. Spissen dissekere sideveis under dette konseptet så overfladisk som mulig inntil nå bukhulen.
  4. Ved hjelp av pinsett, ta tak i fettvevet som omgir eggstokk i bukhulen og dra det forsiktig ut. Identifiser eggstokk og ligate livmor horn og fartøy 0,5-1 cm proksimalt av denne strukturen. Skjær eggstokk og ligated fettvev og sette de resterende vevet tilbake i bukhulen. Lag en annen snitt i kontralaterale fascia og gjenta prosedyren.
  5. Lukk sårene, fortrinnsvis ved hjelp av en monofilament sutur, og la dyret våkne av narkosen. Plasser dyret i et oppvarmet bur (25-27 ° C) i minst 2 timer etter operasjonen. Dyrene bør bli plassert separat de første dagene etter operasjonen. Det er avgjørende at buret er ofte rengjøres / skiftes under restitusjonsfasen. Tjuefire timer etter operasjonen, injiserer dyrene subkutant med ytterligere 5 mg Rimadyl / kg kroppsvekt fortynnet isaltvann.

2. Subkutan administrasjon av 17β-østradiol gjennom Silastic kapsler

  1. Bland ønsket mengde 17β-østradiol i sesamolje. For fysiologiske konsentrasjoner i rotter og mus, anbefaler vi 180 mikrogram / ml og 18-36 mikrogram / ml henholdsvis. Placebo kapsler er fylt med ren sesamolje.
  2. Skjær 3 cm (2 cm for mus) lengder av silastic slange og 5 mm (3 mm for mus) lengder av tre applikator pinner for plugging. Ved hjelp av tang, klemme en tre plugg inn i silastic kapsel før injisere 17β-estradiol/sesame olje løsning for å fylle hele lengden. Forsiktig cap silastic kapselen i den åpne enden med en annen tre plugg (pluggene er ment å forbli permanent i kapselen). Inkuber kapsler i den gjenværende 17β-østradiol løsning over natten før implantasjon.
  3. Implantasjon av kapselen kan utføres under bedøvelse brukes ved ovariektomi i rotter. For miCE, derimot, er en 14-dagers utvinning perioden etter ovariektomi anbefales sterkt å minimere risikoen for at kapselen stikker gjennom den skjøre huden.
  4. Etter kirurgiske preparater som i 1.1, eller etter lukke ovariektomi snitt, barbere og vaske en 2 * 2 cm område på dorsal del av dyrets nakke. Lag en 1 cm snitt og uten omsvøp dissekere en subkutan lomme caudolaterally, med god plass for kapselen. Tørk silastic kapsel (som inntil denne gangen-punktet har vært inkubert i 17β-østradiol løsning) og forsiktig installere det gjennom snittet, som deretter lukkes med en sutur. Det er avgjørende å sørge for at kapselen stammer huden så lite som mulig, spesielt i området nær såret. Fra produksjon av kapsler til implantering, er det viktig at forurensning unngås.

3. Peroral administrasjon av 17β-østradiol via Nut-kremen Nutella

  1. Grundig oppløse 17β-østradiol i sesamolje, og deretter blande sesamolje med Nutella. Vi anbefaler at hver daglige porsjon inneholder 28 mikrogram 17β-østradiol, 5 mL sesamolje og 1 g Nutella per kilo kroppsvekt for rotter og 1,12 mg 17β-østradiol, 0,312 mL sesamolje og 60 mg Nutella for hver 30-g mus. Placebo mutter-krem er forberedt identisk bortsett uten 17β-østradiol.
  2. Tren dyrene å spise hormon-fri nut-krem for fem dager før forsøket. De tre første dagene med trening, bør rottene optimalt trenes i grupper (ca 0,5 g Nutella til 2-5 dyr), i deres hjem bur. På fjerde og femte dager med trening, blir dyrene satt i separate bur før de fikk den daglige delen å likne den eksperimentelle situasjonen.
  3. Under eksperimentet blir dyrene settes i egne bur for hver fôring anledning, hvoretter Nutella del serveres på små keramiske fliser. Hvis treningen har blitt utført som ovenfor, oUr erfaring er at mer enn 95% av rotter og mus godta nut-krem, og en gang fullt tilvenne de fleste av dyrene det konsumerer i løpet av sekunder.

4. Representative Resultater

Fysiologiske serum 17β-østradiol konsentrasjoner, som dagens metoder tar sikte på å gjengi, er ca 5-140 pg / ml for rotter og 5-35 pg / ml for mus 4,6. De subkutane silastic kapslene i henhold til instruksjonene ovenfor, når det gis til 300 g kvinnelige Sprague-Dawley rotter, produserer langsomt minkende 17β-østradiol serumkonsentrasjon fra rundt 40 pg / ml dag 2-10 pg / ml dag 35. Men umiddelbart etter administrasjon, kan en serumkonsentrasjon topp rundt 1000 pg / ml forventes, fallende til fysiologiske området innen 8 timer (figur 1A) 4,5. De silastic kapsler for mus beskrevet ovenfor med 36 mikrogram 17β-estradiol/mL, når det gis til 25 g kvinnelig C57BL / 6 mus, gjengi serum konsentrations som sakte nedgang fra ca 90 pg / ml dag 2-25 pg / ml dag 35. Dette er trolig innledes med en lignende topp som ble funnet i rotter, men dette har ikke blitt undersøkt (Figur 1B) 6.

Den peroral Nutella metoden med de doser som er beskrevet ovenfor, når det gis til 300 g kvinnelige Sprague-Dawley rotter, gjengir fysiologiske nivåer av 17β-østradiol med daglige svingninger mellom 10-70 pg / ml (Figur 2A) 4. For mus bruker over dosering, de daglige nivåer svinge mellom ca 20 og 120 pg / ml (figur 2B) 6.

Figur 1
. Rong> Figur 1 stiliserte grafene presenterer 17β-østradiol konsentrasjoner i rotter (A, n = 10 i time-poeng opp til 24 t, n = 15 i senere tid-poeng) 4,5 og mus (B, n = 10) 6 etter kapsel implantasjon. De silastic kapsler produsere en kort innledende topp av serumkonsentrasjon opp til 1000 pg / ml, men nedgang i løpet av timer til nivåer under 100 pg / ml. For de kommende 4-5 uker, kapslene gi stabile, selv om stadig synkende, serumkonsentrasjoner. De skraverte områdene tilsvarer fysiologiske 17β-østradiol serumkonsentrasjoner i intakte kvinnelige rotter og mus henholdsvis. Selv om ikke visuelt demonstrert i grafene, er det inter-individuelle variabiliteten i 17β-østradiol konsentrasjoner, rendering variasjonskoeffisient 27-183% i rotter og 28-115% i mus med silastic kapsel-metoden (svært lav gjennomsnittlig konsentrasjoner ofte generere høye variasjonskoeffisient).

iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
Figur 2 stiliserte grafene presenterer 17β-østradiol konsentrasjoner i rotter (A, n = 15). 4 og mus (B, n = 10) 6 som en konsekvens av daglig hormon administrasjonen i Nutella. Den peroral Nutella Metoden gjør daglige topper, men ikke langt så høyt som produseres av subkutant eller intravenøst ​​metoder. Dette etterligner farmakokinetikken av menneskelig hormon replacement therapy, og peroral behandling kan fortsette så lenge som nødvendig, selv om eksempelet ovenfor bare presentere en innledende 96 timer. De skraverte områdene tilsvarer fysiologiske 17β-østradiol serumkonsentrasjoner i intakte kvinnelige rotter og mus henholdsvis. Selv om ikke visuelt demonstrert i grafene, er det inter-individuelle variabiliteten i 17β-østradiol konsentrasjoner, rendering variasjonskoeffisient 40-132% i rotter og 13-219% i mus med Nutella metoden (svært lave gjennomsnittlige konsentrasjonen ofte genererer høyvariasjonskoeffisient).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De administrative moduser presentert ovenfor har i tidligere studier vist seg overlegen i forhold til kommersielle slow-release pellets og injeksjoner i form av produksjon av fysiologiske serumkonsentrasjoner av 17β-østradiol. Mens den sakte-release pellets produsere svært høye og langvarig serumkonsentrasjonsprofiler topper, injeksjoner forårsake ekstreme, daglige hormon svingninger og krever gjentatt stressende håndtering av dyrene 4-6. Betydningen av å velge adekvate administrative moduser fremheves av nyere studier som indikerer at mens lavdose 17β-østradiol administrasjon regimer (for eksempel teknikker som presenteres i den nåværende artikkelen) beskytte mot hjerneiskemi 8-10, de 17β-østradiol konsentrasjoner produsert av kommersielle slow-release pellets kan faktisk øke cerebral skade 1,2,11-14. Drikkevann administrasjon og oral gavage er to andre, mindre hyppige, metoder som har blitt testet. Å forvalte hormon via drikkevann har sin største fordelen ved å være ekstremt non-invasiv, siden nesten ingen dyr håndtering i det hele tatt er nødvendig. Imidlertid er 17β-østradiol ikke løselig i vann uten en emulgator, er det enkelte vanninntaket vanskelig å kontrollere, og hvis målet er å reflektere forbruket av en pille, er en annen ulempe at musene drikke vannet under hele 24 timer . Oral gavage har sin største ulempe i at det er stressende for dyret og kan forårsake esophageal skade, noe som kan påvirke fôring atferd.

Metodene som beskrives her - silastic kapsler og peroral Nutella - er både egnet for kortsiktige østrogen administrasjon og for lengre perioder på inntil 5-6 uker. Dersom høyere doser brukes enn beskrevet ovenfor, uavhengig av type administrasjon medium, kan langsiktig østrogen administrasjon forårsake alvorlige bivirkninger som urethral okklusjon pga slimhinnene spredning 15.

"> De metodene som presenteres her kan enkelt modifiseres om dosering, kapsel lengde osv. For eksempel kan det være berettiget å senke både 17β-østradiol doser i både kapsler og Nutella i musen regimer til mer jevnt oppnå fysiologiske serumkonsentrasjoner 6. Men hvis noen endringer er gjort, eller om teknikkene anvendes i andre stammer av dyr enn allerede undersøkt, er det avgjørende å validere metodene på nytt ved å måle 17β-østradiol konsentrasjoner i serum. Disse serumprøver må innhentes på flere tidspunkt -poeng for å gjenspeile hele dose-respons forhold / kurve, og ikke bare en kort glimt. Livmor vekter har blitt brukt av noen forfattere i stedet for serum 17β-østradiol konsentrasjoner som et mål på de biologiske effektene av 17β-østradiol. Men tydeligvis uterine vekter gjenspeiler de spesifikke effekter av østrogen på livmorslimhinnen, og reflekterer ikke nødvendigvis effekten av østrogen på andre systemer. Furthenne, er livmor vekt bare svakt korrelert til serumøstrogennivåer 4,6.

Daglig inntak av store mengder energi-rik Nutella kan føre til vektøkning. Men beskrev de små beløpene ovenfor bare tilsvare mindre enn 5% av dyrenes daglige energiinntak og overdreven vektøkning har ikke blitt observert i våre studier med Nutella.

Den avgjørende forskjellen på å jobbe med rotter og mus fortjenester spesiell vektlegging. Selv om strenge hygiene er sentralt uansett dyreart, kaller mus følsomhet for infeksjoner for kontroll på enda høyere nivå enn når du arbeider med rotter. For eksempel må nøye desinfeksjon av huden før snittet, hyppig skifte av medisinske hansker og bruk av sterile kirurgisk verktøy ikke bli kompromittert. Implantater er alltid hotbeds for infeksjoner. Dyrene må derfor jevnlig undersøkt for tegn på infeksjon etter kapsel implantasjon. Dersom en abscess dannes rundtimplantatet, anbefaler vi at dyret avlives eller at kapselen er fjernet, såret omhyggelig rengjort, og en annen kapsel gjeninnsatt gjennom et nytt snitt. Videre er huden på mus på ryggen mye mer skjøre enn i rotter, berettiger to ukers rekonvalesens etter ovariektomi før kapsel administrasjon.

Metodene som presenteres ovenfor kan også brukes til andre stoffer enn 17β-østradiol. Imidlertid er det viktig at farmakokinetikk og dosering av hvert regime er nøye preget, fortrinnsvis ved etterfølgende serumprøver målinger av den administrerte stoffet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Studien ble finansiert av Linköping University og fylkeskommune Östergötland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy.
Lubrithal eye gel Leo Laboratories Eye protection during surgery.
Jodopax vet Pharmaxim Surgery disinfection.
Vicryl 4-0 suture Johnson & Johnson Wound suture and ovary ligation.
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-1G In sesame oil for silastic capsules and Nutella.
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol.
Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm Dow Corning 508-008 Production of silastic capsules.
Wooden applicator stick Selefatrade 12-0783 Capping of silastic capsules.
Nutella Ferrero Medium for peroral 17β-estradiol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
  2. Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
  4. Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. (2011).
  5. Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
  6. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. (2011).
  7. Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
  8. Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
  9. Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
  10. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
  11. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
  12. Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
  13. Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
  14. Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
  15. Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).
Ovariektomi og 17β-østradiol erstatning i rotter og mus: A Visual demonstrasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013, doi:10.3791/4013 (2012).More

Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013, doi:10.3791/4013 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter