Summary
Ovariektomi og efterfølgende udskiftning af 17β-estradiol ved silastiske kapsler og peroral Nutella påvises i rotter og mus.
Abstract
Østrogener er en familie af kvindelige kønshormoner med et usædvanligt bredt spektrum af effekter. Når rotter og mus anvendes i østrogen forskning er almindeligt ovarieektomiseret for at ablatere hurtigt cykling hormon produktionen erstatte 17β-estradiol eksogent. Der er dog mangel på konsensus om, hvordan det hormon bør gives for at opnå fysiologiske serumkoncentrationer. Det er afgørende, da 17β-østradiol-niveau / administration metode dybtgående indflydelse på de eksperimentelle resultater 1-3. Vi har i en række undersøgelser karakteriserede de forskellige former for 17β-estradiol administration, fandt, at subkutane silastik kapsler og per-oral møtrik-creme Nutella er bedre end kommercielt tilgængelige langsom frigivelse pellets (produceret af selskabet Innovative Research of America) og daglige injektioner i form af fremstilling fysiologiske serumkoncentrationer af 17β-estradiol 4-6. Blandt advantages af møtrik-creme metode, der tidligere er blevet anvendt til buprenorphin administration 7, er, at når der anvendes til administration af østrogen den ligner peroral hormonerstatningsterapi og er ikke-invasiv. De subkutane silastik Kapslerne er praktisk og producere de mest stabile serumkoncentrationer. Denne video artikel indeholder trin-for-trin demonstrationer af ovariektomi og 17β-østradiol hormon udskiftning af silastik kapsler og peroral Nutella i rotter og mus, efterfulgt af en diskussion af vigtige aspekter af de administrative procedurer.
Protocol
1. Ovariektomi via den dorsale rute
- Bedøve dyret, for eksempel ved anvendelse af 1,5% isofluran (4% til induktion) i en oxygen / dinitrogenoxid 30% / 70% blanding. Sende dyret i maveleje-positionen på en varmeplade forbundet med et rektalt termometer. Det er vigtigt at have et tyndt lag af isolering mellem dyr og pladen, og at termometeret feedback-system holder legemstemperatur på 37 ± 0,5 ° C. Anvendes gel til øjenbeskyttelse og administrere 5 mg Rimadyl / kg legemsvægt fortyndet i saltvand subkutant på den laterale side af dyrets hals for postoperativ smertelindring.
- Shave en 4 * 4 cm (3 * 3 cm for mus) område cephally fra crista iliaca. Vaskes barberede område med for eksempel Jodopax før tildækning af dyret med en 4 * 4 cm åbning kirurgi ark.
- Lav en 2-3 cm midtlinie incision og ligeud dissekere huden fra den underliggende fascia. En cm laterale af midterlinjen, foretag et andet snit throuh fascia. Stumpt dissekere lateralt i denne fascia som overfladisk som muligt, indtil den når den abdominale kavitet.
- Ved hjælp af en pincet, det fedtvæv, der omgiver æggestokkene i bughulen grab og forsigtigt trække det ud. Identificer æggestokken og ligere Uterushornene og fartøjer 0,5-1 cm proksimalt for denne struktur. Skær ovariet og ligeret fedtvæv og sætte det resterende væv tilbage i bughulen. Lav et snit i den kontralaterale fascia og gentag proceduren.
- Lukke sår, fortrinsvis under anvendelse af en monofilament sutur, og lad dyret vågne fra bedøvelsen. Sende dyret i en opvarmet bur (25-27 ° C) i mindst 2 timer efter kirurgi. Dyrene skal anbringes separat de første dage efter operationen. Det er afgørende, at buret hyppigt rengøres / udskiftes under opsving fase. Fireogtyve timer efter kirurgi, injiceres dyrene subkutant med en anden 5 mg Rimadyl / kg legemsvægt fortyndet isaltvand.
2. Subkutan administration af 17β-estradiol gennem Silastic Kapsler
- Blandes grundigt ønskede mængde af 17β-estradiol i sesamolie. For fysiologiske koncentrationer i rotter og mus, anbefaler vi 180 mikrogram / ml og 18-36 mg / ml hhv. Placebokapsler er fyldt med rent sesamolie.
- Skåret 3 cm (2 cm for mus) længder af silastic-rør og 5 mm (3 mm i mus) længder af træ applikator stave til tilstopning. Ved hjælp af pincetter, en træ prop klemme i silastisk kapsel før indsprøjtning af 17β-estradiol/sesame olieopløsning at fylde hele længden. Forsigtigt hætten SILASTIC kapslen i den åbne ende med et andet træ stik (de stik formodes at opholde sig permanent i kapslen). Inkubér kapslerne i den resterende 17β-østradiol opløsning natten over før implantation.
- Implantering af kapslen kan udføres under anæstesi anvendes ved ovariektomi i rotter. For mice imidlertid en 14-dages restitutionsperiode efter ovariektomi kraftigt til at minimere risikoen for kapslen rager gennem den skrøbelige hud.
- Efter kirurgiske præparater som i 1,1 eller efter lukning af ovariektomi indsnit barbering og vaskes en 2 * 2 cm område på den dorsale side af dyrets hals. Lav en 1 cm incision og ligeud dissekere en subkutan lomme caudolaterally, med rigelig plads til kapslen. Tør Silastic kapslen (dvs. indtil dette tidspunkt-punkt er inkuberet i 17β-estradiol opløsning) og forsigtigt installere den gennem snittet, som derefter lukkes ved hjælp af en sutur. Det er afgørende for at sikre, at kapslen stammer huden så lidt som muligt, især i området tæt på såret. Fra produktion af kapsler til implantation, er det vigtigt, at kontaminering undgås.
3. Peroral indgivelse af 17β-estradiol gennem møtrik-is Nutella
- Grundigt opløses 17β-estradiol i sesamolie, og derefter blandes sesamolie med Nutella. Vi anbefaler, at hver daglige dosis indeholder 28 ug 17β-estradiol, 5 pi sesamolie og 1 g Nutella pr kilogram legemsvægt for rotter og 1,12 ug 17β-estradiol, 0,312 uL sesamolie og 60 mg Nutella for hver 30-g mus. Placebo møtrik-creme fremstilles på samme måde bortset fra, uden at 17β-estradiol.
- Træn dyrene at spise hormon-fri møtrik-creme i fem dage inden forsøget. De første tre dage af uddannelse, bør rotterne optimalt trænes i grupper (ca. 0,5 g Nutella til 2-5 dyr), i deres bure. På fjerde og femte dages træning, dyrene sættes i separate bure før modtagelsen af daglig portion til at ligne den eksperimentelle situation.
- Under eksperimentet blev dyrene sat i separate bure for hver fodring gang, hvorefter Nutella del serveres på små keramiske fliser. Hvis uddannelsen er udført som ovenfor, our erfaring er, at mere end 95% af rotter og mus acceptere møtrik-creme, og når det er fuldt vant, de fleste af dyrene forbruge det på få sekunder.
4. Repræsentative resultater
Fysiologisk serum 17β-estradiol-koncentrationer, som de nuværende metoder til formål at reproducere, er ca 5-140 pg / ml for rotter og 5-35 pg / ml for mus 4,6. De subkutane silastiske kapsler ifølge anvisningerne ovenfor, når den administreres til 300 g Sprague-Dawley rotter, frembringer langsomt faldende 17β-østradiol i serum-koncentrationer fra omkring 40 pg / mL dag 2 til 10 pg / mL dag 35. Imidlertid umiddelbart efter administration, kan en serumkoncentration top omkring 1000 pg / mL forventes, falder til det fysiologiske område inden for 8 timer (figur 1A) 4,5. De silastiske kapsler til mus som beskrevet ovenfor med 36 ug 17β-estradiol/mL, når den administreres til 25 g kvindelig C57BL / 6 mus, gør serum koncentrations at falde langsomt fra ca 90 pg / mL dag 2 til 25 pg / mL dag 35. Dette er sandsynligvis efter en lignende spids, som blev fundet hos rotter, selvom dette ikke er blevet undersøgt (figur 1B) 6.
Den perorale Nutella metode med doseringer, der er beskrevet ovenfor, når den administreres til 300 g Sprague-Dawley rotter, gør fysiologiske niveauer af 17β-estradiol med daglige udsving mellem 10-70 pg / ml (figur 2A) 4. For mus ved hjælp af ovenstående dosis varierer den daglige plan mellem cirka 20 og 120 pg / ml (figur 2B) 6.
iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
Figur 2 stiliserede grafer præsenterende 17β-estradiol-koncentrationer i rotter (A, n = 15). 4 og mus (B n = 10) 6 som følge af daglige hormonenheder administration Nutella. Den perorale Nutella Fremgangsmåden gør daglige toppe, men ikke langt så højt som produceres ved subkutan eller intravenøs metoder. Dette efterligner farmakokinetikken af humant hormonerstatningsterapi, og peroral behandling kan fortsætte, så længe det er nødvendigt, selv hvis det ovenstående eksempel kun udgør en indledende 96 timer. De skraverede områder svarer til fysiologiske 17β-østradiol serumkoncentrationer i intakte hunrotter og mus hhv. Selvom der ikke visuelt vist i graferne, der er inter-individuelle variationer i 17β-estradiol-koncentrationer, hvilket gør variationskoefficienter 40-132% i rotter og fra 13 til 219% i mus med Nutella metoden (meget lave middelkoncentrationer ofte generere højvariationskoefficienter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De administration tilstande beskrevet ovenfor har tidligere undersøgelser vist overlegen kommercielle langsom frigivelse pellets og injektioner i form af fremstilling fysiologiske serumkoncentrationer af 17β-estradiol. Mens den langsomme frigivelse pellets producerer meget høje og langvarige serumkoncentration toppe, injektionerne forårsager ekstreme, daglige hormonenheder udsving og kræver gentagen belastende behandling af dyrene 4-6. Vigtigheden af at vælge passende administration tilstande er fremhævet af nylige undersøgelser viser, at mens lavdosis 17β-østradiol administration regimener (såsom de teknikker, der præsenteres i den aktuelle artiklen) beskytter mod cerebral iskæmi 8-10 17β-estradiol-koncentrationer fremstilles ved kommercielle langsom frigivelse pellets kan faktisk forøge cerebral beskadigelse 1,2,11-14. Drikkevand administration og oral sonde er to andre, mindre hyppige, metoder, der er blevet testet. Administration af hormon via drikkevandet har sin største fordel i at være ekstremt non-invasiv, da næsten ingen håndtering af dyr på de krævede alt er. Imidlertid 17β-estradiol ikke er opløseligt i vand uden en emulgator, den individuelle vandindtagelse er vanskelig at styre, og hvis formål er at afspejle indtagelse af en pille, en anden ulempe er, at musene drikke vand under hele 24 timer . Oral gavage har sin største ulempe, idet det er belastende for dyret og kan forårsage esophageal skade, der kan påvirke spiseadfærd.
De her beskrevne metoder - silastik kapsler og peroral Nutella - er både egnet til kortvarig østrogen administration og i længere perioder på op til 5-6 uger. Hvis højere doser anvendes, end beskrevet ovenfor, uanset typen af indgivelse medium kan langvarig administration af østrogen forårsage alvorlige bivirkninger, såsom urinrøret okklusion grund mucosal proliferation 15.
"> Fremgangsmåderne præsenteres her let kan modificeres med hensyn til dosering, kapsel længde etc. For eksempel kan det være påkrævet at sænke både 17β-østradiol doser i både kapsler og Nutella i mus regimener til mere jævnt opnå fysiologiske serumkoncentrationer 6. Men hvis alle ændringer er foretaget, eller hvis de teknikker, der anvendes i andre stammer fra dyr, end der allerede er undersøgt, er det afgørende at validere de metoder, der påny ved at måle 17β-østradiol koncentrationer i serumprøver. Disse serumprøver skal indhentes på flere tidspunkter -point for at afspejle hele dosis-respons-relation / kurve, og ikke bare et kort glimt. livmodervægte er blevet brugt af nogle forfattere i stedet for serum 17β-østradiol koncentrationer som et mål for de biologiske effekter af 17β-estradiol. Men åbenbart livmodervægte afspejle de specifikke virkninger af østrogener på endometriet og afspejler ikke nødvendigvis virkningen af østrogener på andre systemer. Furthende, uterusvægt kun svagt korreleret til serum østrogenniveauer 4,6.Daglig indtagelse af store mængder af energi-rige Nutella kan forårsage vægtstigning. Men de små mængder, der er beskrevet ovenfor kun svare til mindre end 5% af dyrenes daglige energiindtag og voldsom vægtøgning er ikke blevet observeret i vore studier med Nutella.
Den afgørende forskel i arbejdet med rotter og mus fortjener særlig vægt. Selvom streng hygiejne er afgørende, uanset dyreart, mus følsomhed over for infektioner kræver kontrol på endnu højere niveau, end når du arbejder med rotter. For eksempel skal omhyggelig desinfektion af huden før indsnit hyppig ændring af medicinske handsker og anvendelse af sterile kirurgiske værktøjer ikke blive kompromitteret. Implantater er altid arnesteder for infektioner. Dyrene skal derfor undersøges regelmæssigt for tegn på infektion efter kapsel implantation. Hvis en byld dannes omkringimplantatet, anbefales det, at dyret er aflivet, eller at kapslen fjernes, såret renses grundigt, og en anden kapsel genindsat i en ny indsnit. Endvidere huden på musenes ryggen er meget mere skrøbelig end i rotter, berettiger to ugers rekonvalescens efter ovariektomi før kapsel administration.
Fremgangsmåderne beskrevet ovenfor kan også anvendes til andre stoffer end 17β-estradiol. Det er imidlertid vigtigt, at farmakokinetikken og doseringer af hver styret nøje kendetegnet fortrinsvis ved på hinanden følgende serumprøver målinger af det indgivne stof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev finansieret af Linköping Universitet og Amtsråd Östergötland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy. |
| Lubrithal eye gel | Leo Laboratories | Eye protection during surgery. | |
| Jodopax vet | Pharmaxim | Surgery disinfection. | |
| Vicryl 4-0 suture | Johnson & Johnson | Wound suture and ovary ligation. | |
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-1G | In sesame oil for silastic capsules and Nutella. |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol. |
| Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm | Dow Corning | 508-008 | Production of silastic capsules. |
| Wooden applicator stick | Selefatrade | 12-0783 | Capping of silastic capsules. |
| Nutella | Ferrero | Medium for peroral 17β-estradiol. |
References
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
- Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
- Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
- Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
- Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
- Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
- Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
- Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
- Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
- Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).
