Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ovariektomi och 17β-östradiol ersättning i råttor och möss: A Visual Demonstration

Published: June 7, 2012 doi: 10.3791/4013

Summary

Ovariektomi och efterföljande ersättning av 17β-östradiol genom silastiska kapslar och peroral Nutella demonstreras i råttor och möss.

Abstract

Östrogener är en familj av kvinnliga könshormoner med ett exceptionellt brett spektrum av effekter. När råttor och möss används i östrogen forskning de vanligtvis ovariektomi för att avlägsna den snabbt cykla hormonproduktionen, ersätter 17β-östradiol exogent. Det är dock brist på enighet om hur hormonet bör administreras för att få fysiologiska serumkoncentrationer. Detta är avgörande eftersom 17β-östradiol nivå / administreringsmetod djupt påverkar de experimentella resultaten 1-3. Vi har en rad studier kännetecknas de olika former av 17β-östradiol administration finner att subkutana silastiska kapslar och perorala nut-kräm Nutella är överlägsna kommersiellt tillgängliga långsam frisättning pellets (tillverkas av företaget Innovative Research of America) och dagliga injektioner i form av framställning fysiologiska serumkoncentrationer av 17β-östradiol 4-6. Bland Advantages av muttern-cream-metoden, som tidigare har använts för buprenorfin administration 7, är att när den används för östrogen administration det liknar peroral hormonersättningsterapi och är icke-invasiv. De subkutana silastiska Kapslarna är bekväma och ger de mest stabila serumkoncentrationer. Denna video artikeln innehåller steg-för-steg demonstrationer av ovariektomi och 17β-östradiol hormonersättning med silastiska kapslar och peroral Nutella hos råttor och möss, följt av en diskussion om viktiga aspekter av de administrativa förfarandena.

Protocol

1. Ovariektomi via Dorsal Route

  1. Bedöva djur, t ex med användning av 1,5% isofluran (4% för induktion) i en syre / lustgas 30% / 70% blandning. Placera djuret i framstupa läge på en värmeplatta ansluten till en rektal termometer. Det är viktigt att ha ett tunt skikt av isolering mellan djuret och plattan, och att termometern återkoppling systemet håller kroppen temperatur inom 37 ± 0,5 ° C. Ansök gel för ögonskydd och administrera 5 mg Rimadyl / kg kroppsvikt utspädd i saltlösning subkutant på den laterala aspekten av djurets hals för postoperativ smärtlindring.
  2. Shave en 4 * 4 cm (3 * 3 cm för möss) område cephally från höftbenskammen. Tvätta det rakade området med till exempel Jodopax innan du täcker djuret med en 4 * 4 cm bländare operation ark.
  3. Gör en 2-3 cm mittlinje snitt och rakt på sak dissekera huden från den underliggande fascia. En cm lateralt om mittlinjen, gör ett annat snitt through fascian. Rakt på sak dissekera sidled under denna fascia så ytligt som möjligt tills når bukhålan.
  4. Med pincett, ta tag i fettvävnad som omger äggstocken i bukhålan och försiktigt dra ut den. Identifiera äggstocken och ligera livmoderhornen och fartyg 0,5-1 cm proximalt om denna struktur. Skär äggstocken och ligerade fettvävnad och sätta den kvarvarande vävnaden tillbaka in i bukhålan. Göra en annan snitt i den kontralaterala fascia och upprepa proceduren.
  5. Stäng såren, helst med hjälp av en monofilamentsutur och låt djuret vaknar ur narkos. Placera djuret i en uppvärmd bur (25-27 ° C) under åtminstone 2 timmar efter kirurgi. Djuren ska hållas separat de första dagarna efter operationen. Det är avgörande att buren ofta rengörs / byts ut under återhämtningsfasen. Tjugofyra timmar efter operationen, injicera djuren subkutant med ytterligare 5 mg Rimadyl / kg kroppsvikt utspädd isaltlösning.

2. Subkutan administration av 17β-östradiol genom Silastiska Kapslar

  1. Noggrant blanda den önskade mängden av 17β-östradiol i sesamolja. För fysiologiska koncentrationer i råttor och möss, rekommenderar vi 180 ng / ml och 18-36 ng / ml. Placebo kapslar fylls med ren sesamolja.
  2. Klipp 3 cm (2 cm för möss) längder av sUikonplaströr och 5 mm (3 mm för möss) längder av trä applikator pinnar för pluggning. Använd pincett, pressa en träplugg i silastic kapseln innan du injicerar 17β-estradiol/sesame oljelösningen att fylla hela sin längd. Försiktigt cap Silastic kapseln i den öppna änden med en annan träplugg (propparna är tänkta att stanna permanent i kapseln). Inkubera kapslarna i den återstående 17β-östradiol lösningen över natten före implantering.
  3. Implantation av kapseln kan utföras under anestesi användes vid ovariektomi hos råttor. För mice emellertid en 14-dagars återhämtningsperiod efter ovariektomi rekommenderas för att minimera risken av kapseln som skjuter ut genom den känsliga huden.
  4. Efter kirurgiska förberedelser som i 1,1 eller efter att du stängt ovariektomi snittet, raka och tvätta en 2 * 2 cm stort område på den dorsala aspekten av djurets hals. Gör en 1 cm snitt och rakt på sak dissekera en subkutan ficka caudolaterally, med gott om plats för kapseln. Torka silastic kapsel (som fram till denna tid-punkt har inkuberats i 17β-östradiol lösning) och försiktigt installera det genom snittet, vilken därefter tillslutes genom en sutur. Det är avgörande för att säkerställa att kapseln stammar huden så lite som möjligt, särskilt i området nära såret. Från produktion av kapslar till implantationen, är det viktigt att förorening undvikes.

3. Peroral administrering av 17β-östradiol via Mutter-kräm Nutella

  1. Noggrant upplösa 17β-östradiol i sesamolja, och sedan blanda den sesamolja med Nutella. Vi rekommenderar att varje daglig portion innehåller 28 | ig 17β-östradiol, 5 | il sesamolja och 1 g Nutella per kilogram kroppsvikt för råttor och 1,12 | ig 17β-östradiol, 0,312 jil sesamolja och 60 mg Nutella för varje 30-g mus. Placebo mutter-kräm framställes identiskt med undantag av utan 17β-östradiol.
  2. Träna djuren att äta utan hormoner nut-kräm för fem dagar före försöket. De första tre dagars utbildning bör råttorna optimalt tränas i grupper (ca 0,5 g Nutella till 2-5 djur), i sina hem burar. På fjärde och femte dagars utbildning, djuren placeras i separata burar innan de får den dagliga delen att likna den experimentella situationen.
  3. Under experimentet, djuren placeras i separata burar för varje utfodring tillfälle, varefter Nutella delen serveras på små keramiska plattor. Om utbildningen har utförts enligt ovan, oUR erfarenhet är att mer än 95% av råttor och möss acceptera mutter-grädde, och en gång fullt vana, de flesta av de djur äter den inom några sekunder.

4. Representativa resultat

Fysiologiska serum 17β-estradiol koncentrationer, som de nuvarande metoderna syftar till att reproducera, är ca 5-140 pg / ml för råttor och 5-35 pg / ml för möss 4,6. De subkutana silastiska kapslar enligt instruktionerna ovan, när det ges till 300 g Sprague-Dawley, producerar långsamt minskande 17β-östradiol serumkoncentrationer från ca 40 pg / ml dag 2 till 10 pg / ml dag 35. Emellertid omedelbart efter administrering, kan en serumkoncentration topp runt 1000 pg / ml kan förväntas, att falla till det fysiologiska området inom 8 timmar (figur 1 A) 4,5. De silastiska kapslar för möss som beskrivits ovan med 36 | ig 17β-estradiol/mL, när den administreras till 25 g C57BL / 6 möss, göra serum koncentrations att långsamt minska från ca 90 pg / ml dag 2 till 25 pg / ml dag 35. Detta är troligen föregås av en liknande topp som återfanns i de råttor, även om detta inte har undersökts (figur 1B) 6.

Den perorala Nutella metod med de doseringar som beskrivs ovan, när den administreras till 300 g Sprague-Dawley-råttor, återger fysiologiska nivåer av 17β-östradiol med dagliga fluktuationer mellan 10-70 pg / ml (figur 2A) 4. För möss genom att använda ovanstående dosering, den dagliga nivåer varierar mellan cirka 20 och 120 pg / ml (figur 2B) 6.

Figur 1
. Rong> Figur 1 Stylized diagram som presenterar 17β-östradiol koncentrationer hos råttor (A, n = 10 i tidpunkter upp till 24 h, n = 15 i senare tidpunkter) 4,5 och möss (B, n = 10) 6 efter kapsel implantation. De silastiska Kapslarna producerar en kort initial topp serum koncentrationer upp till 1000 pg / ml, men avtar inom några timmar till nivåer under 100 pg / ml. För de kommande 4-5 veckorna, kapslarna ger stabil, även stadigt minskar serumkoncentrationerna. De skuggade områdena motsvarar fysiologiska 17β-östradiol serum i intakta honråttor och möss respektive. Även om inte visuellt visas i diagrammen finns interindividuell variabilitet i 17β-estradiol koncentrationer gör variationskoefficienterna 27 till 183% hos råtta och från 28 till 115% hos möss med Silastic kapseln metoden (mycket låg genomsnittlig koncentrationer genererar ofta höga variationskoefficienter).

iles/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg "/>
Figur 2 Stylized grafer som uppvisar 17β-östradiolkoncentrationer i råttor (A, n = 15). 4 och möss (B, n = 10) 6 som en följd av daglig administrering hormon i Nutella. Den peroral Nutella Metoden gör dagliga toppar, dock inte i särklass så hög som produceras med subkutan eller intravenös metoder. Detta härmar farmakokinetiken mänskliga hormonersättningsbehandling, och peroral behandling kan fortgå så länge det behövs, även om exemplet ovan endast lägga fram en första 96 timmar. De skuggade områdena motsvarar fysiologiska 17β-östradiol serum i intakta honråttor och möss respektive. Även om inte visuellt visas i diagrammen finns interindividuell variabilitet i 17β-estradiol koncentrationer gör variationskoefficienterna 40 till 132% i råttor och 13 till 219% hos möss med Nutella-metoden (mycket låga genomsnittliga koncentrationer Ofta generera högvariationskoefficienterna).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De administrationssätt som presenteras ovan har i tidigare studier visat överlägsen kommersiella långsam frisättning pellets och injektioner i form av produktion av fysiologiska serumkoncentrationer av 17β-östradiol. Medan den långsamma frisättning pellets ger mycket höga och långvariga serumkoncentrationer toppar, injektionerna orsakar extrema, dagliga hormon svängningar och kräver upprepad stressande djurhanteringen 4-6. Vikten av att välja lämpliga administrativa lägen markeras av den senaste tidens studier som visar att medan låg dos 17β-estradiol administration regimer (som de tekniker som presenteras i den aktuella artikeln) skyddar mot cerebral ischemi 8-10, de 17β-östradiol koncentrationer som produceras av kommersiella långsam frisättning pelletar kan faktiskt öka cerebral skada 1,2,11-14. Dricksvatten administration och oral sondmatning är två andra, mindre ofta, metoder som har testats. Administrera hormonet via dricksvattnet har sin största fördel i att vara extremt icke-invasiv, eftersom nästan ingen djurhantering överhuvudtaget behövs är. Emellertid är 17β-östradiol inte lösliga i vatten utan en emulgator, är den individuella vattenintag svår att styra, och om målet är att återspegla förbrukningen av ett piller, en annan nackdel att mössen dricka vattnet under hela 24 timmar . Oral sondmatning har sin största nackdelen att det är stressande för djuret och kan orsaka matstrupen skada, som kan påverka ätbeteende.

De metoder som beskrivs här - silastiska kapslar och peroral Nutella - är både lämpar sig för kortsiktiga östrogen administration och under längre perioder på upp till 5-6 veckor. Om högre doser används än vad som beskrivs ovan, oavsett typ av administration medium, kan långvarig östrogen administration orsaka allvarliga biverkningar såsom urinrörets ocklusion på grund av slemhinnan spridning 15.

"> De metoder som presenteras här enkelt kan modifieras om dosering, etc. kapseln längd för Exempelvis kan det vara motiverat att sänka både 17β-östradiol doser i både kapslar och nutella i musen regimer till mer stadigt uppnå fysiologiska serumkoncentrationer 6. Men om några ändringar görs, eller om de tekniker som används i andra stammar av djur än som redan undersökts, är det viktigt att validera de metoder nytt genom att mäta 17β-östradiol koncentrationer i serumprover. Dessa serumprover skall erhållas vid flera gånger -poäng för att återspegla hela dos-respons förhållande / kurvan, och inte bara en kort glimt. livmodervikter har använts av vissa författare i stället för serum 17β-östradiol koncentrationer som ett mått på de biologiska effekterna av 17β-estradiol. Men uppenbarligen livmodervikter återspeglar de särskilda effekter östrogener på endometriet och avspeglar inte nödvändigtvis effekten av östrogener på andra system. Furthenne, livmodervikt endast svagt korrelerad till serum östrogennivåer 4,6.

Daglig konsumtion av stora mängder energi-rika Nutella kan orsaka viktökning. Men beskrivna små mängder ovan endast motsvarar mindre än 5% av djuren dagliga energiintaget och kraftig viktökning har inte observerats i våra studier med Nutella.

Den avgörande skillnaden att arbeta med råttor och möss meriter speciella betoning. Även om strikt hygien är avgörande oberoende av djurarter, kallar möss känslighet för infektioner under kontroll på ännu högre nivå än när man arbetar med råttor. Till exempel måste noggrant desinfektion av huden före snittet, frekvent byte av medicinska handskar och användning av sterila kirurgiska instrument inte äventyras. Implantaten är alltid härdar för infektioner. Djuren måste därför granskas regelbundet för tecken på infektion efter kapseln implantation. Om en abscess bildas runtimplantatet, rekommenderar vi att djuret är avlivas eller att kapseln tas bort, såret noggrant rengöras, och en annan kapsel återinföras genom en ny snitt. Vidare är huden på möss ryggar mycket mer bräckliga än i råttor, motiverar två veckor konvalescens efter ovariektomi före kapsel administration.

De metoder som presenteras ovan kan också användas för andra ämnen än 17β-östradiol. Det är emellertid viktigt att farmakokinetiken och doser av varje regim noggrant kännetecknas företrädesvis av konsekutiva serum mätningar av den administrerade substansen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Studien har finansierats av Linköpings universitet och Landstinget i Östergötland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy.
Lubrithal eye gel Leo Laboratories Eye protection during surgery.
Jodopax vet Pharmaxim Surgery disinfection.
Vicryl 4-0 suture Johnson & Johnson Wound suture and ovary ligation.
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-1G In sesame oil for silastic capsules and Nutella.
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol.
Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm Dow Corning 508-008 Production of silastic capsules.
Wooden applicator stick Selefatrade 12-0783 Capping of silastic capsules.
Nutella Ferrero Medium for peroral 17β-estradiol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
  2. Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
  4. Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
  5. Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
  6. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
  7. Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
  8. Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
  9. Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
  10. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
  11. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
  12. Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
  13. Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
  14. Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
  15. Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).

Tags

Medicin utgåva 64 fysiologi Ooforektomi råtta mus 17β-östradiol administration Silastiska kapslar Nutella
Ovariektomi och 17β-östradiol ersättning i råttor och möss: A Visual Demonstration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ström, J. O., Theodorsson, A.,More

Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013, doi:10.3791/4013 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter