Summary
وصفنا استراتيجية لرصد نضوج والهجرة من الخلايا الجذعية رئوي ردا على ovalbumin في تحديد ovalbumin يسببها التهاب الشعب الهوائية التحسسي. ويمكن تعديل هذه الاستراتيجية لتقييم الهجرة من الخلايا الجذعية الرئوي في ضبط العدوى.
Abstract
الخلايا الجذعية (DCS) هم اللاعبون الرئيسيين المشاركين في الشروع في رد الفعل المناعي على التكيف من خلال تفعيل الخلايا التائية مستضد معين. البلدان النامية موجودة في الأنسجة الطرفية في حالة مستقرة، ولكن استجابة لتحفيز المستضد، DCS تناول مستضد وبسرعة تهاجر إلى الغدد الليمفاوية استنزاف حيث تبدأ T استجابة الخلية ضد 1،2 مستضد. بالإضافة إلى ذلك، البلدان النامية أيضا أن تلعب دورا رئيسيا في بدء الاستجابة المناعية الذاتية، فضلا عن الحساسية 3.
البلدان النامية تلعب دورا أساسيا في كل من الشروع في استجابة جهاز المناعة، والحث على التسامح في تحديد بيئة الرئة 4. بيئة الرئة هو مولد للتحمل إلى حد كبير، وذلك بسبب التعرض لمجموعة واسعة من المستضدات البيئية 5. ومع ذلك، في بعض الأفراد هناك انقطاع في التسامح، الأمر الذي يؤدي إلى تحريض الحساسية والربو. في هذه الدراسة، ونحن تصف استراتيجية، والتي يمكن استخدامها لمراقبة مجرى الهواء العاصمة نضوج وميغالتموينية في استجابة للمستضد المستخدمة لتوعية. قياس نضوج العاصمة مجرى الهواء والهجرة يسمح لتقييم حركية من خلال استجابة مناعية التهاب الشعب الهوائية التحسسي، ويساعد أيضا في فهم حجم للاستجابة المناعية لاحق جنبا الى جنب مع الآليات الكامنة.
ترتكز استراتيجيتنا على استخدام ovalbumin كعامل توعية. Ovalbumin الناجم عن الحساسية والربو هو نموذج يستخدم على نطاق واسع إلى إنتاج فرط الحمضات الهوائية، والتهاب رئوي وارتفاع مستويات الجلوبيولين وجدت خلال 6،7 الربو. بعد التوعية، هي الطعن الفئران عن طريق التسليم من داخل الأنف ovalbumin FITC المسمى، والذي يسمح لوضع العلامات المحددة للبلدان النامية الهوائية التي ovalbumin امتصاص. المقبل، وذلك باستخدام العديد من علامات العاصمة محددة، ويمكننا أن نقيم نضوج من هذه البلدان النامية، ويمكن أيضا تقييم هجرتهم إلى الغدد الليمفاوية استنزاف من خلال توظيف التدفق الخلوي.
Protocol
1. التوعية من الفئران مع Ovalbumin
- يعد حل OVA (V الدرجة؛ سيغما، MO) في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1 ملغ / مل (يمكن تخزينها في حل درجة مئوية -80).
- من أجل إعداد OVA-الشب خليط، وتأخذ الشبة في أنبوب ويضاف حل OVA بأسلوب قطرة قطرة في حين vortexing الأنبوب في نسبة 1:1. يقلب الخليط لمدة 30 دقيقة واستخدام فورا بعد الخلط.
- باستخدام حقنة 1 مل، حقن 0.2 مل من الخليط في تجويف الفأرة البريتوني وتكرار الحقن مرة أخرى بعد 2 أسابيع.
2. الأنف التحدي من الفئران مع FITC Ovalbumin إعتبر
- 7 أيام بعد الحقن الثاني من الشب، OVA، الفئران جاهزة للتحدى الأنف مع FITC-OVA.
- يعد حل FITC-OVA (سيغما) باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1 ملغ / مل، ومخزن في aliquots في -80 درجة مئوية.
- وضع شاش معقم في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل والصقر في ح الكيميائيةالعود، إضافة 5 مل من Aerrane على والشاش. من أجل تخدير الفئران، وإدارة الحيوان في أنبوب لل5-10 ثواني تقريبا.
- عقد تخدير الحيوان في وضع مستقيم، واستخدام نصائح ماصة معقمة، ماصة 100 ميكرولتر من حل OVA-FITC على فتحتي الأنف لمن الفئران بطريقة الإفلات من الحكمة.
- كرر التحدي داخل الأنف مع FITC-OVA لاليومين المقبلين.
3. إعداد وحيدة الخلية تعليق من الرئتين والعقد اللمفاوية تصريف
- تضحية الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من Euthanyl.
- من أجل الحد من تلوث بلعم، والتي يمكن أن تعقد العاصمة التحليل، ويتم إجراء غسيل الرئة. لغسل الرئتين، ويتعرض لفترة وجيزة القصبات الماوس ومقنى مع القسطرة والمحاقن 1، واستخدام الثلج الباردة في برنامج تلفزيوني مع EDTA 5 ملم، وتشطف السبيل التنفسي السفلي 3 مرات لإزالة الخلايا من المسافات السنخية.
- يروي الرئتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 10 وحدة / مل كبدفي طريق البطين الأيمن من القلب، لإزالة خلايا الدم من الأوعية الدموية في الرئة. أداء perfusions حتى الرئتين تحويل أبيض، مما يدل على إزالة معظم خلايا الدم. هذا مهم بشكل خاص لإزالة الخلايا الملوثة من الدم المحيطي.
- تشريح الرئتين خارج وإزالة العقد اللمفية المنصف (MLN) ووضع العقد اللمفاوية في طبق منفصل. (في محاولة للتقليل من التعرض للأنسجة للضوء لمنع تبريد من مضان FITC.)
- وضع الرئتين على طبق بيتري واللحم المفروم باستخدام مقص. هضم المقبل الرئتين لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 250 يو / مل كولاجيناز D (روش) وإضافة EDTA (10 ملي تركيز نهائي) لمدة 5 دقائق المقبل لوقف نشاط كولاجيناز.
- تمرير أجزاء من الرئتين هضمها من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 100 وتحلل أداء منخفض التوتر لإزالة كريات الدم الحمراء. تعليق خلية واحدة على استعداد لمزيد من التحليل من البلدان النامية.
- من اجل اعداد وحيد الخلية تعليق من مليون، تيتخفيف MLN باستخدام إبر رفيعة وهضم مع كولاجيناز على النحو الموصوف أعلاه تليها توتر من خلال مصفاة الخلية.
4. تلطيخ عن العاصمة علامات لتقييم النضوج / هجرة
- من أجل تحديد البلدان النامية في الرئتين، ويتم تنفيذ تلطيخ لCD11c وCD11b. وعلاوة على ذلك لتقييم للنضوج، يتم تنفيذ تلطيخ عن CD86 و CD80، والتي يتم upregulated كما تخضع البلدان النامية النضج. ويتم تحديد CD11c + + CD11b خلايا + OVA-FITC في البلدان النامية كما MLN رئوي المهاجرة من الرئتين إلى MLN ردا على التحدي الهوائية OVA.
- تعليق الخلايا بتركيز 10 خلايا × 6 10 / مل في عازلة FACS (PBS مع FBS 1٪ و EDTA 1MM) وقسامة 150 ميكرولتر من تعليق خلية / أنبوب لتلطيخ نظام مراقبة الأصول الميدانية. للتعرف على البلدان النامية الرئة، وهناك حاجة إلى بقع التالية: سيطرة غير ملوثين (خلايا الرئة من الفئران لم تتعرض لFITC-OVA)، OVA-FITC تحكم السيطرة CD11c، واحدة تحكم CD11b، وحيد، CD11b+ + CD11c سيطرة مزدوجة، CD11b + OVA-FITC + مراقبة مزدوجة، CD11c + OVA-FITC + ضعف الرقابة، MHC الثاني تحكم واحد، CD86 تحكم واحد، CD80 تحكم واحد وعينات لطخت OVA-FITC + + CD11c MHCII + + CD11b ، OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD86 + و + OVA-FITC CD11c + CD11b + + CD80.
- لتقييم العاصمة والهجرة، وتنفيذ عدد الخلايا المطلقة للتعليق خلية واحدة من MLN والاستعداد لاحقا أنابيب التالية: سيطرة غير ملوثين (خلايا MLN من الفئران لم تتعرض لFITC-OVA)، والسيطرة OVA-FITC، CD11c + تحكم واحد، CD11b + ضعف الرقابة والسيطرة CD11b + OVA-FITC + مزدوجة، ومراقبة CD11c + OVA-FITC + مزدوجة وCD11c + + CD11b عينات + OVA-FITC.
5. ممثل النتائج
النقاط الوقت اللازم لتوعية داخل الصفاق للحث على التهاب الشعب الهوائية التحسسي مهم وينبغي الاضطلاع بها كما هو مبين في الشكل رقم 1. بعد توعية داخل الصفاق والهوائية التحدي OVA، لتأكيد تحريض التهاب الشعب الهوائية التحسسي، يمكن التضحية بعض الفئران ويمكن أن يتم تحليل النسيجي بها على أقسام الرئة كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن التأكد من وجود خلايا التهابية من قبل هيماتوكسيلين وصمة عار يوزين (الشكل 2A)، ويمكن تقييم وجود إنتاج المخاط من قبل الدورية على حمض شيف صمة عار (الشكل 2B). تماما وهذا يؤكد تحريض التهاب الشعب الهوائية التحسسي بعد التحدي OVA OVA-توعية من الفئران 8. في المقابل، من المتوقع أن أقسام الرئة من المؤسسة العامة لتحلية الفئران التي عولجت ليكون خاليا من أي التهاب جنبا إلى جنب مع عدم وجود أي إنتاج المخاط. وعلاوة على ذلك، فإن التحدي التالي OVA، الرئوي البلدان النامية unde rgo نضوج والهجرة اللاحقة إلى العقد اللمفية النازفة. ومن المتوقع أن تحليل الخلايا + CD11c في الغدد الليمفاوية المنصف (MLN) من الفئران توعية وتحدى مع OVA لاظهار نسبة أعلى من خلايا + CD11c بالمقارنة مع الفئران التي عولجت المالحة (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، وتحليل عدد خلايا المطلقة للCD11c + + CD11b OVA-FITC + الخلايا في MLN من الفئران OVA-توعية وتحدى، ومن المتوقع أن تظهر أعلى بشكل ملحوظ (أي عدة أضعاف أعلى) عدد نظرائهم من أن الفئران التي عولجت المالحة ( الشكل 3B).
الشكل 1. بروتوكول تجريبي لتحريض ovalbumin (OVA) التي يسببها التهاب الشعب الهوائية التحسسي في الفئران جنبا إلى جنب مع التحدي الهوائية مع ovalbumin FITC المسمى (OVA-FITC).
fig2.jpg "/>
الشكل 2. توعية OVA تليها التحدي الهوائية OVA يؤدي إلى تحريض من التهاب الشعب الهوائية التحسسي كما حددها تلوين الهيماتوكسيلين ويوزين من أقسام الرئة هو مبين في (أ) ويؤدي أيضا إلى إنتاج المخاط في الشعب الهوائية كما حددها الدوري حمض تلطيخ شيف من الرئة أقسام كما هو مبين في (B).
الشكل 3. OVA-FITC التحدي يدفع العاصمة هجرة من الرئتين إلى العقد الليمفاوية المنصف (MLN). (أ) قطع التدفق الخلوي تصور أبعاد الخلايا + CD11c في MLN السيطرة أو الفئران OVA-توعيتهم. (ب) من التهم المطلقة + + CD11c CD11b خلايا + OVA-FITC في MLN من الفئران المالحة أو OVA توعيتهم. * P <0.05. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يقدم نهجا يستند إلى التدفق الخلوي لتحليل البلدان النامية الرئوي، على أساس تسليم FITC-OVA لتحدي الشعب الهوائية. وهذا يسمح لرصد انتقائي من البلدان النامية الرئوي، الذي يستغرق OVA-FITC، وبالتالي فإن سكان العاصمة، والتي يتم مراقبتها بشكل فعال تلك التي تشارك في الاستجابة المناعية مجرى الهواء أثناء OVA التي يسببها التهاب الشعب الهوائية التحسسي. في السيطرة على الفئران، في حال عدم وجود التهاب الشعب الهوائية التحسسي، وعدد من البلدان النامية المهاجرة (OVA-FITC + DCS) التي تم تحديدها في MLN تدل على معدلات القاعدية للهجرة العاصمة، والذي يسرع في الاستجابة لالتهاب الشعب الهوائية حساسية مما أدى إلى زيادة كبيرة في مطلق عدد من البلدان النامية + OVA-FITC في MLN. استراتيجية وصفها، يوفر ميزة على النهج المناعى / المناعية التقليدية القائمة لأنه لا يمكن إجراء التحليل في أقصر فترة زمنية وكفاءة / حساسية أعلى من ذلك بكثير. ولذلك فمن هالمهم qually لضمان أن يتم توظيف الضوابط الصحيحة كما هو موضح في طرق خلال تحليل التدفق الخلوي. معلمة أخرى يمكن أن تؤثر على النتائج هو إعداد تعليق خلية واحدة من الرئة. وبالتالي يجب توخي الحذر لمنع التعرض كبيرا من الأنسجة للضوء لأنها قد تؤثر على مضان من FITC-OVA والرعاية ويجب أيضا أن تؤخذ أثناء الهضم الأنزيمي من الرئة لعملية الهضم أكثر من يمكن أن يؤدي إلى انشقاق علامات على سطح الخلايا، والتي وسوف تؤثر على تحليل اتجاه مجرى النهر. البلاعم السنخية والبلدان النامية تشارك مجموعات مماثلة من علامات السطحية، والذي يزيد من تعقيد تحليل للسكان العاصمة الرئوي 9. ولذلك لا بد من غسل الرئتين لإزالة الضامة السنخية التي يمكن أن تتداخل مع تحليل العاصمة.
بالإضافة إلى تحليل للهجرة العاصمة رئوي أثناء التهاب الشعب الهوائية التحسسي، ويمكن للمنهجية المبينة تعديل محتمل لتقييم الاستجابة المناعية الأخرى 1tigens، حيث يمكن أن توصف مستضدات محددة مع صبغة الفلورسنت وتسليمها الأنف. ويمكن إجراء تحليل مماثل في وقت لاحق كما هو موضح أعلاه لتقييم رئوي العاصمة استجابة. في الحالات التي لا يمكن أن توصف مستضد، يمكن تسليمها ساعات قليلة قبل تسليم مستضد، FITC ديكستران أو CFSE على الفئران. في وقت لاحق، بعد تسليم مستضد، ويمكن إجراء تحليل خارج لمراقبة الهجرة من FITC-ديكستران أو CFSE المسمى البلدان النامية إلى مليون، والتي سوف تشير إلى حركية الهجرة العاصمة رئوي بعد تلقيح مع مستضد معين 10،11. في عملنا السابق، لقد استخدمنا هذه الاستراتيجية لتقييم النضج / الهجرة من البلدان النامية رئوي ردا على تسليم الفيروسة الغدانية ناقلات العلاج الجيني 10. منذ البلدان النامية هي أكلة، والتسليم داخل الأنف من FITC-ديكستران النتائج في امتصاص السريع من قبل البلدان النامية الرئوي، ومن ثم يمكن رصدها من قبل التدفق الخلوي. في الحالتين، حيث هو المطلوب رصد البلدان النامية بلازماوية الشكل الرئوي، وينبغي أن يكون CFSE emploYED منذ البلدان النامية بلازماوية لا امتصاص FITC-ديكستران من الكفاءة وغيرها من مجموعات فرعية العاصمة الرئوي 10.
تماما، ووصف هذه الاستراتيجية توفر مزايا أكثر من الأساليب التقليدية الأخرى، لأنها توفر التحليل الكمي من نضوج العاصمة الرئوي / هجرة أثناء التهاب الشعب الهوائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المنح وكندا CIHR CF إلى الدكتور جيم هو جين تاو وكذلك من خلال منحة دراسية لدرجة الدكتوراة التي منحت لKushwah راهول من كندا CF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Alum | Thermo Scientific | 77161 | |
| OVA-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Antibodies | e-Bioscience |
References
- Kushwah, R., Hu, J. Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells. Cell Biosci. 20, (2011).
- Kushwah, R., Hu, J. Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system. Immunology. 133, 409-419 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma. Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma. Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).
- Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. Tolerizing allergic responses in the lung. Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).
- Herz, U. The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma. Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).
- Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses. Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).
- Nakae, S. TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).
- Guth, A. M. Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).
- Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery. J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).
- Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells. J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).
