Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

Summary

We beschrijven een strategie om de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen te volgen in reactie op ovalbumine in de setting van ovalbumine geïnduceerde allergische luchtwegontsteking. Deze strategie kan worden aangepast aan de migratie van pulmonale dendritische cellen te beoordelen in de instellingen van de infectie.

Abstract

Dendritische cellen (DC's) zijn de hoofdrolspelers die betrokken zijn bij aanvang van de adaptieve immuunrespons door het activeren van antigeen-specifieke T-cellen. DC's zijn aanwezig in de perifere weefsels in steady-state, maar in reactie op antigeen stimulatie, DC's nemen het antigeen en snel migreren naar de drainerende lymfeklieren, waar ze T-cel respons te leiden tegen het antigeen ^1,2. Daarnaast DC's spelen ook een belangrijke rol in het initiëren van auto-immune en allergische immuunrespons ^3.

DC's spelen een essentiële rol in zowel de aanvang van de immuunrespons en inductie van tolerantie in de setting van long-omgeving ^4. Lung omgeving grotendeels tolerogeen wegens de blootstelling aan enorme hoeveelheid milieu antigenen ^5. In sommige individuen is een breuk in tolerantie, die leidt tot de inductie van allergie en astma. In deze studie beschrijven we een strategie die kan worden luchtwegen DC rijping en mig controlerenverhouding in reactie op het antigeen voor sensibilisering. De meting van de luchtwegen DC rijping en migratie maakt voor beoordeling van de kinetica van immuunrespons in de luchtwegen allergische ontsteking en helpt het begrijpen van de grootte van de volgende immuunrespons met de mechanismen.

De strategie is gebaseerd op het gebruik van ovalbumine als sensibilisator. Ovalbumine geïnduceerde allergische astma is een veel gebruikt model om de luchtwegen eosinofilie, longontsteking en verhoogde IgE-gehaltes gevonden tijdens astma ^6,7 reproduceren. Na sensibilisatie, worden muizen uitgedaagd door intranasale levering van FITC gelabeld ovalbumine, die het mogelijk maakt voor specifieke etikettering van luchtweg DCs die opname ovalbumine. Vervolgens met behulp van verschillende DC specifieke markers, kunnen we beoordelen de rijping van deze DC's en kunnen hun migratie ook te beoordelen naar de drainerende lymfeklieren door het gebruik van flowcytometrie.

Protocol

1. Sensibilisatie van muizen met ovalbumine

1. Een oplossing van OVA (graad V, Sigma, MO) in steriele PBS in een concentratie van 1 mg / ml (oplossing kan worden bewaard bij -80 ° C).
2. Om OVA-aluin-mengsel te bereiden te aluin in een buis en voeg OVA oplossing druppelsgewijze terwijl vortexen de buis in een verhouding van 1:1. Roeren gedurende 30 minuten gebruikt direct na het mengen.
3. Met behulp van een 1 ml spuit, injecteer 0,2 ml van het mengsel in de muis peritoneale holte en herhaal de injectie na twee weken.

2. Intranasale Challenge van muizen met FITC gelabeld ovalbumine

1. 7 dagen na de tweede injectie van OVA-Alum, muizen zijn klaar om intranasaal worden uitgedaagd met OVA-FITC.
2. Een oplossing van OVA-FITC (Sigma) met steriele PBS in een concentratie van 1 mg / ml en opslaan in aliquots bij -80 ° C.
3. Plaats een steriel gaas op de bodem van een 50 ml Falcon buis en in een chemische hood, voeg 5 ml Aerrane op het gaas. Met het oog op muizen verdoven, richt het dier in de buis voor ongeveer 5-10 seconden.
4. Houd verdoofde dier in een verticale positie en met steriele pipetpunten, pipet 100 ul van de OVA-FITC oplossing op de neusgaten van muizen in een druppelsgewijs mode.
5. Herhaal intranasale uitdaging met OVA-FITC voor de komende twee dagen.

3. Voorbereiding van de Single-celsuspensie uit de longen en de drainerende lymfeklieren

1. Offer de muizen met behulp van intraperitoneale injectie van Euthanyl.
2. Om verontreiniging macrofagen die DC analyse bemoeilijkt verminderen, wordt long lavage uitgevoerd. Om de longen spoelen, worden muizen luchtpijpen kort blootgesteld en gecannuleerd met een katheter en een injectiespuit, met ijskoud PBS met 5 mM EDTA, de onderste luchtwegen gespoeld 3 keer cellen uit de alveolaire ruimten.
3. Perfuseren de longen met 10 ml PBS, met 10 U / ml Heparvia de rechter ventrikel van het hart, het bloed cellen van de longen vaatstelsel te verwijderen. Voer de perfusies tot in de longen worden wit, indicatief voor het verwijderen van het grootste deel van de bloedcellen. Dit is vooral van belang te verwijderen verontreiniging cellen uit het perifere bloed.
4. Ontleden de longen uit en verwijder de mediastinale lymfklieren (MLN) en plaats de lymfeklieren in een apart schaaltje. (Probeer om de blootstelling van weefsels aan het licht te doven van FITC fluorescentie te voorkomen dat een minimum te beperken.)
5. Plaats de longen op een petrischaal en gehakt met een schaar. Vervolgens verteren de longen gedurende 25 minuten bij 37 ° C met 250 U / ml Collagenase D (Roche) en voeg EDTA (eindconcentratie van 10 mM) de volgende 5 minuten collagenase activiteit te stoppen.
6. Voer de fragmenten van verteerd longen door een 100 um cel zeef en uit te voeren hypotone lysis aan erythrocyten te verwijderen. De enkele cel suspensie is klaar voor verdere analyse van de DC's.
7. Om enkele celsuspensie te bereiden uit de MLN, tgemak van de MLN met fijne naalden en samenvatting maken met collagenase zoals hierboven beschreven, gevolgd door persen door middel van een cel zeef.

4. Kleuring voor DC-markers om Beoordeel Rijping / migratie

1. Om DC in de longen te identificeren, wordt kleuring uitgevoerd voor CD11c en CD11b. Verder te beoordelen om te rijpen, wordt kleuring uitgevoerd voor CD86 en CD80, die opgereguleerd als DCS ondergaan rijping. CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ cellen in de MLN worden geïdentificeerd als pulmonale DC migratie van de longen naar de MLN in reactie op OVA luchtwegen uitdaging.
2. Suspendeer cellen bij een concentratie van 10 x 10 ⁶ cellen / ml in FACS-buffer (PBS met 1% FBS en 1 mM EDTA) en aliquot 150 pi celsuspensie / buis FACS kleuring. Voor de identificatie van long-DC's, na vlekken zijn nodig: ongekleurde controle (Lung cellen van muizen niet blootgesteld aan OVA-FITC), OVA-FITC-controle, CD11c enkele controle, CD11b enkele controle, CD11b⁺ CD11c ⁺ dubbele controle, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbele controle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbele controle, MHC II enkele controle, CD86 enkele controle, CD80 enkele controle en monsters gekleurd voor OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ MHCII ⁺ , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ en OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. Om DC migratie te beoordelen, moet u absoluut de cellen van de enkele cel schorsing van MLN en vervolgens de voorbereiding van de volgende buizen: ongekleurde controle (MLN-cellen van muizen niet blootgesteld aan OVA-FITC), OVA-FITC-controle, CD11c ⁺ enkele controle, CD11b ⁺ dubbele controle, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbele controle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbele controle en CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ monsters.

5. Representatieve resultaten

De tijdstippen nodig intraperitoneale sensibilisatie luchtwegen allergische ontsteking veroorzaken belangrijk en moeten worden uitgevoerd zoals in figuur 1. Na intraperitoneale overgevoeligheid en luchtwegen OVA uitdaging inductie van luchtwegen allergische ontsteking bevestigen kunnen sommige muizen opgeofferd en histologische analyse worden uitgevoerd op de longcoupes zoals weergegeven in figuur 2. De aanwezigheid van ontstekingscellen kan worden bevestigd door Hematoxyline & Eosine kleuring (figuur 2A) en de aanwezigheid van slijm productie kan worden beoordeeld door Periodieke-zuur-Schiff vlek (figuur 2B). In totaal zal dit bevestigen inductie van de luchtwegen allergische ontsteking na OVA uitdaging van OVA-gesensibiliseerde muizen ^8. Daarentegen worden longcoupes van Saline behandelde muizen verwacht vrij van ontstekingen zijn samen met afwezigheid van slijmproductie. Bovendien zijn volgende uitdaging OVA-, long-DC's unde RGO rijping en de daaropvolgende migratie naar de drainerende lymfeklieren. Analyse van CD11c ⁺ cellen in de mediastinale lymfklieren (MLN) van muizen gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA zal naar verwachting een groter deel van de CD11c ⁺ cellen in vergelijking met zoutoplossing behandelde muizen (Figuur 3A) te laten zien. Bovendien is de analyse van absolute aantal cellen van CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ cellen in de MLN van OVA-gesensibiliseerde en uitgedaagd muizen, zal naar verwachting een significant hoger (dat wil zeggen verscheidene malen hoger) tellen dat de collega's van zoutoplossing behandelde muizen ( Figuur 3B).

Figuur 1. Experimenteel protocol voor de inductie van ovalbumine (OVA) geïnduceerde allergische luchtweginflammatie in muizen met luchtweg challenge met FITC gemerkte ovalbumine (OVA-FITC).

fig2.jpg "/>
Figuur 2. OVA overgevoeligheid gevolgd door OVA luchtwegen uitdaging leidt tot de inductie van de luchtwegen allergische ontsteking zoals door hematoxyline en eosine kleuring longcoupes weergegeven in (A) en leidt tot slijmproductie in de luchtwegen als geïdentificeerd door periodieke zuur Schiff kleuring long delen zoals in (B).

Figuur 3. OVA-FITC uitdaging induceert DC migratie van de longen naar de mediastinale lymfklieren (MLN). (A) Flowcytometrie percelen beeltenis van verhoudingen van CD11c ⁺ cellen in de MLN van controle of OVA-gesensibiliseerde muizen. (B) Absolute aantallen van CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ cellen in de MLN van zout of OVA-gesensibiliseerde muizen. * P <0,05. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

De hier gepresenteerde methode biedt een flowcytometrie gebaseerde benadering voor het analyseren van pulmonale DC's, gebaseerd op levering van de OVA-FITC voor de luchtwegen uitdaging. Hierdoor selectieve controle van de pulmonale DCs, die nemen OVA-FITC en dus de DC populaties, die worden bewaakt effectief degenen die in de luchtweg immuunrespons deel tijdens OVA-geïnduceerde allergische luchtweg. In controlemuizen, in afwezigheid van allergische luchtweginflammatie, het aantal trekkende DCs (OVA-FITC + DC) die in het MLN zijn indicatief Basaalsnelheid DC migratie, versnelt in reactie op allergische luchtweginflammatie resulteert in een aanzienlijke verhoging van de absolute telling van OVA-FITC + DC's in de MLN. De beschreven strategie biedt ten opzichte van traditionele immunohistochemische / immunokleuring benaderingen door analyse kan worden uitgevoerd in een kortere tijdsperiode en de efficiëntie / gevoeligheid veel hoger. Daarom is equally belangrijk dat goede controle zoals beschreven in de methoden worden gebruikt in stromingscytometrie analyse. Een andere parameter die kunnen de resultaten is het bereiden van een celsuspensie van de longen. Daarom moet worden gelet significante blootstelling van weefsels aan licht kan de fluorescentie van OVA-FITC en zorg beïnvloeden voorkomen moet worden gehouden tijdens enzymatische afbraak van de long dan vertering kan de splitsing van oppervlaktemerkers op cellen leiden dat invloed stroomafwaarts analyse. Alveolaire macrofagen en DC's hebben vergelijkbare sets van de oppervlakte markers, die verder compliceert de analyse van de pulmonale DC populaties ^9. Daarom is het van cruciaal belang om de longen te balans te alveolaire macrofagen die kunnen interfereren met DC-analyse te verwijderen.

Naast het onderzoek van pulmonale DC migratie bij allergische luchtweginflammatie kan de beschreven werkwijze mogelijk worden aangepast aan immuunrespons andere een beoortigens, waarbij specifieke antigenen kunnen worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof en intranasaal geleverd. Vervolgens gelijkaardige analyses zoals hierboven beschreven worden uitgevoerd om pulmonale DC te schatten. Indien antigeen niet mag worden vermeld, kan enkele uren voor antigeen levering FITC-dextran of CFSE worden geleverd muizen. Vervolgens na antigen aflevering, kan de analyse worden uitgevoerd om de migratie van FITC-dextran of CFSE gelabeld DCs de MLN die aangeeft de kinetiek van de pulmonale DC migratie na inoculatie met de specifieke antigeen ^10,11 volgen. In ons vorige werk, hebben we gebruikt deze strategie om de rijping / migratie van pulmonale DC's te beoordelen naar aanleiding van de levering van adenovirale gentherapie vectoren ^10. Omdat DC's zijn fagocytische, intranasale levering van FITC-dextran resulteert in een snelle opname door de longen DC's, die vervolgens kunnen worden gecontroleerd door flowcytometrie. In gevallen, waar de monitoring van pulmonale plasmacytoïde DCs gewenst is, moet CFSE zijn emploYed sinds plasmacytoïde DCs niet opname FITC-Dextran even efficiënt als andere pulmonale DC subsets ^10.

Al met al, de beschreven strategie biedt voordelen ten opzichte van andere traditionele benaderingen voor het biedt een kwantitatieve analyse van pulmonale DC rijping / migratie in de loop van luchtwegontsteking.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience