Analyse av Pulmonal dendrittiske celle modning og migrasjon under Allergisk Airway betennelse

Summary

Vi beskriver en strategi for å overvåke modning og migrasjon av lunge dendrittiske celler som reaksjon på ovalbumin i innstillingen av ovalbumin indusert allergisk Airway betennelse. Denne strategien kan endres for å vurdere migrasjon av pulmonale dendrittiske celler i innstillingene for infeksjon.

Abstract

Dendrittiske celler (DCS) er de sentrale aktørene som er involvert i initiering av adaptive immunresponsen ved å aktivere antigen-spesifikke T celler. Utviklingsland er til stede i perifere vev i steady state, men som svar på antigen stimulering, DCS ta opp antigenet og raskt vandrer til drenering lymfeknuter hvor de setter i gang T-celle respons mot antigen ^1,2. I tillegg, DCS også spille en nøkkelrolle i å initiere autoimmune samt allergisk immunrespons ^tre.

Utviklingsland spiller en vesentlig rolle både initiering av immunrespons og induksjon av toleranse i innstillingen av lunge miljø ^4. Lung miljø er i stor grad tolerogenic, på grunn av eksponering for stort utvalg av miljømessige antigener ^5. Men i enkelte individer er det en pause i toleranse, noe som fører til induksjon av allergi og astma. I denne studien, beskriver vi en strategi som kan brukes til å overvåke luftveiene DC modning og MIGrasjon i respons på antigen brukes for sensibilisering. Måling av luftveier DC modning og migrasjon åpner for vurdering av kinetikken av immunrespons i luftveiene allergisk betennelse og også bistår i å forstå omfanget av den påfølgende immunresponsen sammen med de underliggende mekanismene.

Vår strategi er basert på bruk av ovalbumin som allergifremkallende middel. Ovalbumin-indusert allergisk astma er en mye brukt modell for å reprodusere luftveiene eosinofili, lunge betennelse og forhøyede IgE funnet under astma ^6,7. Etter allergi, er mus utfordret av intranasal levering av FITC merket ovalbumin, som gir mulighet for spesifikk merking av luftveiene utviklingsland som opptak ovalbumin. Deretter bruker flere DC spesifikke markører, kan vi vurdere modningen av disse DCS og kan også vurdere sin vandring til de drenerende lymfeknutene ved å ansette flowcytometri.

Protocol

1. Sensibilisering av Mus med ovalbumin

1. Forbered en løsning av OVA (klasse V, Sigma, MO) i steril PBS i en konsentrasjon på 1 mg / ml (Løsningen kan oppbevares ved -80 ° C).
2. For å forberede OVA-Alum blandingen, ta Alum i et rør og legge OVA løsning i en dropwise mote mens virvling røret i forholdet 1:1. Rør blandingen i 30 minutter og bruk med en gang etter blanding.
3. Bruk en 1 ml sprøyte, injisere 0,2 ml av blandingen i musen bukhulen og gjenta injeksjon igjen etter 2 uker.

2. Intranasal Challenge of Mus med FITC Merket ovalbumin

1. 7 dager etter andre injeksjon av OVA-Alum, mus er klar for å bli utfordret intranasalt med OVA-FITC.
2. Forbered en løsning av OVA-FITC (Sigma) bruker sterile PBS i en konsentrasjon på 1 mg / ml og butikk i alikvoter ved -80 ° C.
3. Plasser en steril kompress på bunnen av en 50 ml falk tube og i en kjemisk hOOD, tilsett 5 ml Aerrane på gasbind. For å anesthetize mus, dirigere dyret inn i røret for ca 5-10 sekunder.
4. Hold bedøvet dyret i en oppreist posisjon og bruker sterile pipetter, 100 pipette mL av OVA-FITC løsning på de svelget av mus i en drop-klok måte.
5. Gjenta intranasal utfordring med OVA-FITC for de neste to dagene.

3. Utarbeidelse av encellede Suspensjon fra lungene og drenering lymfeknuter

1. Ofre musene med intraperitoneal injeksjon av Euthanyl.
2. For å redusere macrophage forurensning, noe som kan komplisere DC analyse, er lunge lavage utført. Slik lavage lungene, er mus tracheas kort eksponert og cannulated med et kateter og en sprøyte, med iskald PBS med 5 mM EDTA, er den nedre luftveier skylles 3 ganger for å fjerne celler fra alveolære områder.
3. Perfuse lungene med 10 ml PBS inneholder 10 U / ml Heparinn via høyre ventrikkel av hjertet, for å fjerne blod celler fra lunge blodkar. Utfør perfusions til lungene blir hvit, indikasjon på fjerning av de fleste blodceller. Dette er spesielt viktig å fjerne forurensende celler fra perifert blod.
4. Dissekere lungene ut og fjerne mediastinale lymfeknuter (MLN) og plasser lymfeknutene i en egen rett. (Prøv å minimere eksponering av vev til lys for å hindre dempe FITC fluorescens.)
5. Plasser lungene på en petriskål og kjøttdeig med saks. Neste fordøye lungene i 25 minutter ved 37 ° C ved hjelp av 250 U / ml collagenase D (Roche) og add EDTA (10 mM endelig konsentrasjon) for de neste 5 minutter å stoppe collagenase aktivitet.
6. Pass fragmenter av fordøyd lungene gjennom en 100 mikrometer celle sil og utføre hypoton lysis å fjerne erytrocytter. Singelen cellesuspensjonen er klar for videre analyse av utviklingsland.
7. For å forberede enkelt celle suspensjon fra MLN, tlette MLN hjelp fine nåler og fordøye med collagenase som beskrevet ovenfor etterfulgt av belastende gjennom en celle sil.

4. Farging for DC markører for å vurdere Modning / migrasjon

1. For å identifisere utviklingsland i lungene, er farging utført for CD11c og CD11b. Videre å vurdere for modning, er farging utført for CD86 og CD80, som er oppregulert som DCS gjennomgå modning. CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ celler i MLN er identifisert som lunge utviklingsland migrering fra lungene til MLN i respons til OVA luftveier utfordring.
2. Suspendere celler i en konsentrasjon på 10 x 10 ⁶ celler / ml i FACS buffer (PBS med 1% FBS og 1mm EDTA) og delmengde 150 mL av cellesuspensjon / rør for FACS farging. For identifisering av lunge DCS, følger flekker nødvendig: Unstained kontroll (lungeceller fra mus ikke er utsatt for OVA-FITC), OVA-FITC kontroll, CD11c enkel kontroll, CD11b enkel kontroll, CD11b⁺ CD11c ⁺ dobbel kontroll, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbel kontroll, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbel kontroll, MHC II enkel kontroll, CD86 enkel kontroll, CD80 enkel kontroll og prøver farget for OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ MHCII ⁺ , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ og OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. For å vurdere DC migrasjon, utføre absolutte celletall av singelen cellesuspensjon fra MLN og deretter utarbeide følgende rør: Unstained kontroll (mln celler fra mus ikke er utsatt for OVA-FITC), egg-FITC kontroll, CD11c ⁺ enkelt kontroll, CD11b ⁺ dobbel kontroll, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbel kontroll, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dobbel kontroll og CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ prøver.

5. Representative Resultater

De tidspunkter som kreves for intraperitoneal sensibilisering å indusere luftveiene allergisk betennelse er viktig og bør utføres som vist i Figur 1. Etter intraperitoneal sensibilisering og luftveier OVA utfordring, for å bekrefte induksjon av luftveiene allergisk betennelse, kan noen mus ofres og histologiske analyser kan utføres på de tette deler som vist i Figur 2. Tilstedeværelse av betennelsesceller kan bekreftes ved Hematoxylin og eosin flekken (figur 2A) og tilstedeværelse av slimproduksjon kan vurderes ved Periodic-syre-Schiff flekk (figur 2B). Til sammen vil dette bekrefte induksjon av luftveiene allergisk inflammasjon etter OVA utfordring OVA-sensibiliserte mus ^8. I kontrast er tette deler fra Saline behandlede mus forventes å være fri for enhver betennelse sammen med fravær av enhver slimproduksjon. Dessuten følgende OVA utfordring, pulmonal utviklingsland unde rgo modning og påfølgende migrasjon til drenering lymfeknuter. Analyse av CD11c ⁺ celler i mediastinale lymfeknuter (MLN) fra mus sensibiliserte og utfordret med OVA ventes å vise en høyere andel av CD11c ⁺ celler i forhold til saltvann-behandlede mus (figur 3A). Videre analyse av absolutt celletall på CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ celler i MLN av OVA-sensibiliserte og utfordret mus, er ventet å vise en signifikant høyere (dvs. flere ganger høyere) teller at kolleger fra saltvann behandlede mus ( Figur 3B).

Figur 1. Forsøksprotokoll for induksjon av ovalbumin (OVA) indusert allergisk Airway betennelse i mus sammen med luftveiene utfordring med FITC merket ovalbumin (OVA-FITC).

fig2.jpg "/>
Figur 2. OVA allergi etterfulgt av OVA luftveier utfordringen fører til induksjon av luftveiene allergisk betennelse som er identifisert av Hematoxylin & eosin farging av lunge seksjoner vises i (A) og også fører til slimproduksjon i luftveiene som er identifisert av Periodic Acid Schiff farging av lunge seksjoner som vist i (b).

Figur 3. OVA-FITC utfordring induserer DC migrasjon fra lungene til mediastinale lymfeknuter (MLN). (A) Flowcytometri plott som viser proporsjonene CD11c ⁺ celler i MLN av kontroll eller OVA-sensibiliserte mus. (B) Absolutte tellinger av CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ celler i MLN av saltvann eller OVA-sensitiv mus. * P <0,05. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Metoden som presenteres her tilbyr en flowcytometri tilnærming for å analysere lunge DCS, basert på leveranse av OVA-FITC for luftveier utfordring. Dette åpner for selektiv overvåkning av lunge DCS, som tar opp OVA-FITC og derfor DC populasjoner, som overvåkes er effektivt de som deltar i luftveiene immunrespons i løpet av OVA-indusert allergisk Airway betennelse. I kontroll mus, i fravær av allergisk luftveiene betennelse, antall trekkende DCS (OVA-FITC + DCS) identifisert i MLN er tegn på basaldoser av DC migrasjon, som akselererer i respons til allergiske luftveier betennelse fører til betydelig økning i absolutte antallet OVA-FITC + utviklingsland i MLN. Den beskrives strategi, tilbyr fordel fremfor tradisjonelle immunhistokjemiske / farging tilnærminger fordi analysen kan utføres i kortere tidsrom og effektiviteten / sensitiviteten er mye høyere. Derfor er det equally viktig å sikre at riktig kontroller som beskrevet i metodene er ansatt i løpet av flowcytometri analyse. Et annet parameter som kan påvirke resultatene er utarbeidelsen av én celle suspensjon fra lungene. Derfor må tas for å hindre en betydelig eksponering av vev for å tenne for det kan påvirke fluorescens av OVA-FITC og omsorg må også tas i løpet av enzymatisk fordøyelse av lunge i over fordøyelsen kan føre til spalting av overflaten markører på celler, som vil påvirke nedstrøms analyse. Alveolære makrofager og DCS dele lignende sett av overflaten markører, noe som ytterligere kompliserer analysen av pulmonale DC populasjoner ^9. Derfor er det avgjørende å lavage lungene for å fjerne alveolære makrofager som kan forstyrre DC analyse.

I tillegg til analysen av pulmonal DC migrasjon under allergisk luftveiene betennelse, kan det beskrevne metodikken være potensielt endres til å vurdere immunrespons andre entigens, der spesifikke antigener kan merkes med et fluorescerende fargestoff og levert intranasalt. Senere tilsvarende analyser som beskrevet ovenfor kan gjennomføres for å vurdere lunge DC respons. I tilfeller der antigen ikke kan merkes, kan noen timer før antigen levering, FITC-dekstran eller CFSE leveres til mus. Deretter, etter antigen levering, kan analyser utføres for å overvåke migrasjon av FITC-dekstran eller CFSE merket utviklingsland til MLN, noe som vil indikere kinetikken i pulmonal DC migrasjon etter vaksinasjon med antigen ^10,11. I vårt tidligere arbeid, har vi ansatt denne strategien for å vurdere modning / migrasjon av pulmonale utviklingsland som svar på levering av adenoviral genterapi vektorer ^10. Siden utviklingsland er phagocytic, intranasal levering av FITC-Dextran resulterer i rask opptak av lunge DCS, som deretter kan overvåkes av flowcytometri. I tilfeller hvor overvåking av pulmonal plasmacytoid utviklingsland er ønsket, bør CFSE være employed siden plasmacytoid utviklingsland gjør ikke opptak FITC-Dextran så effektivt som andre lunge DC undergrupper ^10.

Til sammen tilbyr beskrev strategien fordeler fremfor andre tradisjonelle tilnærminger for det gir en kvantitativ analyse av pulmonal DC modning / migrasjon i løpet av luftveiene betennelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience