Summary
Nós descrevemos uma estratégia para monitorar a maturação e migração de células dendríticas pulmonares em resposta à ovalbumina na configuração de ovalbumina inflamação das vias aéreas induzida alérgica. Esta estratégia pode ser modificado para avaliar a migração de células dendríticas pulmonares nas configurações de infecção.
Abstract
As células dendríticas (DCs) são os principais agentes envolvidos na iniciação da resposta imune adaptativa por ativação de células T antígeno-específicas. DCs estão presentes nos tecidos periféricos em estado estacionário, no entanto, em resposta à estimulação de antigénio, DCs assumir o antigénio e rapidamente migram para os nódulos linfáticos drenantes onde eles iniciam resposta de células T contra o antigénio 1,2. Além disso, DCs também desempenham um papel-chave na iniciação auto-imune, bem como alérgica resposta imunitária 3.
DCs desempenham um papel essencial em ambos iniciação da resposta imune e indução de tolerância na configuração do ambiente de pulmão 4. Ambiente de pulmão é em grande parte tolerogénico, devido à exposição a vasta gama de antigénios ambientais 5. No entanto, em alguns indivíduos, há um intervalo de tolerância, o que leva a indução de alergia e asma. Neste estudo, descrevemos uma estratégia, o que pode ser utilizado para monitorizar das vias aéreas maturação DC e MIGração em resposta ao antigénio utilizado para a sensibilização. A medição da via aérea maturação DC e migração permite a avaliação da cinética da resposta imune durante inflamação das vias aéreas alérgica e também auxilia na compreensão da magnitude da resposta imune subsequente, juntamente com os mecanismos subjacentes.
A nossa estratégia é baseada no uso de ovalbumina como um agente sensibilizante. Ovalbumina induzida asma alérgica é um modelo largamente utilizado para reproduzir a eosinofilia das vias aéreas, inflamação pulmonar e níveis elevados de IgE encontrados durante a asma 6,7. Após a sensibilização, os ratos são desafiados por administração intranasal de FITC ovalbumina rotulado, que permite a marcação específica de DCs das vias aéreas que ovalbumina absorção. Em seguida, usando vários marcadores específicos DC, podemos avaliar a maturação desses DCs e também pode avaliar a sua migração para os linfonodos de drenagem através do emprego de citometria de fluxo.
Protocol
1. Sensibilização de camundongos com ovalbumina
- Preparar uma solução de OVA (grau V; Sigma, MO) em PBS estéril a uma concentração de 1 mg / ml (solução pode ser armazenada a -80 ° C).
- A fim de preparar OVA Alum-mistura, toma Alum num tubo e adicionar solução de OVA em uma forma gota a gota, enquanto o tubo de vórtice em uma proporção de 1:1. Agita-se a mistura durante 30 minutos e utilizar imediatamente após a mistura.
- Utilizando uma seringa de 1 ml, 0,2 ml de injectar a mistura em rato cavidade peritoneal e repetir a injecção de novo depois de 2 semanas.
2. Desafio intranasal de camundongos com ovalbumina Identificada FITC
- 7 dias após a segunda injecção de OVA-Alum, os ratinhos estão prontos para serem desafiados intranasalmente com OVA-FITC.
- Preparar uma solução de OVA-FITC (Sigma) utilizando PBS estéril a uma concentração de 1 mg / ml e armazenar em alíquotas a -80 ° C.
- Colocar uma gaze estéril, na parte inferior de um tubo Falcon de 50 ml e em um h químicaood, adicionar 5 ml de Aerrane sobre a gaze. A fim de anestesiar ratinhos, dirigir o animal para dentro do tubo para segundo aproximadamente 5-10.
- Segurar o animal anestesiado em posição vertical e utilizando pontas de pipeta estéreis, Pipetar 100 da solução de OVA-FITC para as narinas de ratinhos de uma forma gota a gota,.
- Repita desafio intranasal com OVA-FITC para os próximos dois dias.
3. Preparação de uma única célula Suspensão dos pulmões e os linfonodos de drenagem
- Sacrificar os ratos usando injeção intraperitoneal de Euthanyl.
- A fim de reduzir a contaminação de macrófagos, que pode complicar análise DC, lavagem pulmonar é realizada. Para a lavagem dos pulmões, traqueias de rato são brevemente exposta e canulada com um cateter e uma seringa; usando PBS gelado com 5 mM de EDTA, o tracto respiratório inferior é enxaguado 3 vezes para remover as células dos espaços alveolares.
- Perfundir os pulmões com 10 ml de PBS contendo 10 U / ml heparem através do ventrículo direito do coração, para remover as células de sangue a partir da vasculatura do pulmão. Executar as perfusões até que os pulmões virar branco, indicativo de remoção da maior parte das células do sangue. Isto é especialmente importante para remover as células contaminantes a partir do sangue periférico.
- Dissecar os pulmões para fora e remover os gânglios linfáticos do mediastino (MLN) e coloque os linfonodos em um prato separado. (Tente minimizar a exposição dos tecidos à luz para evitar extinção de fluorescência FITC).
- Colocar os pulmões em uma placa de Petri e mediu utilizando uma tesoura. Em seguida digerir os pulmões durante 25 minutos a 37 ° C, utilizando 250 U / ml de colagenase D (Roche) e adicionar EDTA (10 mM de concentração final) para os próximos 5 minutos para parar a actividade da colagenase.
- Passar os fragmentos digeridos de pulmões através de um filtro de células de 100 um e realizar a lise hipotónico para remover eritrócitos. A suspensão de células única está pronto para posterior análise de DCs.
- A fim de preparar a suspensão de célula única a partir do MLN, taliviar a MLN utilizando agulhas finas e digerir com colagenase tal como descrito acima, seguido por esforço através de um filtro de célula.
4. A coloração para DC Marcadores para Avaliar a maturação / migração
- A fim de identificar DCs nos pulmões, a coloração é realizada para CD11c e CD11b. Além disso para avaliar a maturação, a coloração é realizada para CD86 e CD80, que são upregulated como DCS sofrer maturação. CD11c + CD11b + células OVA-FITC + no MLN são identificados como DCs pulmonares migratórias dos pulmões para o MLN em resposta ao desafio das vias aéreas OVA.
- Suspender as células a uma concentração de 10 x 10 6 células / ml em tampão FACS (PBS com 1% de FBS e EDTA 1 mM) e uL aliquota de suspensão de células 150 / tubo para a coloração de FACS. Para a identificação dos DCs de pulmão, manchas seguintes são necessários: controle corado (células pulmonares de camundongos não expostos à OVA-FITC), controle de OVA-FITC, controle de CD11c único, controle de CD11b único, CD11b+ CD11c + duplo controlo, CD11b + OVA-FITC + controle duplo, controle de CD11c + OVA-FITC + dupla, MHC II único controle, CD86 único controle, CD80 único controle e amostras coradas para OVA-FITC + CD11c + CD11b + + MHCII , OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD86 + e OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD80 +.
- Para avaliar a migração DC, realizar a contagem de células absolutos da suspensão de células única a partir de MLN e, subsequentemente, preparar os tubos seguintes: controlo não corado (células MLN de ratinhos não expostos à OVA-FITC), OVA-FITC de controlo, CD11c + controlo único, CD11b + de duplo controlo, CD11b + OVA-FITC + duplo controle, CD11c + OVA-FITC + duplo controle e CD11c + CD11b + de amostras OVA-FITC A +.
5. Os resultados representativos
Os pontos de tempo necessários para a sensibilização intraperitoneal para induzir a inflamação das vias aéreas alérgica é importante e deve ser realizada como descrito na Figura 1. Após sensibilização intraperitoneal e desafio com OVA das vias aéreas, para confirmar a indução da inflamação das vias aéreas alérgica, alguns ratinhos pode ser sacrificado e as análises histológicas pode ser efectuada nas secções de pulmão como mostrado na Figura 2. Presença de células inflamatórias pode ser confirmada por hematoxilina e eosina (Figura 2A) e presença de produção de muco pode ser avaliada por ácido periódico de Schiff-mancha (Figura 2B). No conjunto, este irá confirmar a indução de inflamação das vias aéreas alérgica após o desafio com OVA de OVA-sensibilizados ratos 8. Em contraste, as secções de pulmão a partir de ratinhos tratados com solução salina são esperados para estar livre de qualquer inflamação, juntamente com a ausência de qualquer produção de muco. Além disso, o desafio com OVA seguinte, pulmonar DCs unde RGO maturação e posterior migração para os linfonodos de drenagem. Análise de CD11c + células dos nodos linfáticos mediastinal (MLN) de ratinhos sensibilizados e desafiados com OVA é esperado para mostrar uma maior proporção de células CD11c + em comparação com ratinhos tratados com solução salina (Figura 3A). Além disso, a análise da contagem de células absoluta de CD11c + CD11b + de OVA-FITC + de células no MLN de ratinhos OVA-sensibilizadas e desafiados, espera-se que mostram uma significativamente maior (isto é, várias vezes superior) de contagem que os homólogos de salinas ratinhos tratados ( A Figura 3B).
Figura 1. Protocolo experimental para a indução de ovalbumina (OVA) a inflamação das vias aéreas induzida em ratinhos alérgica, juntamente com desafio das vias aéreas com FITC ovalbumina rotulada (OVA-FITC).
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Figura 2. Sensibilização OVA seguido por desafio das vias aéreas OVA conduz a indução de inflamação das vias aéreas alérgica como identificado por hematoxilina e eosina coloração de secções de pulmão mostrados em (A) e conduz também à produção de muco nas vias aéreas tal como identificado por coloração pelo ácido periódico de Schiff de pulmão secções como mostrado em (B).
Figura 3. OVA-FITC desafio induz DC migração dos pulmões para os gânglios linfáticos do mediastino (MLN). (A) parcelas de citometria de fluxo que descreve proporções de CD11c + células no MLN de controlo ou de OVA-sensibilizadas ratinhos. (B) As contagens absolutas de CD11c + CD11b + células OVA-FITC + no MLN de ratos salina ou OVA-sensibilizados. * P <0,05. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
O método aqui apresentado oferece uma abordagem baseada em citometria de fluxo para análise de DCs pulmonares, com base na entrega de OVA-FITC para o desafio da via aérea. Isto permite a monitorização selectiva de DCs pulmonares, que ocupam OVA-FITC e, portanto, as populações de CC, que são acompanhados são efectivamente as que participam na resposta das vias aéreas imune durante o curso de OVA induzida por inflamação das vias aéreas alérgica. Em ratinhos de controlo, na ausência de inflamação das vias aéreas alérgica, os números de DCs migratórias (OVA-FITC + DCs), identificadas no MLN são indicativos de taxas basais de DC migração, o que acelera em resposta à inflamação alérgica das vias aéreas, resultando em aumento significativo na contagem absoluta de OVA-FITC + DCS no MLN. A estratégia descrita, oferece vantagens sobre os tradicionais imunohistoquímicos / imunocoloração abordagens baseadas porque a análise pode ser realizada em curto período de tempo ea eficiência / sensibilidade é muito maior. Por isso, é e-qually importante para assegurar que os controlos apropriados, conforme descrito nos métodos são empregadas durante a análise de citometria de fluxo. Outro parâmetro que pode afectar os resultados é a preparação de suspensão de células individuais a partir do pulmão. Assim deve ser tomado cuidado para evitar a exposição significativa do tecido à luz por isso pode afectar a fluorescência de OVA-FITC e cuidados também devem ser tomadas durante a digestão enzimática do pulmão para a digestão durante pode levar a clivagem de marcadores de superfície em células, a qual afetará análise a jusante. Macrófagos alveolares e DCs partilhar conjuntos semelhantes de marcadores de superfície, o que complica ainda mais a análise de populações pulmonares DC 9. Por isso, é crucial para a lavagem dos pulmões para remover os macrófagos alveolares que podem interferir com a análise de DC.
Além da análise da migração DC pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas, a metodologia descrita pode ser potencialmente modificada para avaliar a resposta imune a um outrotigens, segundo o qual antigénios específicos podem ser marcados com um corante fluorescente e entregues por via intranasal. Subsequentemente análises semelhantes, como descrito acima pode ser realizada para avaliar a resposta DC pulmonar. Nos casos em que o antigénio não podem ser rotulados, poucas horas antes da entrega de antigénio, FITC-dextrano ou CFSE podem ser entregues aos ratinhos. Subsequentemente, após a entrega de antigénio, a análise pode ser realizada para monitorar a migração de FITC-dextrano ou CFSE rotulado DCs ao MLN, que irá indicar a cinética da migração DC pulmonar após a inoculação com o antigénio específico 10,11. Em nosso trabalho anterior, nós empregamos essa estratégia para avaliar a maturação / migração de DCs pulmonares em resposta a entrega de vetores de genes adenovirais terapia 10. Uma vez que DCs são a entrega, fagocítica intranasal de FITC-dextran resulta em absorção rápida pela DCS pulmonares, que pode então ser monitorizadas por citometria de fluxo. Em casos, quando a monitorização de pulmonar plasmocitóides DCs for desejado, CFSE deve ser employed desde DCs plasmocitóide não fazer captação de FITC-Dextran tão eficiente quanto outros subconjuntos DC pulmonares 10.
No conjunto, a estratégia descrita oferece vantagens sobre outras abordagens tradicionais para que ele oferece uma análise quantitativa de maturação pulmonar DC / migração durante o curso da inflamação das vias aéreas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações CIHR e CF Canadá ao Dr. Jim Hu e por uma bolsa de estudo de doutorado concedida para Rahul Kushwah pela CF Canadá.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
Alum | Thermo Scientific | 77161 | |
OVA-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Antibodies | e-Bioscience |
References
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