Analys av Pulmonell mognad av dendritiska celler och migration under Allergisk luftvägsinflammation

Summary

Vi beskriver en strategi för att övervaka mognad och migration av pulmonella dendritiska celler som svar på ovalbumin i inställningen av ovalbumin-inducerad allergisk inflammation i luftvägarna. Denna strategi kan ändras för att bedöma migration av pulmonell dendritiska celler i inställningarna för infektion.

Abstract

Dendritiska celler (DC) är de viktigaste aktörerna inom initiering av adaptiva immunsvaret genom att aktivera antigen-specifika T-celler. DC: er är närvarande i perifera vävnader i stationärt tillstånd, men som svar på antigen stimulering, DC: er tar upp antigenet och snabbt migrera till de dränerande lymfkörtlarna där de initierar T-cellsvar mot antigenet ^1,2. Dessutom utvecklingsländer spelar också en viktig roll i att initiera autoimmun samt allergiska immunsvar ^3.

DC spelar en viktig roll i både initiering av immunsvar och induktion av tolerans i fastställandet av lungan miljön ^4. Lung miljön är i stort sett tolerogena, på grund av exponering för stora utbud av miljö-antigener ^5. Emellertid, i vissa individer finns ett brott i tolerans, vilket leder till induktion av allergi och astma. I denna studie beskriver vi en strategi som kan användas för att övervaka luftvägarna DC mognad och MIGranson som svar på antigen som används för sensibilisering. Mätning av luftvägarna DC mognad och migration möjliggör en bedömning av kinetiken av immunsvaret under luftvägarna allergisk inflammation och även hjälper till att förstå omfattningen av den efterföljande immunsvaret tillsammans med de bakomliggande mekanismerna.

Vår strategi är baserad på användningen av ovalbumin som en sensibiliserande agent. Ovalbumin-inducerad allergisk astma är en allmänt använd modell för att återskapa luftvägarna eosinofili, lunginflammation och förhöjda IgE-nivåer som konstaterades under astma ^6,7. Efter sensibilisering, möss utmanas av intranasal leverans av FITC-märkt ovalbumin, vilket möjliggör för specifik märkning av luftvägarna utvecklingsländer som upptag ovalbumin. Därefter använder flera DC specifika markörer, kan vi utvärdera mognaden hos dessa DCs och kan också utvärdera deras migrering till de dränerande lymfkörtlarna genom användning av flödescytometri.

Protocol

1. Sensibilisering av möss med ovalbumin

1. Framställ en lösning av OVA (kvalitet V, Sigma, MO) i steril PBS vid en koncentration av 1 mg / ml (kan lösningen lagras vid -80 ° C).
2. För att förbereda OVA-alun blandning, ta Alun i ett rör och tillsätt OVA-lösning på ett droppvis sätt under rotation av röret vid ett förhållande av 1:1. Rör om blandningen under 30 minuter och använd omedelbart efter blandning.
3. Användning av en 1 ml spruta, injicera 0,2 ml av blandningen in i mus peritonealhålan och upprepa injektionen igen efter 2 veckor.

2. Intranasal Challenge of Möss med FITC-märkt Ovalbumin

1. 7 dagar efter den andra injektionen av OVA-alun, möss är redo att utmanades intranasalt med OVA-FITC.
2. Framställ en lösning av OVA-FITC (Sigma) med användning av steril PBS vid en koncentration av 1 mg / ml och förvara i alikvoter vid -80 ° C.
3. Placera en steril gasväv vid botten av en 50 ml Falcon-rör och i en kemisk hOOD, tillsätt 5 ml Aerrane på gasväv. För att bedöva möss, styra djuret in i röret för cirka 5-10 sekunder.
4. Hålla bedövades djuret i en upprätt position och med användning av sterila pipettspetsar, pipett 100 pl av OVA-FITC-lösning på näsborrarna hos möss i en droppvis sätt.
5. Upprepa intranasal utmaning med OVA-FITC under de kommande två dagarna.

3. Framställning av enkelcellsuspension från lungorna och de dränerande lymfkörtlarna

1. Offra mössen med intraperitoneal injektion av Euthanyl.
2. För att minska makrofag kontaminering, vilket kan komplicera DC-analys, är lungsköljning utförs. Att skölja lungorna, är mus trakea kortfattat exponeras och kanyleras med en kateter och en spruta, med användning av iskall PBS med 5 mM EDTA, är de nedre luftvägarna sköljdes 3 gånger för att avlägsna celler från de alveolära utrymmena.
3. Perfundera lungorna med 10 ml PBS innehållande 10 U / ml Hepari via den högra ventrikeln av hjärtat, för att avlägsna blodkroppar från lunga vaskulaturen. Utför perfusioner tills lungorna blir vita, vilket indikerar att avlägsna de flesta av blodkroppar. Detta är speciellt viktigt för att avlägsna kontaminerande celler från perifert blod.
4. Dissekera lungorna ut och ta bort mediastinum lymfkörtlar (MLN) och placera lymfkörtlarna i en separat skål. (Försök att minimera exponeringen av vävnader för ljus för att förhindra utsläckning av FITC-fluorescens).
5. Placera lungorna på en petriskål och finhacka med sax. Nästa smälta lungorna under 25 minuter vid 37 ° C med användning av 250 U / ml kollagenas D (Roche) och tillsätt EDTA (10 mM slutlig koncentration) under de nästa 5 minuter för att stoppa kollagenasaktivitet.
6. Passera fragmenten av digererat lungorna genom en 100 | im cellfilter och utför hypoton lys för att avlägsna erytrocyter. Den enda cellsuspension är klar för ytterligare analys av DC: er.
7. För att förbereda enkelcellsuspension från MLN, tunderlätta MLN användning av fina nålar och smälta med kollagenas, såsom beskrivits ovan följt av sträckning genom en cellfilter.

4. Färgning för DC Markers att utvärdera Mognad / migration

1. För att identifiera utvecklingsländer i lungorna, är färgning utförs för CD11c och CD11b. Dessutom att bedöma för mognad, är färgning utförs för CD86 och CD80, som uppregleras exempelvis DCS genomgår mognad. CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ celler i MLN identifieras som pulmonella DC migrerar från lungorna till MLN som svar på OVA luftvägarna utmaning.
2. Suspendera cellerna i en koncentration av 10 x 10 ⁶ celler / ml i FACS-buffert (PBS med 1% FBS och 1 mM EDTA) och alikvot 150 pl av cellsuspensionen / rör för FACS-färgning. För identifiering av lung DCS, följer fläckar behövs: Obehandlat kontroll (lungceller från möss som inte utsatts för OVA-FITC), OVA-FITC kontroll, CD11c enda kontroll, CD11b enda kontroll, CD11b⁺ CD11c ⁺ dubbla kontroller, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbla kontroller, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbla kontroller, MHC II enda kontroll, CD86 enda kontroll, CD80 enda kontroll och prov färgades för OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ MHCII ⁺ , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ och OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. För att bedöma DC migration, utföra absoluta celltal för den inre cellsuspensionen från MLN och därefter förbereda följande rör: Obehandlat kontroll (MLN celler från möss som inte utsatts för OVA-FITC), ägg-FITC kontroll, CD11c ⁺ enstaka kontroll, CD11b ⁺ dubbla kontroller, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbla kontroller, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ dubbel kontroll och CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC prover ^+.

5. Representativa resultat

De tidpunkter som krävs för intraperitoneal sensibilisering för att inducera luftvägarna allergisk inflammation är viktigt och bör utföras såsom visas i figur 1. Efter intraperitoneal sensibilisering och luftvägarna OVA utmaning, för att bekräfta induktion av luftvägarna allergisk inflammation, kan vissa möss offras och histologiska analyser kan utföras på lungsektioner som visas i figur 2. Förekomst av inflammatoriska celler kan bekräftas genom Hematoxylin & Eosin fläcken (figur 2A) och närvaro av slemframställning kan bedömas genom periodiska-syra-Schiff-färgning (figur 2B). Sammantaget bekräftar induktion av luftvägarna allergisk inflammation efter OVA utmaning OVA-sensibiliserade möss ^8. I motsats härtill är lungsektioner från salin-behandlade möss bedöms vara fri från någon inflammation tillsammans med avsaknad av slemproduktion. Dessutom, efter OVA utmaning, pulmonell utvecklingsländer unde rgo mognad och efterföljande migration till de dränerande lymfkörtlarna. Analys av CD11c ⁺ celler i mediastinum lymfkörtlar (MLN) från möss sensibiliserade och utmanades med OVA förväntas uppvisa en högre andel av CD11c ⁺ celler jämfört med salinbehandlade möss (figur 3A). Dessutom, ⁺ OVA-FITC ⁺ celler i MLN av OVA-sensibiliserade och utmanade möss analys av absoluta celler på CD11c ⁺ CD11b, förväntas visa ett betydligt högre (dvs. flera gånger högre) räknas att de kolleger från saltlösning behandlade möss ( Figur 3B).

Figur 1. Försöksprotokoll för induktion av ovalbumin (OVA) inducerad allergisk inflammation i luftvägarna i möss tillsammans med luftvägen utmaning med FITC-märkt ovalbumin (OVA-FITC).

fig2.jpg "/>
Figur 2. OVA sensibilisering följt av OVA luftvägarna utmaning leder till induktion av luftvägarna allergisk inflammation som identifierats av Hematoxylin & Eosin färgning av lungsektioner visas i (A) och även leder till slemproduktion i luftvägarna som identifierats av perjodsyra Schiff färgning av lung sektioner, såsom visas i (B).

Figur 3. OVA-FITC utmaning inducerar DC migration från lungorna till mediastinala lymfkörtlar (MLN). (A) Flow Cytometry plottar som avbildar proportioner av CD11c ⁺ celler i MLN av kontroll-eller OVA-sensibiliserade möss. (B) Absoluta pulser av CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ celler i MLN av saltlösning eller OVA-sensibiliserade möss. * P <0,05. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Metoden som presenteras här har en flödescytometri metod för att analysera lung utvecklingsländer, baserat på leverans av OVA-FITC för luftvägarna utmaning. Detta tillåter selektiv kontroll av pulmonella DCS, vilka tar upp OVA-FITC och därför är de DC populationer, som övervakas är ett effektivt de som deltar i luftvägarna immunsvar under loppet av OVA-inducerad allergisk inflammation i luftvägarna. I kontrollmöss, i avsaknad av allergiska inflammationen i luftvägarna, antalet flyttande DCS (OVA-FITC + DC) som anges i MLN tyder på basala andelen DC migration, som accelererar till följd av allergiska luftvägsinflammation leder till betydande ökning av absoluta räkningen av OVA-FITC + DC i MLN. Den beskrivna strategin, har fördelar jämfört med traditionella immunhistokemiska / immunfärgning strategier eftersom analys kan utföras i kortare tidsperiod och effektiviteten / känslighet är mycket högre. Därför är det equally viktigt att säkerställa att korrekta kontroller som beskrivits i sätten används under flödescytometrianalys. En annan parameter som kan påverka resultaten är framställningen av enkelcellsuspension från lungan. Följaktligen måste man vara försiktig för att förhindra signifikant exponering av vävnaden för ljus under det kan påverka den fluorescens av OVA-FITC och försiktighet måste också tas under enzymatisk digerering av lungan för över-digerering kan leda till spjälkning av ytmarkörer på celler, som kommer att påverka nedströms analys. Alveolära makrofager och DCS har liknande uppsättningar av ytmarkörer, vilket ytterligare komplicerar analysen av pulmonella DC populationer ^9. Därför är det avgörande att skölja lungorna för att avlägsna alveolära makrofager som kan interferera med DC-analys.

Utöver analysen av pulmonell DC migration under allergisk inflammation i luftvägarna, kan den beskrivna metoden kan eventuellt modifieras för att bedöma immunsvar mot andra entigens, varigenom specifika antigener kan märkas med en fluorescerande färg och levereras intranasalt. Därefter liknande analyser som beskrivits ovan kan genomföras för att bedöma pulmonell DC svar. I de fall där antigenet inte kan märkas, kan få timmar före avgivande av antigen, FITC-dextran eller CFSE levereras till möss. Därefter, efter antigen leverans kan analys utföras för att kontrollera migration av FITC-dextran eller CFSE märkta DC till MLN, vilket indikerar kinetiken av pulmonell DC migration efter ympning med den specifika antigenen ^10,11. I vårt tidigare arbete, har vi använde denna strategi för att bedöma mognaden / migration av pulmonella DC som svar på leverans av adenovirusvektorer genterapi ^10. Eftersom DC är fagocytiska, intranasal avgivning av FITC-Dextran resulterar i snabb upptagning av pulmonell DCS, vilket sedan kan övervakas genom flödescytometri. I fall, där kontroll av pulmonell plasmacytoid DC önskas bör vara CFSE arbetstagarledoch reda sedan plasmacytoid DC inte upptag FITC-Dextran så effektivt som andra lung underuppsättningar DC ^10.

Sammantaget erbjuder den beskrivna strategin fördelar jämfört med andra traditionella metoder för det ger en kvantitativ analys av pulmonell DC mognad / migration under luftvägsinflammation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience